全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 413
甘草GuPIP1基因启动子的克隆及序列分析
王芳 *，董乐，袁建军，黄周英，林娈
泉州师范学院化学与生命科学学院，福建泉州 362000
提要：从甘草叶中提取总DNA，并用染色体步行技术克隆甘草 GuPIP1基因 5端上游调控区序列(GenBank accession No.
EU 262597)。采用生物信息学方法进行序列分析表明，该序列具有典型的启动子结构，具干旱和ABA激素调控序列等顺
式作用元件。
关键词：甘草；质膜水通道蛋白基因；启动子；干旱和 ABA激素调控序列
Cloning and Sequence Analysis of the GuPIP1 Gene Promoter from Chinese
Licorice (Glycyrrhiza uralensis F.)
WANG Fang*, DONG Le, YUAN Jian-Jun, HUANG Zhou-Ying, LIN Luan
School of Chemistry and Life Science, Quanzhou Normal College, Quanzhou, Fujian 362000, China
Abstract: In this paper a 613-bp promoter sequence of GuPIP1 transcription factor from the genomic DNA of
Chinese licorice (Glycyrrhiza uralensis F.) was cloned by using chromosomal walking. Bioinformatical analysis
of this sequence showed that the sequence contained some typical elements of a promoter, drought- and ABA-
responsive elements. The GuPIP1 gene promoter from Chinese licorice (Glycyrrhiza uralensis F.) has been
successfully cloned (GenBank accession No. EU 262597).
Key words: Chinese licorice (Glycyrrhiza uralensis F.); GuPIP1; promoter; drought- and ABA-responsive ele-
ments
收稿 2007-11-13 修定 2008-04-06
资助 福建省科技厅青年科技人才创新项目(2006F3113)、福
建省教育厅科技计划(2007JA07151)、泉州市科技局技
术研究与开发项目(20 0 7 N6 )、泉州师范学院科研启动
基金和泉州师范学院开放实验基金(07 08 0 10 7)。
* E-mai l：dwf32 0@1 63 .com；Tel：05 95-281 312 68
迄今为止，作为细胞膜上选择性高效转运水
分子的特异孔道的水通道蛋白(aquaporin, AQP)已
相继在拟南芥、烟草、玉米、豌豆、水稻等多
种植物中得到克隆。植物基因组测序揭示，植物
水通道蛋白是一个超家族：拟南芥中有 38个水通
道蛋白基因编码的 35种水通道蛋白同源物，玉米
和水稻中分别有 3 5 和 3 3 个水通道蛋白基因
(Chaumont等 2001；Johanson等 2001)。蛋白数
据库显示，大量水通道蛋白同源物广泛存在于单
子叶和双子叶、C3和 C4代谢植物中，氨基酸序
列的同源性分析表明，它们可能是水通道蛋白
(Higuchi等 1998)。Johanson等(2001)根据氨基酸
序列同源性和亚细胞定位将其划分为 4 个家族，
即：质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic
proteins, PIPs) (Kammerloher等 1994)、液泡膜内
在蛋白(tonoplast membrane intrinsic proteins, TIPs)
(Karlsson等 2000)、类Nodulin26 (NOD26)膜内在
蛋白(NOD26-like intrinsic proteins, NIPs) (Weaver
等1991)和小分子碱性膜内在蛋白(small basic intrin-
sic proteins, SIPs) (Chaumont等 2001)。植物水通
道蛋白在植物种子萌发、细胞伸长、气孔运动、
受精等过程中调节水分的快速跨膜运输(Chrispeels
等 2001)。植物水通道蛋白中有些呈组成型表达，
而大多数是受环境因子，如干旱、盐害、激素
和光质等诱导表达的，即植物水通道蛋白的表达
是受调控的。有研究表明，植物主要通过调控细
胞质膜水通道蛋白的表达消除水分供应中的波动
(Törnroth等 2006)。我们以 real-time PCR研究表
明，甘草(Glycyrrhiza uralensis F.)质膜水通道蛋
白GuPIP1的表达受干旱、ABA和NaCl的胁迫而
上调(Wa ng等 200 7)。本文从甘草叶中提取总
DNA，并用染色体步行技术克隆甘草GuPIP1基
因 5端上游调控区序列，以期能为确切了解甘草
GuPIP1基因的表达调控机制奠定基础。
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材料与方法
甘草(Glycyrrhize uralensis F.)种子购自内蒙古
赤峰市农科院。Universal GenomeWalker Kit购自
Clontech公司，其他试剂购自厦门泰京公司。大
肠杆菌 DH5α为本实验室保存。
甘草种子消毒后，于 40 ℃水中浸泡 12 h，
然后于 25 ℃恒温培养箱中暗催芽 3 d。胚根长至
0.5 cm时，移到光照培养箱中培养于Hoagland营
养液[5 mmol·L-1 Ca(NO3)2，5 mmol·L-1 KNO3，2
mmol·L-1 MgSO4，0.025 mmol·L-1 FeSO4-EDTA]
中，光 /暗为16 h/8 h，光照强度为 100 µmol·m-2·s-1，
昼夜温度为 24 ℃/22 ℃，相对湿度为 70%。培养
期间无任何水分胁迫。培养 30 d后取叶，参照
CTAB方法(姚伟等 2004)并稍加改进，提取甘草
中总基因组 DNA。
引物设计与合成参照我们克隆并已登录在Gen-
Bank中的GuPIP1基因的全长编码区 cDNA序列
(accession No. AY781788)，按照Universal Genome-
Walker Kit的要求设计 2个特异引物：引物 1：5-
AGCGGCTGTCTCTCCGGGAACTTGTTC-3和引物
2：5-GACACATCTTGTTCCTTCCCTTCCATC-3。
特异引物 1、2分别位于AY781788序列的120~146
和 84~110，由上海生物工程公司合成。
甘草GuPIP1基因的启动子扩增时，取 4个
1.5 mL的离心管，放入 2.5 µg甘草基因组DNA，
分别用 DraI、EcoRV、PvuI和 StuI进行酶切。
按Universal GenomeWalker Kit提供的方法对酶切产
物进行纯化。纯化后基因组DNA与GenomeWalker
Adaptors连接。依据Universal GenomeWalker Kit
提供的方法及反应条件，利用特异引物 1、引物
2分别与试剂盒提供的接头引物进行第 1轮和第 2
轮 P C R。
扩增片段与 pCR®2.1-TOPO® TA克隆载体连
接，得到 pCR®2.1-TOPO®-T-GuPIP1-P载体，转
化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α，筛选重组子
酶切鉴定，由上海生物工程公司测序。
GuPIP1基因启动子序列调控元件分析以植物
顺式调控元件数据库 PlantCARE和 PLACE完成。
结果与讨论
1 甘草GuPIP1基因上游DNA序列分离
用4个内切酶分别对甘草基因组DNA进行酶
图 2 酶切产物第 2轮 PCR电泳图谱
Fig.2 Gel electrophoresis of the secondary PCR products
using digested genomic DNA as templates
1：D r a I；2：E c o R V；3：S t u I；4：P v u I；M：分
子量标准。
图 1 甘草基因组DNA酶切电泳图谱
Fig.1 Gel electrophoresis of digested G. uralensis genomic DNA
1：D r a I；2：E c o R V；3：S t u I；4：P v u I；5：对
照(试剂盒提供)。
2 序列分析
测序后分析表明，获得GuPIP1基因启动子序
列 613 bp (图 3)。采用 Promoter predictions和
PlantCARE等软件进行基础启动子区及调控元件分
析的结果表明，该序列具有启动子的基本转录元
件：TATA-box位于-122、-488和-524处；CAAT-
box位于-90、-200、-242、-284和 -346处；
GATA-box位于-40、-226、-278、-526、-533和-569
处；此外还含有A-box和抑制子元件WRKY71OS
以及多个与非生物胁迫相关的顺式作用元件(表1)。
序列分析结果表明，所分离的启动子含有多
处 D P B F C O R E D C D C 3、M Y B 1 A T、
MYB2CONSENSUSAT和MYBCORE等元件，此
类元件均为干旱和脱落酸响应的顺式作用反应元
切，3个酶切完全(DraI、StuI和 PvuI)，1个酶
切不十分完全(图 1)。酶切产物经与接头连接，分
别作为 PCR扩增的模板，经过 2轮 PCR扩增后
EcoRV酶切的模板能扩增出特异条带(图 2)，该片
段经琼脂糖凝胶回收连接到pCR®2.1-TOPO® TA载
体上，筛选阳性克隆并测序。
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件，因此推测该启动子受干旱和ABA诱导表达。
这与我们通过 real-time PCR研究甘草质膜水通道
蛋白GuPIP1表达的结果(Wang等 2007)一致。此
外还有与光响应有关的顺式调节元件GA-motif和
I-box等及节律调控反应顺式元件 CIRCADIAN，
因此认为，该启动子可能是一个受日夜节律周期
调控的启动子。这些调控元件的真实性还有待进
一步证明。经数据库比对和查新还未见有该序列
的报道，已登录 GenBank (Accession No. EU
图 3 甘草GuPIP1基因启动子序列
Fig.3 Nucleotide sequence of cloned GuPIP1 gene promoter from G. uralensis
表 1 甘草GuPIP1基因启动子顺式元件预测
Table 1 Predicting cis-actingelements of the GuPIP1 gene promoter from G. uralensis
调控序列名称 位置(链) 序列 特性
TATA-box -122; -488; -524 TATA 距转录起始位点 30 个碱基的启动子中心元件
A-box -239(-) CCTGCC 顺式调控元件
WRKY71OS -451; -467 TGAC 抑制子元件　
ARE -220(-) TGGTTT 厌氧胁迫必需的顺式调控元件
AT1-motif -33(-) ATTAATTTTACA 光应答相关元件
Box 4 -27(+); -292(+) ATTAAT 光应答相关元件
CAAT-box -90(+); -200(+); -242(-); CAAT 启动子和增强子区的顺式调控元件
-284(+); -346(-)
GATA-box -40(+); -226(+); -278(-); GATA 启动子和增强子区的顺式调控元件
-526(+); -533(+); -569(+)
TCA-element -15(+); CAGAAAAGGA 水杨酸应答顺式调控元件
-6(-) CCATCTTTTT
GA-motif -10 AAGGAAGA 光应答相关元件
GT1-motif -127(-) GGTTAA 光应答相关元件
DPBFCOREDCDC3 -555(+) ACACNNG 干旱和脱落酸应答相关元件
MYB1AT -118 WAACCA 干旱和脱落酸应答顺式调控元件
MYB2CONSENSUSAT -531 YAACKG 干旱和脱落酸应答顺式调控元件
MYBCORE -83 CNGTTR 干旱和脱落酸应答顺式调控元件
I-box -41(+); -227(+) AGATAAG 光应答相关元件
MNF1 -368(+) GTGCCC 光应答相关元件
CIRCADIAN -384(+) CAANNNNATC 昼夜节律顺式调控元件
262597)。
总之，高等植物基因表达调控的研究已不断
深入，但干旱逆境胁迫诱导基因的研究还很少。
水通道蛋白在植物逆境应答中起作用，对其基因
受环境因子调控的研究越来越受到人们的关注。
而选择合适的特异性启动子是开展耐干旱和脱水转
基因研究的重要环节。获得诱导型的启动子以调
节抗旱基因的表达，方可以更有效的发挥目的基
因的作用，这对保持植物本身的抗逆性和生理状
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态来说是十分有利的。本文在这种思路的基础
上，开展甘草中质膜水通道蛋白 GuPIP1启动子
的克隆和其功能的初步分析结果，可能对甘草
GuPIP1基因的进一步研究和转基因研究选择启动
子有一定的参考价值。由于目前所获得的启动子
序列长度有限，我们正以染色体步行的方法，以
期获得更长的启动子序列，用突变和缺失的方法
对所预测调控元件的功能进行更深入的研究。
参考文献
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