全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月914
小麦拔节过程中基部茎节的基因差异表达
李永春 1, 王潇 1, 王创云 2, 王美霞 2, 李磊 1, 尹钧 1,*
1河南农业大学国家小麦工程技术研究中心, 郑州 450002; 2山西腾达种业有限公司, 太原 030031
提要: 采用差异显示逆转录 PCR (DD-RT-PCR)技术分析小麦基部茎节伸长过程中基因表达差异的结果表明, 小麦拔节前
和拔节后基部茎节中存在明显的基因表达差异(包括质和量的差异)。从具有质的差异表达基因中挑选了4个基因进行cDNA
片段(编号为WSR1~4)的克隆、测序和GenBank数据库序列同源性比对分析, 结果显示, WSR1与大麦中编码 Ser/Thr蛋白
激酶的序列具有很高的同源性, WSR2的功能未知, WSR3高度同源于玉米中编码Ty3/gypsy类反转座子反转录酶的序列, WSR4
高度同源于小麦的端粒关联DNA。半定量RT-PCR技术分析拔节过程中克隆基因WSR1~4表达特性显示, 除了WSR4以外,
其余 3个基因的表达模式和通过DD-RT-PCR分析所展示的差异表达趋势基本一致。
关键词: 小麦; 茎节伸长; 基因差异表达
Differential Gene Expression in the Basal Stems of Wheat at the Jointing Stage
LI Yong-Chun1, WANG Xiao1, WANG Chuang-Yun2, WANG Mei-Xia2, LI Lei1, YIN Jun1,*
1National Engineering Research Center for Wheat, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2Shanxi Tengda Seed
Company Limited, Taiyuan 030031, China
Abstract: In order to study the molecular mechanism of wheat stem elongation, the differential display reverse
transcription PCR (DD-RT-PCR) was used to identify the gene expression pattern during the basal stem elonga-
tion in wheat plant. The results showed that obvious differential gene expression was observed during the stem
elongation, including qualitative and quantitative differences. From those qualitatively differentially expressed
genes, four of them, designated as WSR1–4, were selected for cDNA fragment cloning and sequencing. Se-
quence homology search in GenBank database showed that the WSR1 was highly similar to a barley sequence
encoding the serine/threonine protein kinase, WSR2 had no homology hits, WSR3 showed high similarity to a
maize sequence encoding the Ty3/gypsy-type retrotransposon reverse transcriptase, while WSR4 showed high
similarity to wheat telomere-associated DNA. The expression patterns of these four cDNAs were analyzed via
semi-quantitative RT-PCR in the elongating wheat stem, the results showed that the expression patterns of three
cloned cDNAs, except the WSR4, were basically agree with the expression trends displayed in DD-RT-PCR
analysis.
Key words: wheat; stem elongation; gene differential expression
收稿 2008-06-20 修定 　2008-09-11
资助 山西省科技厅项目( 2 0 0 8 0 8 1 0 0 7 )和太原市科技项目
(0 8 0 1 0 0 9 )。
* 通讯作者(E-ma i l : xm zxy j@1 2 6 .c om; T e l : 0 3 7 1 -
6 3 5 5 8 2 0 3 )。
倒伏是影响小麦持续高产稳产的重要限制因
素, 特别是随着我国小麦高产栽培技术的大力推广
和应用, 高产与倒伏的矛盾日益突出。基部节间过
长是造成小麦倒伏的主要原因之一, 适当控制小麦
基部 1、2 节间的长度可以有效提高小麦的抗倒
性。目前, 有关调控小麦茎节伸长的研究主要集中
在植物生长延缓剂的使用和栽培生理调控(李金才
等 2005; 朱新开等 2006), 而对其茎节伸长的分子
调控机制研究较少(Zhang等2007)。本文采用DD-
RT-PCR技术分析了小麦拔节过程中基部茎节组织
的基因差异表达特性, 这对探讨小麦茎节伸长的分
子调控机制和小麦抗倒伏分子育种来说都是有意义
的。
材料与方法
温室种植小麦(Triticum aestivum L.)品种 ‘郑
麦 9023’, 选取生长一致的植株用于取材。拔节期
分别剥取拔节前及拔节过程中的基部茎节组织, 迅
速在液氮中速冻后, 置于-80 ℃冰箱中保存备用。
用于进行基因差异表达分析的组织材料包括: 拔节
前的基部茎节组织、第一节长度为 2 mm的茎节
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组织、第一节长度为 5 mm的茎节组织和第一节
长度为 10 mm的茎节组织。
用热酚法(Liang和Pardee 1995)提取各样品的
总 RNA, 用DNA酶(RNase-free) 37 ℃消化 1 h后,
分别用等体积的苯酚:氯仿(1:1)和氯仿各抽提一次,
经乙醇沉淀后溶解到DEPC处理的双蒸水中备用。
cDNA的合成反应采用 20 µL体系, 其中包括
2 µg总 RNA、5 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.3)、75
mmol·L-1 KCl、3 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1
DTT、50 mmol·L-1 dNTPs、Oligo d(T)18锚定引
物 50 pmol、M-MLV反转录酶 200 U。上述反应
体系置于 37 ℃中温育 2 h后, 取 2 µL反应液作为
RT-PCR扩增的模板。
RT-PCR反应采用 20 µL体系, 其中包括反转
录产物 2 µL、2 µL 10×PCR缓冲液、200 mmol·L-1
的 dNTPs, 3 端锚定引物和 5端随机引物各 10
pmol, 1 U Taq DNA聚合酶。反应程序为: 94 ℃ 5
min; 94 ℃ 1 min, 40 ℃ 4 min, 72 ℃ 1 min, 1个循
环; 94 ℃ 45 s, 60 ℃ 2 min, 72 ℃ 1 min, 40个循环;
最后, 72 ℃延伸 10 min。3 端锚定引物包括: R1
(5-AAG CTT TTT TTT TTT A-3)、R2 (5-AAG
CTT TTT TTT TTT C-3)和 R3 (5-AAG CTT TTT
TTT TTT G-3); 5 端随机引物包括: L1 (5-TGC
CGA AGC TTT GGT CAC-3)、L2 (5-TGC CGA
AGC TTT GGT CAG-3)、L3 (5-TGC CGA AGC
TTT GGT CAT-3)、L4 (5-TGC CGA AGC TTG
GAG CTT-3)、L5 (5-TGC CGA AGC TTG ATT
CCG -3)和 L6 (5-TGC CGA AGC TTC GAC TGT-
3 )。
扩增产物中加入 5 µL 98% 甲酰胺(含 100
mmol·L-1的 EDTA和 0.1%的二甲苯青)混匀, 经沸
水变性 10 min后取其中 6 µL进行电泳分析。凝
胶采用经7 mol·L-1脲变性的4%的聚丙烯酰胺测序
胶, 电泳结束后将凝胶用硝酸银染色, 并统计差异
表达条带的结果。
采用煮沸法回收差异片段: 将差异表达片段用
解剖刀挖出, 放入离心管中, 加入 20 µL超纯水, 在
100 ℃水浴中煮 10 min。取回收产物 2 µL作为再
扩增模板, 其他试剂同 RT-PCR。PCR扩增程序为
94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min,
40 个循环; 72 ℃ 10 min。将二次扩增产品在 1%
琼脂糖凝胶上检测, 如是一条带并且和在变性聚丙
烯酰胺凝胶上的分子量一样, 则可用于克隆和测
序。将二次 PCR扩增产物连接到 pGEM-T Easy
Vector上进行转化, 通过蓝白斑筛选, 再进行 PCR
鉴定, 挑选阳性克隆进行测序。将获得的DNA序
列在NCBI数据库中进行BLASTX比对分析, 推断
克隆 cDNA片段对应基因的可能生物学功能。
根据克隆的序列设计特异引物进行RT-PCR分
析, 为防止扩增达到平台期, 分别进行了 28个、30
个和 35个循环的扩增分析, 最后确定采用 30个循
环的检测结果; 选用小麦 β-actin基因为对照。引
物为WSR1-F: 5-CCC CAT AAG ATA GCG TAC
TTC A-3; WSR1-R: 5-AGG AAG GCA GCA AGC
AAG G-3; WSR2-F: 5-CAT GAG ATG AGA CGC
AAG CA-3; WSR2-R: 5-TAG GCT GCC ACT GCA
CCA C-3; WSR3-F: 5-CAT GGG AAG ATA TTA
GCA TGG-3; WSR3-R: 5-CGC ATA AAG TCT TCC
AAA AGT A-3; WSR4-F: 5-TGC ATA GAC GCG
GTC GAC AT-3; WSR4-R: 5-CTT GGC TGA CCT
CAG CCC C-3; β-actin引物序列为: 5-CAG CAA
CTG GGA TGA TAT GG-3; 5-ATT TCG CTT TCA
GCA GTG GT-3。
结果与讨论
1 小麦茎节伸长过程中的基因差异表达
以拔节前的基部茎节组织(A)、第一节长度为
2 mm (B)、5 mm (C)和 10 mm (D)时的基部茎节
组织的 cDNA为模板, 用 3个 3 端锚定引物与 6个
5 端随机引物(18个引物组合)进行 RT-PCR 扩增,
扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的结果表
明: 小麦拔节过程中 B、C和D 3种基部茎节平均
扩增获得的条带数分别为 1 529、1 507、1 475条,
与拔节前基部茎节(A)相比, B、C和D三种茎节组
织中分别有 331 (21.7%)、340 (22.6%)和 346 (23.5%)
条带表现出表达差异(表 1); 每个引物组合可展示
15~38条差异带, 平均为 22条, 这表明在小麦拔节
过程中基部茎节存在明显的基因表达差异。
2 小麦拔节过程中基部茎节组织基因差异表达类型
通过DD-RT-PCR产物的电泳分析显示, 小麦
拔节过程中基部茎节中存在质和量的基因表达差
异。质的基因差异表达可分为 5种类型。(1)拔节
前的基部茎节中检测到扩增条带, 在拔节过程中未
检测到相应条带(QL1, 图 1-a); (2)拔节前检测到较
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浓的扩增条带, 在拔节开始后扩增条带逐渐减弱至
检测不到(QL 2, 图 1-b); (3)拔节前未扩增到条带,
在拔节过程中扩增到条带, 且条带逐渐加浓(QL 3,
图 1-c); (4)拔节前未扩增到条带, 在拔节过程中扩
增的条带从浓逐渐变淡(QL 4, 图1-d); (5)在拔节前
和拔节过程中的不同阶段, 扩增条带时有时无, 呈
波动变化(QL 5, 图 1-e)。
量的表达差异可分为 3种类型: (1)增强型, 拔
节后表达逐渐增强(QN 1, 图 2-a); (2)减弱型, 拔节
后表达减弱(QN 2, 图 2-b); (3)波动变化型, 拔节后
表达量出现波动(QN 3, 图 2-c)。
3 小麦拔节过程中基部茎节组织基因差异表达类
型比较
所用 18个引物组合中, 拔节后不同长度的茎
节与拔节前基部茎节相比, 3个时期差异均以量的
差异为主, 变化幅度为 12.6%~13.7%, 各差异表达
类型(QN 1~3)的条带数在3种不同长度基部茎节组
织差异表达条带中所占的比例也有一定差异(表
2)。质的差异表达条带占总体差异表达条带的
9.1%~9.8% (表3); 各差异表达类型中, 以拔节过程
中表达波动类型(QL 5)的条带所占比例最大, 该类
表 1 小麦拔节过程中基部茎节差异表达的 cDNA 片段
Table 1 Differentially expressed cDNA fragments in wheat basal stems at the jointing stage
茎节类型 扩增条带数 差异条带数 * 差异条带所占比例 / %
第一节长度为 2 mm的基部茎节组织 1 529 331 21.7
第一节长度为 5 mm的基部茎节组织 1 507 340 22.6
第一节长度为 10 mm的基部茎节组织 1 475 346 23.5
　　*与拔节前基部茎节组织相比的差异条带数。
图 1 小麦茎节伸长过程中质的基因表达差异类型
Fig.1 Qualitative differential gene expression patterns during
the wheat basal stem elongation
A~D为不同的茎节类型; a~e分别为质的差异表达类型 QL
1 ~ 5; 箭头所指条带为差异表达的条带。
表 2 小麦茎节伸长过程中属于量的差异表达 cDNA片段的比例
Table 2 The percentage of quantitative differentially expressed cDNAs during the wheat basal stems elongation

茎节类型
cDNA片段的比例 / %
QN 1 QN 2 QN 3 总数
第一节长度为 2 mm的基部茎节组织 4.4 4.3 3.9 12.6
第一节长度为 5 mm的基部茎节组织 3.7 4.4 5.1 13.2
第一节长度为 10 mm的基部茎节组织 3.9 6.4 3.4 13.7
图 2 小麦茎节伸长过程中量的基因表达差异类型
Fig.2 Quantitative differential gene expression patterns
during the wheat basal stem elongation
A~D为不同的茎节类型; a~c分别为量的差异表达类型 QN
1 ~ 3; 箭头所指条带为差异表达的条带。
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型的差异条带在拔节过程中逐渐增多(所占比例从
3.4%增加到 3.9%)。可见, 小麦在茎节伸长过程
中有大量的基因参与了这一生长发育调控过程, 差
异表达基因中属于表达量改变的基因要多于特异性
表达(质的差异表达类型)基因的数量。推测那些
属于质的差异表达类型的基因在整个基因表达谱改
变和小麦茎节伸长的分子调控过程中是发挥功能
的。
4 差异表达cDNA片段的克隆和鉴定
从凝胶中直接回收 4个小麦拔节过程中差异
表达(质的差异)的 c D N A 片段 , 分别编号为
WSR1~4。回收片段经克隆、测序和功能注释分
析显示: WSR1和大麦中编码Ser/Thr蛋白激酶的序
表 3 小麦茎节伸长过程中属于质的差异表达 cDNA片段的比例
Table 3 The percentage of qualitative differentially expressed cDNAs during the wheat basal stems elongation

茎节类型
cDNA片段的比例 / %
QL 1 QL 2 QL 3 QL 4 QL 5 总数
第一节长度为 2 mm的基部茎节组织 1.8 2.1 1.0 0.8 3.4 9.1
第一节长度为 5 mm的基部茎节组织 1.9 2.0 0.7 1.1 3.8 9.5
第一节长度为 10 mm的基部茎节组织 2.4 1.9 0.6 1.0 3.9 9.8
表 4 4个克隆 cDNA片段的差异表达类型和功能
Table 4 Differential expression patterns and annotations of 4 cloned cDNA fragments
cDNA片段 差异表达模式 注释的功能 相似序列的序列号 E值
WSR1 QL 1 大麦 Ser/Thr蛋白激酶 DQ469714 6e-14
WSR2 QL 1 未知功能  — —
WSR3 QL 4 玉米 Ty3/gypsy类反转座子反转录酶 AF030633 1e-45
WSR4 QL 4 端粒关联 DNA AF004950 9e-33
图 3 小麦茎节伸长过程中克隆的 cDNA片段表达模式
Fig.3 The expression patterns of the cloned cDNAs during
the wheat basal stems elongation
A~D为不同的茎节类型; WSR1~4为克隆的差异表达 cDNA
片 段 。
列具有很高的同源性, WSR2的功能未知, WSR3与
玉米中编码Ty3/gypsy类反转座子反转录酶的序列
同源性很高, WSR4高度同源于小麦的端粒关联
DNA (表4)。采用半定量RT-PCR分析小麦拔节过
程中克隆基因的表达特性显示, 除了WSR4以外, 其
余3个基因的表达模式和通过DD-RT-PCR分析展
示的差异表达趋势基本上一致 (图 3 )。可见 ,
WSR1、WSR2和WSR3对应的基因在小麦拔节过
程中存在差异表达现象, 可能在调控小麦茎节伸长
过程中发挥某种功能。
由蛋白激酶催化的蛋白质可逆磷酸化是生物
体中普遍存在的一种蛋白质功能调节机制(Stone和
Walker 1995)。在真核生物中, Ser/Thr 蛋白激酶
是一个很大的调控蛋白家族, 它们能从ATP上将磷
酸转移到目标蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上, 从而
实现对蛋白质的功能调节, 该类蛋白激酶参与的蛋
白质功能调节涉及到非常广泛的植物生长发育调控
过程(Shimotohno等 2006)。在本文中发现, 一个
和大麦 Ser/Thr蛋白激酶高度同源的基因WSR1在
拔节过程中存在表达差异现象, 推测此基因编码蛋
白可能参与小麦茎节伸长的分子调控过程。反转
座子结构在植物基因组中普遍存在, 有研究表明, 它
们可以插入基因内部或附近, 改变着基因表达, 在
植物基因和基因组的进化中也可能发挥作用
(Kumar和Bennetzen 1999; Fedoroff 2000; Kashkush
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月918
等 2003)。本文中发现的差异表达基因WSR3和玉
米中编码Ty3/gypsy类反转座子反转录酶的基因高
度同源, 但此种基因是否参与小麦节间伸长的调控
过程, 还待进一步研究。
参考文献
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