全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月350
收稿 2004-07-08 修定 　2004-12-10
资助 国家“十五”科技攻关项目(200 1B A 30 2 B- 0 3)。
*通讯作者(E-mail: wwd413@zzu.edu.cn, Tel: 0371-
7767728)。
植物组织培养物的超低温保存
苗琦 谷运红 王卫东* 秦广雍
郑州大学物理工程学院，离子束生物工程省重点实验室，郑州 450052
The Cryopreservation of Plant Tissue Culture Materials
MIAO Qi, GU Yun-Hong, WANG Wei-Dong*, QIN Guang-Yong
Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering, School of Physical Science and Engineering, Zhengzhou University,
Zhengzhou 450052, China
提要 对超低温保存技术的研究历史、基本原理、方法、影响因素和国内外植物组织培养物超低温保存的研究进展作了
介绍，并对这一问题的前景作了展望。
关键词 植物组织培养物；超低温保存
组织培养技术是种质保存的有效途径之一，
利用这种技术可迅速建立植物无性繁殖系，其缺
点在于长期继代培养过程中要发生细胞学变化，
导致染色体变异和基因突变，增加遗传的不稳定
性。在超低温条件(一般指液氮低温，-1 9 6℃)
下，几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止
进行，但细胞活力和形态发生的潜能却可保存，
因而细胞培养物的遗传稳定性得以保存。将超低
温冷冻保存技术和组织培养技术结合起来，可望
成为保存植物种质的最佳办法。
冰冻生物材料的研究是从低温保护附加剂的
有效利用开始的。1 9 5 9 年，应用二甲基亚砜
(DMSO)作为冷冻保护剂初次成功，但直到 1968
年Ouatrano才用它作为冷冻植物组织培养细胞的
低温保护剂。1973年，Nag 和 Street[1]将胡萝卜
悬浮培养细胞保存在液氮中一段时间后再培养时，
观察到细胞仍可生长，这是超低温保存植物材料
的首次报道。自此以后，许多国家的有关实验室
相继开展了植物组织和细胞保存以及种质库建立的
研究，并取得了一定进展，超低温保存技术也日
趋完善。1979年，Sala等[2]报道了水稻悬浮细胞
的超低温保存，他们观察到冷冻保存化冻后细胞
可恢复生长。殷晓辉等[3]在 1994年由疣粒野生稻
幼穗离体培养所产生的愈伤组织超低温研究中，
成功地获得了冻后再生植株，这为野生稻优质资
源的保存提供了有效途径。迄今为止，关于植物
组织培养物超低温保存的报道已不少。本文就植物
组织培养物超低温保存方法的研究概况作一概述。
1 植物组织培养物的超低温保存
超低温保存是指在 -80℃以下的超低温环境
中保存种质资源，是70年代发展起来的一套现代
生物学保存技术。常以液氮为冷源，因此超低温
保存又称液氮保存。
植物材料的特性和材料的预培养对超低温保
存植物组织培养物的成活关系很大。另外，低温
冰冻会使细胞内水结冰，造成细胞结构不可逆的
破坏，导致死亡。组织培养物含大量的水分，因
此，冰冻防护剂的使用、降温及解冻方法是植物
组织培养物保存的几个关键因素。目前，此问题
的研究主要在以下几方面进行。
1.1 材料特性 由于植物基因型、抗冻性及器官、组
织和细胞年龄、生理状态等[4]的不同，不同材料
冷冻后细胞存活力差别很大。冷冻后存活率的巨
大差别不仅表现在种间，而且同种的不同品种间
也不同。Ulrich[5]对6个栽培稻品种的愈伤组织进
行超低温保存的结果表明，不同品种的保存效果
是不相同的。
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 351
植物组织、细胞培养物的生长年龄与生理状
态是决定冷冻细胞生活力的重要因素，细胞质
浓、无液泡、薄壁的细胞比液泡和厚壁相对含量
较大的单细胞培养物或愈伤组织更能抗冻，因
此，取生长延滞后期或指数生长期的细胞进行冷
冻能得到较高的存活率；冻后细胞的恢复生长依
赖于保持分裂能力的细胞密度，高密度细胞是细
胞存活力的重要指标；此外，细胞团体积大小本
身对冷冻保存效果也有影响，体积过大或过小(如
游离细胞)对冷冻保存效果均不好。刘贤旺等[6]在
超低温保存杜仲愈伤组织时发现，一周龄的杜仲
愈伤组织抗冻能力较低，培养至第 2 周时，抗冻
能力最强，延长培养时间，抗冻能力呈下降趋
势；他们还在超低温保存半枫荷(Altingia chingii
Mete)愈伤组织时发现三周龄的半枫荷愈伤组织为
超低温保存的最佳材料[7]。水稻培养细胞的超低
温保存以幼龄的培养细胞存活率为高，液体悬浮
培养细胞以培养 1 周为宜，固体培养基培养的愈
伤组织以 2 周为宜，胚状体的保存也是如此[8]。
Cornejo等[9]发现水稻愈伤组织培养时间长短对保
存效果影响很大，8 个月的愈伤组织保存效果和
复温后培养物再生能力明显不如 4 个月的愈伤组
织。杨文等[10]发现年龄在15~20 d 的香雪兰愈伤
组织的抗冻能力最强，他们认为选择这个时期的
香雪兰愈伤组织作为超低温保存材料较为适宜。
1.2 预培养 预培养是改善材料生理状态的有效方
法，离体培养物在冷冻前进行预培养能增强细胞
的抗寒力。预培养的目的是提高分裂细胞的比
例，减少细胞内自由水含量，增强细胞的抗冻
力。方法包括：增加预培养基中的糖浓度，提
高渗透压，以减少细胞内自由水含量；或在预培
养基中加入诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，如
山梨醇、蔗糖、丙二醇、DMS O、脱落酸(AB A )
等，此法已在许多植物离体培养物保存中获得成
功，是目前应用最广泛的一种预处理方法。毛地
黄细胞培养物在加有海藻糖的培养基中预培养后，
不仅存活率高，而且细胞开始恢复生长所需的修
复时间也极短[11]; 未成熟的春小麦合子胚在含0.5
mg·L-1 ABA 的半固体培养基上预培养 10 d 后，不
用加冰冻保护剂便能得到高存活率[12]。陈勇等[13]
把瓯柑愈伤组织在含 5% DMSO 的 MS 培养基上预
培养5 d 后获得 83.10% 的冻后愈伤组织存活率。
将被保存的材料暴露于一定的低温环境中，
使其接受低温锻炼，也是一种常用的预处理方
法，称为低温预处理。对某些植物材料，尤其
是对低温敏感的植物来说，超低温保存显得尤为
重要。预培养与超低温保存结合使用能进一步提
高冻后的细胞存活率。Niino等[14]将离体的樱桃茎
尖接种在MS+0.7 mol·L-1蔗糖培养基上于5℃低温
条件下预培养1 d，冻存后存活率高达80%以上；
Leena[15]以超低温保存银杏离体茎尖时发现，用附
加10-14 mol·L-1 ABA的 WPM培养基上于5℃低温条
件下低温锻炼28 d，可显著提高冻后细胞存活率。
1.3 冰冻保护剂 冰冻保护剂能减少超低温保存造
成的伤害。除一些对脱水极不敏感的材料以外，
几乎所有的植物材料都需经过冰冻保护剂的处理。
保护剂的作用机制是增大膜对水分的通透性，促
进细胞外冰冻造成的脱水效果，降低细胞内水分
冰点温度，保护蛋白质和酶类。选好冰冻保护剂
是保证细胞进行超低温处理成功的关键。理想的
冰冻保护剂应是在超低温保存过程中能保护组织免
受冰冻伤害，而且，应极易溶于水，对细胞的
毒性低，化冻后容易从组织中洗掉。常用的冰冻
保护剂大体分两类：一类是能穿透细胞的低分子
量化合物(DMSO)以及各种糖类等；另一类是不
能穿透细胞的高分子量化合物(如聚乙烯吡咯烷
酮、聚乙烯二醇等)。在各种保护剂中，D M S O
是广泛采用的一种。Saka i [16]较详细地研究了
DMSO 的使用浓度，认为其较适宜的浓度为 5%~
10%。除了目前经常使用的保护剂外，Crowe 等[17]
发现：海藻糖能与磷脂相互作用而稳定细胞膜，
因而也用作为保护剂；Bhandal [18]用冰冻保护剂海
藻糖成功地保存了胡萝卜、烟草等细胞培养物；
脯氨酸在冰冻 - 解冻过程中能稳定蛋白质，在水
稻超低温保存中也是一种有效的冰冻保护剂[19]。
复合保护剂比单一保护剂的效果好，这是因为复
合保护剂可以减轻或消除单一保护剂成分对细胞产
生的毒害作用，而且各种保护剂的作用可以相互
协调，共同作用。如 Bajaj[20]用 10% DMSO+20%
葡萄糖保存水稻细胞悬浮培养物获得成功；徐刚
标等[21 ]用 1 0 % D M S O + 8 % 水解乳蛋白及 1 0 %
DMSO+0.5 mo·L-1 山梨醇也成功地保存了银杏愈伤
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组织；Ulrich 等[22]用 10% DMSO+8% 葡萄糖 +10%
聚乙二醇(PEG6000[23]、PEG8000[24]较常用)的复合
保护剂得到的枣椰树愈伤组织存活率接近 100%；
陈书安等[25]用 15% DMSO+15% 乙二醇 +30% 甘油
的0.4 mol·L-1蔗糖液的复合保护剂，在15℃下处
理10 min得到的水母雪莲愈伤组织，经玻璃化法
冻存后的存活率为 54.2%；马锋旺和李嘉瑞[26]认
为，单用 DMSO 不适合做杏愈伤组织超低温保存
的冰冻保护剂，而以 DMSO 与山梨醇或葡萄糖混
合处理对杏愈伤组织超低温保存较适宜。
1.4 降温冰冻方法 组织培养物的超低温保存中，
常用的降温方法主要有以下几种：
1.4.1 快冻法 快冻法是将材料从0℃或其它预处理
温度中直接投入液氮内。据报道，此种方法降温
速度达到300~1 000℃·min-1 [27]，也有报道称降温
速度达到1 000℃·min-1 以上[28]，这样可使细胞内
的水还未来得及形成冰晶中心就降到 -196℃的安
全温度，从而可避免细胞内结冰的危险，使细胞
内呈“玻璃化”状态。此法简单，不需要复杂、
昂贵的设备，但对含水量较高的培养物效果并不
好，采用此法成活率较高的报道很少。据报道，
用此法超低温保存光棘豆(Oxytropis leptophylla DC)
愈伤组织[29]和红豆杉愈伤组织[30]时，均发现冻后
再培养的存活率接近于零。
1.4.2 慢冻法 慢冻是指以0.1~10℃·min-1的降温速
度从0℃降到 -100℃左右再立即浸入液氮。降温
过程中，细胞内水分可以有充分的时间不断流到
细胞外结冰，使细胞内水分含量减少到最低限
度，达到良好的脱水效果，从而避免细胞内结
冰。一般来说，植物组织培养物以采用慢冻法为
宜，采用的降温速度多为 0.5~2℃·min-1。
1.4.3 逐级冰冻法 培养物预冷却到 -20、-50、
-70、-100℃停留一段时间后浸入液氮中。据报
道，生物细胞在有防冻剂存在的降温过程中，随
着温度的降低，至 -10℃时细胞外介质结冰已基
本完成，而细胞内尚未结冰，形成细胞内外的蒸
气压差，只要降温速率不超过连续脱水的速度，
这样细胞内水不断向细胞外扩散，细胞原生质浓
缩，从而降低细胞内含物的冰点，这种逐渐除去
细胞内水分的过程称为“保护性脱水”。冷却过
程中停留一段时间可以诱导细胞内水溶液向外扩散
结冰，使细胞对外产生蒸气压差，进行保护性脱
水；否则细胞外可能产生非均一的冰晶，从而对
细胞产生严重伤害。这种冰冻方法在多数培养物
超低温保存中已获得成功。多数报道认为，慢冻
材料降温至某一温度并停留一段时间是必要的。
徐刚标等[21]发现，-10 和-35℃处停留一段时间能
明显提高冻存后的银杏愈伤组织的相对存活率；
但也有研究认为，在 -10℃中停留15 min保存光
棘豆愈伤组织比用慢冻法的效果差[29]，这可能是
因为在 -1 0℃中停留会造成过度脱水。这说明，
采用何种冰冻保存方法应因材料而异。
将慢冻法与逐级冰冻法结合使用能得到较好
的冰冻保存效果。马锋旺和李嘉瑞[26]在保存杏愈
伤组织时，开始以 1℃·min-1 速度降温至 -40℃，
停留2 h 后投入液氮中保存，可获得 80.5% 的存
活率。钱士忠和赵树仁[29 ]保存光棘豆愈伤组织
时，以 0.5℃·min-1 的速度降至 -40℃，停留 2 h
后投入液氮中，冻后存活率可高达 93.7%。
1.4.4 干冻法 采用无菌空气流、干燥硅胶或饱和
溶液表面的气相等对材料进行脱水处理后快速将材
料投入液氮贮存，或用冰冻保护剂处理后析出材
料表面水分，再以金箔密封进行慢冻后置于液氮
中保存。如果脱水足够，细胞内溶液浓度就会变
得很高而易进入玻璃化状态。这种方法对某些愈
伤组织是适合的，但对大多数对脱水敏感的组织
培养物则是很困难的。
1.4.5 玻璃化法 玻璃化法是由Sakai等[31]建立的一
种简单高效的冰冻保存方法。此法是将生物材料
用一定配方的复合保护剂处理后快速投入液氮中保
存。通过保护剂处理可避免胞内外冰晶形成，使
组织各部分都进入一个相同的玻璃化状态，这是
目前在一些较复杂组织中常用的一种有效超低温保
存方法，也是近年来发展较快的一种冻存方法。
玻璃化法冻存采用的复合保护剂被称为玻璃化溶液
(vitrification solution，VS)。目前用得最多的植物
材料玻璃化溶液(plant vitrification solution，PVS)
是 PVS2：30% (W/V)甘油 +15% (W/V)乙二醇 +15%
(W/V)DMSO+0.4 mol ·L-1 蔗糖，保存的材料在
0~25℃中处理一段时间后直接投入液氮中保存；
现已有人用PVS4：35% (W/V)甘油 +20% (W/V)乙
二醇+0.6 mol·L-1蔗糖替代PVS2，这可避免直接接
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触 DMSO，从而减少毒害作用[32]。玻璃化冻存的
关键在于严格控制植物材料在玻璃化保护剂中的脱
水时间，材料的最佳脱水时间具有种的特异性[33]。
总之，此法简单易行、省时省力，且冻存效果
好。黄纯农等[34]用玻璃化法冻存大麦悬浮细胞时
发现，冷冻后细胞的 TTC(氯化三苯四氮唑)活性
很高。但此法对材料毒害较大，易造成过分脱
水。为解决这一问题，人们采用逐步冷冻法与玻
璃化法相结合保存材料，已获得成功[6,23,29,30]。为
了进一步降低组织细胞内含水量，在玻璃化溶液
脱水处理前有人还往往采用一个过渡性的预处理阶
段。预处理能增加保护性成分向细胞渗入，减轻
细胞在脱水时的损伤，有利于存活率的提高[35]。
周小梅等[36]在超低温保存玉米组培材料时发现，
未经过渡液处理的玉米悬浮细胞的存活率只有
17.2%，而经过渡液处理5 min后存活率可达85.2%；
陈勇等[13]在室温下用60% PVS2对瓯柑愈伤组织进
行过渡性预处理 20 min 后，再在 0℃中用 100%
PVS2 处理 40 min，可得到 85.62% 的冻后愈伤组
织存活率。
1.4.6 包埋脱水法 包埋脱水法是将植物材料用褐
藻酸钙包埋后，先在含高浓度蔗糖的培养基中脱
水，再用无菌空气流或干燥硅胶脱水，然后投入
液氮中保存，若用玻璃化保护剂辅助脱水，也叫
包埋玻璃化法。包埋可保护材料，使之能经受对
裸露材料致死性的伤害。此法可省去传统的慢速
降温方法对昂贵降温仪器的依赖，从而避免玻璃
化法中高浓度保护剂对材料的毒害作用，且一次
能处理较多的材料，这在对低温敏感的植物材料
中有很大的应用潜力，但也存在脱水慢、成苗率
低和组织恢复生长慢等缺点。现在一些植物的悬
浮细胞、愈伤组织和胚性愈伤组织采用包埋脱水
法保存材料获得成功的已有所报道[37]。
1.5 解冻方法和解冻后处理 大量的实验表明，快
速化冻法对大多数植物材料都适合，通常的做法
是：将冻存后的材料放在 2 5 ~ 4 0℃的水浴中解
冻，一旦冰完全融化后，立即取出材料以防热伤
害和高温下保护剂的毒害；此种经脱水处理后的
材料宜在室温下缓慢解冻。
除了干冻处理的生物材料外，解冻后的材料
一般都需洗涤，以除去细胞内高浓度的冰冻保护
剂，这对于玻璃化冻存的材料来说，解冻后的洗
涤尤为重要。常用的洗涤方法是用含1~2 mol·L-1蔗
糖的培养基在25℃下洗涤10 min 左右。
冰冻与解冻会造成细胞的冷冻损伤，导致冻
后细胞的再生力与结构上都有不同于未经冷冻处理
的细胞。Kuriyama等[38]发现，铵离子对未冷冻的
水稻细胞生长有促进作用，但对冷冻后的水稻细
胞有害，因此，选择冻后合适的培养基成分十分
重要，这关系到超低温保存的成败。
2 问题与展望
生物材料用液氮超低温保存后，其生理代
谢、生活力下降和基因特异性丧失等问题可得到
控制，病原微生物的活动也可得到抑制，可以说
此方法是稳定、可靠的长期保存植物组织培养物
的一种技术。迄今，人们已对 15 种植物愈伤组
织、22种植物悬浮培养细胞的超低温保存进行了
研究，但此项研究尚处于起步阶段，其深度与广
度都不够，许多问题还需进一步探讨：经超低温
保存后的材料存活率一般较低，特别是保存的时
间还较短；长期保存的材料生活力和存活率如
何，再生能力如何，以及低温保存机制等。据
此，我们认为，今后应加强以下几方面的研究：
(1)植物超低温保存影响因素很多，想用一种方法
或体系保存不同的植物组织培养物不一定可行，
尚须根据材料的特性，研究并建立与之相适应的
保存体系的方法；(2)种质保存的目的在于保持遗
传基因的稳定，所以，应跟踪研究成苗的植物生
长状况和遗传稳定性，加强超低温保存后遗传性
状的分析；(3)从分子水平上分析冻存的机制，建
立一套操作简便、行之有效的冰冻保存方法，以
供实际应用中参考。
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