全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月 435
甜瓜抗霜霉病基因同源序列克隆与分析
李金玉1 李冠1,* 赵惠新2 王贤磊1 颜雪1
1 新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2 新疆师范大学生命与环境科学学院，乌鲁木齐 830054
提要 采用 RT-PCR 扩增的方法，从高抗霜霉病甜瓜品种‘日本安农二号’中克隆到约 3 kb 的 cDNA 片段(命名为 MRGH-
J)，该基因是一个连续的通读编码框，编码 1 007 个氨基酸。推测的蛋白质分子量为 113.7 kDa，等电点为 7.88，蛋白质
预测无跨膜区。根据推测的氨基酸序列，该基因属于 TIR-NBS-LRR 类抗病基因，具有 TIR-NBS-LRR 类抗病基因所有的
保守结构域。核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果显示，MRGH-J 与甜瓜抗病基因的同源序列 MRGH12 及抗霜霉病
相关基因 mp-19 均具有高达 99% 的同源性，推测该基因可能在甜瓜抗霜霉病中起作用。
关键词 甜瓜；抗病基因；霜霉病
Cloning and Sequence Analysis of Resistance to Downy Mildew Gene Analogs
from Melon (Cucumis melon L.)
LI Jin-Yu1, LI Guan1,*, ZHAO Hui-Xin2, WANG Xian-Lei1, YAN Xue1
1College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China; 2College of Life and Environment Science,
Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China
Abstract The cDNA sequence (named MRHG-j) which was 3 kb long and encoded 1 007 amino acids was
cloned from the melon of high resistance to downy mildew by RT-PCR. Putative protein molecular weight was
113.7 kDa with an isoelectric point of 7.88 and no predicted transmembrane domain. It belonged to the TIR-
NBS-LRR resistance gene based on putative amino acid sequence and contained all of conservative domains of
TIR-NBS-LRR resistance genes. The deduced nucleic acid and amino acid sequence of MRGH-J shared 99%
identity with the reported melon resistance gene analog MRGH12 and resistance to downy mildew gene mp-19,
which suggested that it might be of great importance in melon disease resistance.
Key words melon; disease resistance gene; downy mildew
收稿 2005-11-04 修定 　2006-04-28
资助 新疆维吾尔自治区高校重点项目(200521102)。
*通讯作者(E-mail: guanli@xju.edu.cn, Tel: 0991-
8585071)。
近年来，甜瓜(Cucumis melon L.)的许多抗病
基因以及与抗病基因紧密连锁的分子标记在甜瓜基
因图谱中已得到定位，而甜瓜抗霜霉病基因研究
相对较晚，现在已知的抗霜霉病基因有Pc-1、Pc-
2、Pc-3、Pc-4和 Pc-5 (Cohen等 1985; Thomas
等1988; Epinat和Pitrat 1989; Kenigsbuch和Cohen
1992)，但这些基因至今还没有克隆到。
Zhao 和 Li (2005)用同源序列法结合PCR 技
术，并根据已克隆的抗病基因产物的保守结构域
设计简并引物，从甜瓜品种‘黄旦子’( H u a n g
danzi)中克隆到一个510 bp (mp-19)的片段，采用
半定量RT-PCR方法证实该基因的表达受霜霉病病
原菌[Pseudoperonospora cubensis (Berk. et Curt.)
Rostov.]的诱导，确认该基因与霜霉病相关。我
们曾将mp-19在 GenBank进行了 BLAST比对分析，
结果mp-19与van Leeuwen等(2005)报道的甜瓜抗
病基因同源序列MRGH12 (AAU04760)的相应片段
有极高同源性(99%)，由此，我们推测 MRGH12
可能与抗霜霉病相关。但 MRGH12 的功能尚未确
切验证，只是初步预测可能与抗病信号传导相
关，其功能尚待进一步验证。
此外，植物在病原激发子的诱导下，基因表
达水平常有变化，D N A 水平有基因变异。长期
在这种环境下，它可以或多或少地记录到生物
上，而使其获得抗逆反应和抗逆性，以适应不同
的环境(缪颖和伍炳华2001)。由于抗病基因存在
小种专化性，所以不同地域和分布不同的病原生
理小种可能会影响抗病基因的差异。我们以适合
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在新疆栽培的高抗霜霉病甜瓜品种为实验材料，
以此两个基因 MRGH12 和 mp-19 为参考，设计引
物用RT-PCR方法克隆到一个抗霜霉病基因同源序
列( 命名为 M R G H - J ，G e n B a n k 注册号
DQ287966)，可供进一步验证此克隆基因的功能
和探讨植物抗病防御反应机制参考。
材料与方法
甜瓜(Cucumis melon L.)‘日本安农二号’
(Japan annong-2)，是日本农林水产省野菜试验场
于1979年育成的高抗霜霉病甜瓜品种，由新疆西
域种业集团有限公司提供。R N A 提取试剂盒、
PCR 产物回收试剂盒和 PCR 引物购自上海生工生
物工程技术服务有限公司。RN A P C R 试剂盒、
pMD18-T 载体、DNA 标准分子量和 ExTaq 酶购
自宝生物工程(大连)有限公司(Takara)。大肠杆菌
DH5a 菌株是我们实验室保藏的菌种。其余药品
为国产分析纯试剂。
甜瓜总 RNA 的提取，依据操作试剂盒进行。
参考 MRGH12 基因，设计了 PCR 特异引物序列：
上游引物 P1，5 ATGGCTTCCTCCACCACCAC
3 ；下游引物 P2，5 T C A A C C C C C A T T C T -
CCCAAG 3。反转录用寡聚脱氧胸腺嘧啶作下游
引物，依照Takara RNA PCR Kit操作指南进行。
反应条件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，4℃ 5
min。PCR 反应用设计的特异性引物 P1 和 P2。扩
增参数：94℃ 2 min; 94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃
3 min，35 个循环；72℃ 10 min。反应产物进
行琼脂糖凝胶电泳检测。
按Takara公司PCR产物回收试剂盒说明书进
行 PCR 产物的回收。回收的 MRGH-J cDNA 片段
与 pMD18-T 载体在 T4 DNA 连接酶的作用下 16℃
过夜，使 MRGH-J cDNA 连接到 pMD18-T 的载体
上。连接产物转化感受态细胞。采用菌落 PCR 筛
选阳性克隆，引物用特异引物P1和P2和参考mp-
1 9 设计的引物 P 3 和 P 4 。上游引物 P 3 ，5
GGTGGAGTAG GCAAGACG(A)AC 3；下游引物
P4，5 CAGAGC(T)TAAT GGAAGGC 3。用两组
引物均扩增预期条带的克隆，委托Takara公司进
行全自动测序。
实验结果
1 RT-PCR 产物
采用提取的总 RNA，以寡聚脱氧胸腺嘧啶为
引物进行反转录得到单链 cDNA。以设计的 PCR
引物 P1 和 P2 进行扩增，RT-PCR 产物经 1% 的琼
脂糖电泳鉴定，可见一条约 3 kb 的条带(图 1)，
与我们预计的大小一致，初步推测为 MRGH-J 基
因片段。
2 MRGH-J cDNA 的序列
片段回收并构建到pMD18-T 载体上，以上述
设计的两组引物对重组子进行菌落 PCR 鉴定。对
两组引物都能够扩增得到预期片段的重组质粒
pMD18-T/MRGH-J 进行测序的结果如图 2。
3 序列同源性分析
测定核苷酸序列的结果表明，M R G H - J
cDNA克隆长3.024 kb，含有一个完整的开放阅读
框，共编码1 007个氨基酸。经用Antheprot 5.0
软件分析，其氨基酸分子量为 113.7 kDa，等电
点为 7.88，序列预测无跨膜区。用 DNAMAN 软
件进行同源比对时发现：所克隆序列的对应部分
与甜瓜抗病基因同源序列 MRGH12 和 mp-19，无
论在核苷酸水平还是在氨基酸水平均具有高达
99% 的同源性。同 MRGH 12 推导的氨基酸相比，
MRGH-J 有 5个氨基酸发生变化，其中1个氨基酸
位点变化(第228个氨基酸，由I变为V)位于核苷
图1 ‘日本安农二号’MRGH-J cDNA RT-PCR 扩增
Fig.1 Amplification of MRGH-J cDNA by
RT-PCR from ‘Japan annong-2’
1: DL15000 分子量标记；2: MRGH-J cDNA。
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酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)区，另外
3 个位点(第 811 个氨基酸，由 K 变为 E；第 859
个氨基酸，由 N 变为 S；第 8 6 1 个氨基酸，由
N 变为 D)发生在亮氨酸重复序列(leucine-rich
repeats, LRRs)区。另外还发现，该基因的氨基酸
序列与甜瓜的其它抗病基因氨基酸序列同源性较
图 2‘日本安农二号’MRGH - J 基因 cDN A 序列
Fig.2 The sequence of MRGH-J cDNA in ‘Japan annong-2’
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高，而与烟草(Nicotiana tabacum L.)、拟南芥
(Ara b i d o p s is t h a l i a n a )、亚麻(Lin u m
usitatissimum)、水稻(Oryza sativa)以及番茄
(Lycopersicon esculentum)的抗病基因氨基酸序列同
源性较低(图 3)。
LR R 类所特有的保守特点。
讨　　论
本文通过 RT-PCR 技术从高抗霜霉病甜瓜品
种‘日本安农二号’中扩增了一个抗病基因同源
序列MRGH-J。该基因编码1 007个氨基酸的通读
编码框。分析发现，MRGH-J 的氨基酸序列属于
TIR-NBS-LRR 类抗病基因。TIR 类结构域一般存
在于双子叶植物的抗病基因结构中，而单子叶植
物大都属于非 TIR-NBS-LRR 类抗病基因(Meyers
等 1999; Pan等 2000)。本文克隆的MRGH-J也是
来自于双子叶植物，与此结论相符合。而且
MRGH-J 包含了 TIR-NBS-LRR 类抗病基因所有的
保守结构域，其中 NBS 区中的 RNBS-A 和 RNBS-
D区可用来划分TIR和non-TIR类型抗病基因，同
时也可用来研究抗病基因的进化关系(Michelmore
和Meyers 1998)。TIR结构域与果蝇发育基因Toll
以及哺乳动物白细胞介素-1受体(IL-1R)基因的胞
质信号区域同源，而后两类基因参与的反应都激
活了某些转录因子(Taylor 1998)。因此，植物中
带有此结构的抗病基因可能与激活防卫基因的转录
因子有关。
核苷酸序列和氨基酸序列通过 DNAMAN 软件
比对分析发现，所克隆序列的相应部分与甜瓜抗
病基因同源序列 MRGH12 和 mp-19，无论在核苷
酸水平还是在氨基酸水平均具有高达 99% 的同源
性。由 MRGH-J 同 MRGH12 和 mp-19 的高度同源
性，推测 M R G H - J 可能在甜瓜抗霜霉病中起作
用。我们现正在构建该基因的植物表达载体，通
过转基因接种当地霜霉病来进一步验证该基因的功
能表达情况，以其实现抗病基因资源的有效利
用。这对改善和提高新疆甜瓜品质，发展新疆特
色经济可能有意义。
与 MRGH12 推导的氨基酸相比，MRGH-J 共
有 5 个氨基酸发生变化，不同的氨基酸主要分布
在 NBS 区和 LRR 区。LRR 是长度在 24 个氨基酸
之内的多重重复，它含有多个亮氨酸或其它亲水
残基。目前认为 LRR 为病原菌的特异识别区域，
单个核苷酸的改变都有可能改变专性识别。例
如，亚麻抗锈基因的同一家族成员L2、L6和 L10
存在不同小种专化抗性，分析其基因产物结构上
图3 ‘日本安农二号’MRGH-J 氨基酸序列与甜瓜
MRGH12 (AAU04760)、MRGH8 (AAU04763)、
MRGH21(AAU04761)、MRGH11 (AAU04759)、烟草
N (AAA50763)、拟南芥 RPP5 (AAF08790)、亚麻 L6
(AAA91022)及 M (AAB47618)、水稻 PIB (BAA76282)
以及番茄cf-2 (AAC15780)的氨基酸序列同源性比较
Fig.3 Comparison on analysis of the MRGH-J amino acid
sequences of ‘Japan annong-2’ with the MRGH12
(AAU04760), MRGH8 (AAU04763), MRGH21
(AAU04761), MRGH11 (AAU04759) of melon and tobacco
N (AAA50763), Arabidopsis RPP5 (AAF08790), linum L6
(AAA91022) and M (AAB47618), rice PIB (BAA76282),
tomato cf-2 (AAC15780)
4 MRGH-J 基因的氨基酸保守性分析
GenBank 搜索比对分析发现，所克隆的基因
具有抗病基因的保守结构域，分别为 T I R 区、
NBS 区和 LRR 区。研究发现(Meyers 等 1999)TIR
区可分为 3 个保守区：TIR-1、TIR-2 和 TIR-3。
在NBS-LRR区又有8个典型的保守区，分别为Pre-
P-loop区、P-loop (kin-1)区、RNBS-A区、kin-
2 区、RNBS-B (kin-3)区、RNBS-C 区、GLPL 区
和 RNBS-D 区。其中，RNBS-A 和 RNBS-D 区在
TIR-NBS-LRR 类和非 TIR-NBS-LRR 类抗病基因中
是完全不一样的。将 MRGH-J 和部分 TIR-NBS-
LRR 类抗病基因用 CLUSTAL 进行序列分析，结
果(图 4)显示 MRGH-J 具有以上所有的保守结构
域。其中 RNBS-A 和 RNBS-D 区也符合 TIR-NBS-
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图 4‘日本安农二号’MRGH-J 与 TIR-NBS-LRR 类抗病基因(包括亚麻 L6、M，
烟草 N，拟南芥 RPP5)的 TIR-NBS 区保守结构域比较
Fig.4 Comparison on the TIR-NBS conservative motifs in MRGH-J of ‘Japan annong-2’ and some
TIR-NBS-LRR resistance genes including linum L6 and M, tobacco N, Arabidopsis RPP5
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的区别，发现这些蛋白只在 LRR 附近的氨基酸存
在差异。LRR 区域的多样性较高则有利于植物细
胞识别不同病原体无毒基因(AVR gene)编码的蛋白
(Ellis等2000; Jia等2000; Dodds等2001)。这正
是植物抗病基因与病原菌无毒基因协同进化和适应
性选择的结果(Zhou 等 2004)。根据 MRGH-J 同
MRGH12 在 LRR 区的序列差异，推测可能是不同
品种适应特定的环境造成的，如当地的病原菌发
生的变异会引发相应的抗病基因也发生变化。另
外，该基因氨基酸序列与甜瓜的其它抗病基因同
源序列如 M R G H 8、M R G H 1 1、M R G H 2 1 的氨基
酸序列相比，同源性比其它物种克隆的抗病基因
氨基酸序列要高，说明不同抗病基因有种属特异
性。
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