全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月 273
转反义 trxs基因对小麦种子萌发过程中淀粉水解酶的影响
郭红祥，尹钧 *，任江萍，王振云
河南农业大学农学院，国家小麦工程技术研究中心，郑州 450002
提要：检测转反义 trxs基因小麦种子萌发过程中胚乳内α-淀粉酶、β-淀粉酶和支链淀粉酶活性变化的结果表明，在种子
萌发4 d内，转基因小麦3种酶的活性态酶活性均低于野生型小麦，而3种酶的抑制态酶活性则均高于野生型小麦，转基
因小麦淀粉酶的抑制程度高于野生型小麦，这可能是转基因小麦酶活性降低的原因之一。
关键词：小麦；反义 trxs基因；萌发；淀粉酶
Effects of Antisense trxs on Starch Hydrolases of Wheat (Triticum aestivum
L.) Seeds in Germination
GUO Hong-Xiang, YIN Jun*, REN Jiang-Ping, WANG Zhen-Yun
National Engineering Research Center for Wheat, Department of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,
China
Abstract: To clarify the mechanism of germination of transgenic wheat seeds with antisense trxs gene, the
activities of α-amylase, β-amylase and amylopectase in wheat endosperm were determined during the germina-
tion of wheat seeds. The activity of the activated enzyme of the three enzymes in transgenic wheat seeds was
lower than that in wild-type wheat ones, and the activity of the inhibited enzyme of the three enzymes in
transgenic wheat seeds was higher than that in wild-type wheat ones. These results indicate that the higher
inhibition of the enzymes is one of the important reasons that the activity of the enzymes in transgenic wheat
seeds is lower.
Key words: wheat; antisense trxs; germination; amylase
收稿 2006-12-26 修定 　2007-02-25
资助 国家自然科学基金(30370877)和国家粮食丰产科技工程
河南课题(20 06BAD 02A0 7)。
* 通讯作者(E-ma i l：xmzxyj@1 2 6 .com；T el：0 3 7 1 -
6 3 5 5 8 2 0 3 )。
硫氧还蛋白 h (thioredoxin h，trxh)是广泛存
在于生物体内的多功能活性蛋白——硫氧还蛋白
(thioredoxin，trx)中的一种，它通过还原靶蛋白
中的二硫键参与酶活性调节、抗胁迫、信号转导
等生命活动过程。源于虉草(Phalaris coerulescens)
的 trxs基因(thioredoxins，trxs)和小麦硫氧还蛋白
h基因(thioredoxin h，trxh)同属于硫氧还蛋白基因
家族，它们的 cDNA有 94%的同源性，表达产物
也有相似的生物功能(刘雷等 2004)。转 trxs基因
的大麦中硫氧还蛋白 h高表达，可提高种子淀粉
酶和支链淀粉酶活性，从而促进种子萌发(Wong
等 2002；尹钧等 2006)。另外，小麦穗发芽一
直是农业生产中的灾害性问题，如果将反义硫氧
还蛋白 h基因转入小麦，降低种子淀粉酶和支链
淀粉酶活性，即可达到抑制种子萌发的目的。我
们实验室曾采用基因枪法将反义 trxs基因导入小
麦，并获得可稳定遗传的小麦，其种子中的 trxh
表达量、代谢类蛋白的含量、水溶蛋白和醇溶蛋
白的还原状态均低于野生型小麦；通过模拟降雨
抗穗发芽试验，证实转基因株系具有很强的抗穗
发芽能力(刘雷等 2004；周苏玫等 2006a，b；Guo
等 2007)。为了使转反义 trxs基因小麦能在农业生
产中得到广泛应用和进一步阐明小麦种子萌发过
程，本文对反义 trxs基因对小麦种子淀粉酶和支
链淀粉酶活性的抑制作了检测，以期为揭示转反
义 trxs基因小麦的抗穗发芽机制提供参考。
材料与方法
以转反义 trxs基因小麦(Triticum aestivum L.)
品种‘豫麦 1 8’和对照(‘豫麦 1 8’)为实验材
料。将小麦种子消毒和浸泡处理后进行发芽实验
植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月274
(刘雷等 2004)，分别于浸泡处理后于 0、1、2、
3和 4 d取样。
转基因小麦植株 PCR鉴定时，取长势良好的
转基因植株和未转化植株叶片，采用 CTAB法提
取总DNA。以反义 trxs基因设计特异引物进行扩
增。上游引物 I：5-GAACCTGTGCTGGATCCA-
GAGCTG-3；下游引物 II：5-CCAAGTTCTGT-
GCCAGCCATGC-3 (上海生物工程公司合成)，扩
增产物片段大小为 474 bp。20 µL PCR扩增体系
中含有 2.0 µL 10×扩增缓冲液(500 mmol·L-1 KCl，
15 mmol·L-1 MgCl2，100 mmol·L-1 pH 8.3 Tris-
HCl)，1.2 µL 2.5 µmol·L-1 dNTP，4 µmol·L-1引物
I、II各 1.0 µL，1.0 µL模板DNA (250 ng·µL-1)，
0.2 µL Taq DNA聚合酶，13.6 µL无菌水。反应
在 Biometra T3000 Thermocycler PCR扩增仪上进
行。扩增程序为：95 ℃预变性 3 min；94 ℃ 30
s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，3个循环；94 ℃
30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；
72 ℃延伸 7 min，4 ℃保温。PCR扩增产物经
1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，检测分为空白(水)、
转基因植株、阴性对照(野生型‘豫麦 18’植株)
和阳性对照(含有反义 trxs基因质粒) 4部分。
α-淀粉酶与 β-淀粉酶活性测定时，将小麦
种子在液氮研磨，称重，按 1:100 (W/V)加入提
取液(活性态酶提取液：蒸馏水；总酶提取液：
10 mmol·L-1 DTT)提取淀粉酶，室温放置 20 min，
3 000×g离心 10 min，上清液为酶液。每个样品
重复测定 3次。α-淀粉酶与 β-淀粉酶活性测定参
照陈毓荃(2002)书中方法。
支链淀粉酶活性测定时，小麦种子在液氮研
磨，称重，按 1:4 (W/V)加入提取液(活性态酶提
取液：0.1 mol·L-1 pH 7.2磷酸缓冲液；总酶提取
液：0.1 mol·L-1 pH 7.2磷酸缓冲液，内含 10
mmol·L-1 DTT)提取支链淀粉酶，置 4 ℃浸泡过
夜，10 000×g离心 15 min，上清液为酶液。活
性测定参照 Iwaki 和 Fuwa (1981)方法。
抑制态酶活性 =总酶活性 - 活性态酶活性；
抑制程度 =抑制态酶活性 /总酶活性 ×100。
实验结果
1 转反义 trxs基因小麦植株PCR检测
用设计的特异引物I和II进行转基因小麦植株
叶片DNA的PCR检测，检测结果如图 1所示。在
阴性对照(野生型小麦植株)和空白(水)中没有扩增
出目的片断，在 1~10的转基因小麦植株中扩增出
与阳性对照(质粒)大小相同的 474 bp的目的片段，
可确定为转基因阳性植株。
图 1 PCR检测
Fig.1 PCR amplification
　　1 ~ 1 0：转基因小麦；1 1：阴性对照；1 2：阳性对照；
1 3：空白(水 )；M：D N A 分子量标准。
2 转反义 trxs基因对 α-淀粉酶活性的影响
图 2显示，在种子萌发过程中，转基因和野
生型小麦 α- 淀粉酶总活性均呈现逐渐增加的趋
势，在萌发处理 3 d期间，野生型小麦 α- 淀粉
酶总活性均显著高于转基因小麦(P<0.05)，而在
萌发 4 d时差异不显著。转基因和野生型小麦活
性态 α-淀粉酶活性呈现逐渐增加的趋势，但转基
因小麦从浸泡处理第 3天时才明显上升，而野生
图 2 转反义 trxs基因对 α-淀粉酶活性的影响
Fig.2 Effects of antisense trxs gene on the activity
of α-amylase
　　Y、Y 1、Y 2、Y 3 和 Y 4 分别表示野生型‘豫麦 1 8’种
子浸泡处理后 0、1、2、3 和 4 d 时的样品，T、T 1、T 2、
T 3 和 T 4 分别表示转基因‘豫麦 1 8’种子浸泡处理后 0、1、
2、3 和 4 d 时的样品。下图同此。
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型小麦从浸泡处理开始就明显增加。野生型小麦
活性态 α-淀粉酶活性始终显著高于转基因小麦
(P<0.05)。转基因小麦抑制态 α-淀粉酶活性显著
高于野生型小麦(P<0.05)，表 1结果显示转基因小
麦内α-淀粉酶的抑制程度高于野生型小麦，并且
在萌发处理 2~4 d时达到显著水平，而在萌发 0和
1 d时未达到显著水平。
3 转反义 trxs基因对 β-淀粉酶活性的影响
图 3显示，在种子萌发过程中，转基因和野
生型小麦 β - 淀粉酶总活性均呈现逐渐增加的趋
势，在萌发处理 2~4 d时，野生型小麦 β - 淀粉
酶总活性显著高于转基因小麦(P<0.05)，而在萌
发 0和 1 d时差异未达到显著水平。转基因和野生
型小麦活性态 β - 淀粉酶活性呈现逐渐增加的趋
势，但野生型小麦上升较快。野生型小麦活性态
β-淀粉酶活性始终高于转基因小麦，且在萌发处
理 2~4 d时，野生型小麦活性态 β-淀粉酶活性显
著高于转基因小麦(P<0.05)，而在萌发 0和 1 d时
未达到显著水平。转基因小麦抑制态 β-淀粉酶活
性高于野生型小麦，表 1显示在转基因小麦内 β-
淀粉酶的抑制程度显著高于野生型小麦。
4 转反义 trxs基因对支链淀粉酶活性的影响
图 4显示，在种子萌发过程中，转基因和野
生型小麦支链淀粉酶总活性均呈现逐渐增加的趋
势，但转基因小麦增加较慢。野生型小麦支链淀
粉酶总活性高于转基因小麦，从萌发处理 2 d时
开始达到显著水平(P<0.05)。转基因和野生型小
麦活性态支链淀粉酶活性呈现逐渐增加的趋势，
但野生型小麦增加较快，野生型小麦活性态支链
淀粉酶活性始终显著高于转基因小麦(P<0.05)。
转基因小麦抑制态支链淀粉酶活性高于野生型小
麦，表 1显示在转基因小麦内支链淀粉酶的抑制
程度高于野生型小麦，并且在萌发处理 1~4 d时
达到显著水平。
表 1 转反义 trxs基因对 α-淀粉酶、β -淀粉酶和支链淀粉酶的抑制程度
Table 1 Effects of antisense trxs gene on the inhibitions of α-amylase, β-amylase and amylopectase

处理时间 /d
α-淀粉酶 /% β-淀粉酶 /% 支链淀粉酶 /%
　　　　　　　　　 野生型小麦 转基因小麦 野生型小麦 转基因小麦 野生型小麦 转基因小麦
0 5.57 6.31 2.26 3.67* 8.06 8.91
1 7.18 7.41 2.92 6.07* 6.92 8.45*
2 5.23 14.48* 3.35 6.80* 4.78 6.80**
3 4.59 14.29** 3.59 8.28* 1.22 4.19*
4 3.94 12.25** 2.41 6.40** 0.34 2.80*
　　*和 **分别表示在 0.05 和 0.01 水平显著。
图 3 转反义 trxs基因对 β-淀粉酶活性的影响
Fig.3 Effects of antisense trxs gene on the activity
of β-amylase
图 4 转反义 trxs基因对支链淀粉酶活性的影响
Fig.4 Effects of antisense trxs gene on the activity
of amylopectase
植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月276
讨　　论
淀粉是小麦种子中的一种储存物质，在种子
萌发和幼苗生长过程中淀粉降解提供碳源和能量。
α-淀粉酶(α-AMY)、β-淀粉酶(β-AMY)和支链淀
粉酶(amylopectase)是影响淀粉水解的 3种酶，本
文结果显示，在转基因小麦中这 3种酶的活性都
受到抑制，因而种子萌发过程中的淀粉降解速度
慢，种子萌发也较慢。
在这 3种淀粉降解酶中，转基因与野生型小
麦 α-淀粉酶总酶活性在萌发处理 1 d时就出现较
大差异，β-淀粉酶总酶活性在萌发处理 2 d时出
现较大差异，而支链淀粉酶总酶活性的差异较
小，因此认为，α - 淀粉酶在小麦种子萌发过程
中的作用似乎最重要。
在转反义 trxs基因小麦种子内 trxh含量低(刘
雷等 2004)，以致 3种淀粉降解酶的活性受抑制，
但这 3种酶受抑制的机制不同。α-AMY抑制蛋白
分子中富含二硫键，经 trxh还原后即失去抑制活
性(Weselake等 1983；Kobrehel和 Alary 1989；
Kobrehel等 1991)。在转基因小麦中被还原的抑制
蛋白量较少，大部分抑制蛋白仍有抑制活性，因
此活性态 α-AMY量低，而抑制态 α-AMY量高。
β-AMY是一种含有巯基的酶(吴东儒 1987)，转基
因小麦中的 t r xh含量减少可削弱 β -AMY 活性
(Sopanen和 Lauriere 1989)。另外，丝氨酸蛋白
酶也促进失活态 β-AMY向活性态 β-AMY的转化
(Ziegler 1999)，而在转反义 trxs基因小麦中丝氨酸
蛋白酶抑制蛋白(serpins)活性增高，丝氨酸蛋白
酶活性即相应降低(未发表资料)，因此转基因小
麦中的活性态 β-AMY量低，而抑制态 β-AMY量
则高。支链淀粉酶的抑制蛋白含有二硫键(Macri
等 1993)，被 trxh还原后即失去抑制活性，转基
因小麦中 trxh含量低，故其支链淀粉酶的抑制蛋
白活性高于野生型小麦，本文中转基因小麦内支
链淀粉酶的抑制程度高于野生型小麦验证了这一
点。另外，t r x h 含量低时，胚中低活性的支链
淀粉酶被还原激活的量也较少(Cho等 1999)，所
以转基因小麦中活性态支链淀粉酶活性高于野生型
小麦。
参考文献
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