全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1059
烟草黄酮醇合成酶基因的克隆及其序列分析
黄伟伟 杨曦 张常娥 方斌 马靓 常俊丽 杨广笑 何光源*
华中科技大学中英HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室, 武汉430074
提要 根据已知的黄酮醇合成酶 cDNA 保守序列设计引物，用 RT-PCR 技术从烟草叶片中扩增获得黄酮醇合成酶 cDNA
片段，再用 RACE 方法得到其两端序列。根据获得的序列，设计引物分离得到完整的 1 188 bp 的黄酮醇合成酶基因，其
开放阅读框编码 346 个氨基酸。序列分析显示，烟草黄酮醇合成酶与高杯花、矮牵牛和马铃薯的同源性分别为 87%、86%
和 84%，与其它物种中的同源性也在 80% 左右，表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性。此外，在氨基酸水
平上，该酶与其它依赖于 2- 酮戊二酸的双加氧酶及其相关酶也具有同源性。
关键词 烟草；黄酮醇合成酶基因；RACE；序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Flavonol Synthase Gene from Tobacco
(Nicotiana tabacun L.)
HUANG Wei-Wei, YANG Xi, ZHANG Chang-E, FANG Bin, MA Liang, CHANG Jun-Li, YANG Guang-Xiao, HE Guang-Yuan*
China-UK HUST-RRes Genetic Engineering and Genomics Joint Laboratory, Huazhong University of Science and Technology,
Wuhan 430074, China
Abstract According to the conserved cDNA sequence of flavonol synthase (FLS) gene, a pair of primers was
designed, and FLS was cloned from tobacco (Nicotiana tabacun L.) leaves using RT-PCR and RACE. The full
length cDNA sequence was 1 188 bp and it included a open reading frame (ORF) which encoded 346 residues.
Sequence analysis showed that homologies of FLS cDNA from tobacco with Nierembergia caernlea, Petunia
hybrida and Solanum tuberosum were 87%, 86% and 84%, and which among the others were about 80%. The
results indicated that FLS was highly stable in evolution of plants. On the other hand, it also had similarity with
other 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases on amino acids level.
Key words tobacco (Nicotiana tabacun L.); flavonol synthase gene; RACE; sequence analysis
收稿 2006-07-11 修定 　2006-11-16
资助 国家“973”项目(2002CB111302)子课题和国家自
然科学基金(30370807)。
*通讯作者(E-mail: hegy@hust.edu.cn, Tel: 027-87792271)。
黄酮类化合物(flavonoids)是一类天然存在于
植物中的多酚类次级代谢物，至今已被分离鉴定
出6 000多种(Harborne和Williams 2000)。它是
最普遍的，也是花卉之所以呈现各种颜色的一类
花色素。其中，花青素是黄酮类花色素中最重要
的一种。但花青素需与共存于植物体内的辅色素
一起方可呈现共色作用。在高等植物如烟草和矮
牵牛中，黄酮类化合物在果品着色、促进植物受
精、花粉管生长(Napoli 等 1999)、抗紫外辐射、
抵御病虫害、食品保健和医疗中都有作用
(Middleton等2000)。
黄酮类化合物的生物合成一直是植物次生代
谢基因工程中的一个重要研究课题，其生物合成
途径已比较清楚。黄酮醇是在黄酮醇合成酶
(flavonol synthase, FLS)的催化下，由二氢黄酮醇
转变而成。Britsch等(1981)用从欧芹细胞中提取
的酶作用于二氢黄酮醇，第 1 次体外检测到二氢
黄酮醇转变为黄酮醇。随后在紫罗兰(Spribille和
Forkman 1984)、矮牵牛(Petunia hybrida)
(Forkman等1986)、石竹(Forkman 1991)花蕾提取
物中也检测到FLS的活性。嗣后，Holton等(1993)
根据双加氧酶的保守序列设计简并引物，用 PCR
的方法从矮牵牛中分离出 FLS 编码基因。之后人
们又从其它物种中分离得到FLS 基因，如马铃薯
(Solanum tuberosum) (Van Eldik等1997)、高杯花
(Nierembergia caernlea)、月季、苹果和金鱼草
(Schwinn等 2006)等。
本文根据其它物种中 FLS 基因 cDNA 的保守
序列设计引物，采过 RT-P C R 和 RA C E 的方法，
从烟草(Nicotiana tabacum L.)叶片中分离得到了
F L S 基因，现报道如下。
材料与方法
烟草(Nicotiana tabacum L.)栽培于人工气候室
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中，按常规管理。大肠杆菌(Escherichia coli)
D H 5 a 菌株是我们验室保存的。R N A 提取试剂
Trizol购自Invitrogen公司，反转录酶购自Promega
公司。Taq DNA 聚合酶、DNA marker 购自北京
天为公司，凝胶回收试剂盒购自上海华舜公司，
dNTP 以及其它试剂均购自大连宝生物公司。
根据其它物种中 FLS cNDA 保守序列，设计
出 RT-PCR 引物 R1、R2，获得部分序列后，再
根据这部分序列设计特异性引物，包括 5 RACE
中反转录引物5GSP1，3 和 5 RACE PCR 扩增特
异性引物 3GSP1、3GSP2 和 5GSP2。另外。还
设计了 3 RACE 反转录引物 3AUAP、接头引物
3AAP，5 RACE 的上游引物 5AUAP、接头引物
5AAP。根据 3 和 5 RACE 的测序结果，设计引
物 F1、F2，扩增出 FLS 基因的全长。引物由北
京奥科公司合成(表 1)。
录酶，于 42℃温浴中放 2 h。
RT-PCR cDNA 合成的反转录引物为 3AUAP。
R T - P C R 扩增，其扩增体系为 5 0 mL：5 mL
10×PCR 缓冲液，1 mL 10 mmol·L-1 dNTP，3 mL
25 mmol·L-1 MgCl2，10 pmol·L-1 上下游引物各2
mL，Taq DNA 聚合酶 2 U，以 1 mL 反转录产物
为模板，加双蒸水至50 mL。反应条件为94℃预
变性5 min，然后于94℃中变性45 s，55~62℃
复性 45 s，72℃延伸 1 min，30 个循环。
3 RACE cDNA 合成的反转录引物为3AUAP。
3 RACE 扩增，以 cDNA 为模板直接进行第 1 轮
PC R 扩增，引物为 3AU A P、3GS P 1，然后再以
第 1 轮 P C R 产物为模板进行巢式 PC R，引物为
A A P、3 G S P 2，P C R 方法同前。
5 RACE cDNA 合成的反转录引物为 5GSP1。
反转录产物先用 RNaseH 分解 RNA-DNA 杂交体中
的RNA 链，然后再以 0.2 倍体积的10 mol·L-1 乙
酸铵和2.5倍体积的无水乙醇沉淀纯化，纯化后的
cDNA 用 TdT 酶和 dCTP 加尾。以加尾之后的 cDNA
为模板，5AUAP、5GSP1 为引物进行 5 RACE 第
1轮 PCR 扩增，然后以第1轮 PCR 的产物为模板，
5AAP 和 5GSP2 为引物进行巢式 PCR，PCR 方法
同 前 。
PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，回收
目的片段，连接 pMD 1 8 - T 载体(大连宝生物公
司)，转化大肠杆菌 DH5a，随机挑取 4 个阳性转
化子作菌落PCR 鉴定，测序由北京奥科公司完成。
用NCBI提供的程序进行序列拼接和开放阅读
框(open reading frame, ORF)寻找，拼接后的序列
进行BLAST相似性比较，用BioEdit 7.0进行序列
比对分析。
实验结果
1 烟草FLS基因部分同源片段的克隆
根据矮牵牛(GenBank登录号 Z22543)、马铃
薯(GenBank登录号 X92178)、高杯花 (GenBank登
录号AB078512)、月季(GenBank登录号AB038247)
和苹果(GenBank登录号 AY965343) FLS编码基因
高度保守序列设计引物 R1、R2，以烟草叶片总
RNA 的反转录产物为模板进行 RT-PCR，电泳检
测获得600 bp左右的特异行扩增条带(图1-a)。经
测序后，证明为 FLS cDNA 片段。
表1 FLS基因的引物序列
Table 1 Primer sequences of FLS gene
引物名称 序列
R 1 5 ATTTGTTCCATAAGATTTGGCC 3
R 2 5 ATCCTTGTACTTCTTGGTCTTG 3
3GSP1 5 CAGCAGGTGGTGAAGAAATA 3
3GSP2 5 TGGAGTTGTGGCCCATACAG 3
5GSP1 5 GCCTTGGACTTCATTTGGGAC 3
5GSP2 5 TAACCCAAGCCCAAGTGATAAG 3
3 A U A P 5 CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-poly (T) 17 3
3 A A P 5 CTGATCTAGAGGTACCGGATCC 3
5 A U A P 5 GGCCACGCGTCGACTAGTAC-poly (G) 10 3
5 A A P 5 GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3
F1 5 GCGTCTAGAATGAAAACAGCTCAAGCTCAG 3
F2 5 CGCGAGCTCTCACTGAGGAAGCTTGTTAAG 3
用烟草的叶片提取 R N A ，R N A 提取按照
Invitrogen公司Trizol试剂说明书进行，然后进行
反转录。反转录反应体系为20 mL：包括 9 mL焦
碳酸二乙酯(DEPC)处理水、2 mL 1.5 mg·mL-1烟草总
RNA、1 mL 10 pmol·L-1 反转录引物、4 mL 5× 反
转录酶缓冲液，2 mL 10 mmol·L-1 dNTP、1 mL 40
U·mL-1 RNase抑制剂和1 mL 200 U·mL-1 反转录酶 M-
MLV。先将 DEPC 处理水、RNA 和引物加入微量
离心管中，于 70℃中放置 5 min，使 RNA 打开
二级结构，再在冰中放置 5 min。然后依次加入
反转录酶缓冲液、dNTP、RNase 抑制剂和反转
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2 烟草 FLS 基因 cDNA 序列末端的扩增
通过 3 RACE、5 RACE 分别获得长约 500
bp、600 bp 左右的 2条特异性扩增条带(图 1-b、
c)，分别对这 2 条带进行测序，BLAST 分析结果
显示其为 FLS 末端序列。采用 NCBI 的开放读码
框寻找程序(ORF founder)确定该基因的ORF。至
此得到 1188 bp 的 FLS 基因 cDNA 全长序列，向
GenBank 递交序列，序列号为 DQ435530。
图 1 琼脂糖电泳检测PCR 产物
Fig.1 Agrose gel of electrophoresis of PCR product
　　1：PC R 产物；M：DN A 分子标记。a：RT -P C R 获得的 FL S c D N A 片段；b：3 R A C E 获得的 FL S c D N A 3 端片段；
c：5 RACE 获得的 FLS cDNA 5 端片段；d：RT-PCR 获得的 FLS cDNA 全长。
3 烟草 FLS 基因 cDNA 全长的扩增及序列分析
根据已经获得的完整 cDNA 序列，在起始密
码子和终止密码子区分别设计引物 F1、F2，参
考 pBI121 载体上的多克隆位点，并在 F1、F2 引
物的5 端分别加上XbaI、SacI酶切位点和保护碱
基，为后续在植物体中表达打下基础。以叶中总
RNA的反转录产物为模板扩增得到1.1 kb左右的
ORF 片段(图1-d)。测序结果表明，ORF 片段大小
为1 041 bp，编码 346 个氨基酸残基的多肽。序
列分析显示，烟草与其它 13 个物种的已知 FLS
c D N A 序列具有 8 0 % 左右的同源性，如与高杯
花、矮牵牛、马铃薯和洋桔梗的序列相似性系数
分别为 8 7 %、8 6 %、8 4 %、7 7 % 和 7 5 %，氨基
酸的同源性则更高(图 2)。
讨　　论
在所有的黄酮类化合物中，黄酮醇是分布最
为广泛的一类化合物。黄酮醇是黄烷酮的衍生
物，由 FLS 催化形成，FLS 是 2- 酮戊二酸依赖
性双加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase,
2-ODD)家族中的一员，黄酮类化合物合成途径中
的二氢黄酮 -3 b - 羟基化酶(fl a v a n o n e - 3 b-
hydroxylase, FHT)、花青素合成酶(anthocyanidin
synthase, ANS)都是属于这个家族。2-ODD需要氧
分子作为辅助底物，Fe2+、2- 酮戊二酸或者抗坏
血酸盐作为辅助因子(Springob等2003)，其编码
基因具有19%~75% 的保守性，正是由于这些保守
性的差异，因而2-ODD 各自具有不同的生物活性。
烟草FLS 与其它13个物种的FLS 氨基酸具有
80% 左右的同源性，其中有93 个氨基酸残基是完
全保守的。FLS同源性较高的区域主要位于C末端
(213~346个氨基酸残基)，具有85%的同源性，而
N末端(1~123个氨基酸残基)同源性只有60%左右。
将 F L S 氨基酸序列与不同功能的 2 - O D D
[(FHT、ANS、天仙子胺-6b-羟基化酶]及其相关
酶[1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC氧化酶)、赤
霉素 C20- 氧化酶、脱乙酰氧基头孢菌素 C 合酶
(DAOCS)、异青霉素N合成酶(IPNS)]的氨基酸序
列进行比较时见到，有 3 个高度保守的氨基酸区
域(图 2)，可能跟 2-O D D 的生物活性密切相关
(Wellmann等2002)，这些酶可能由同一基因进化
而 来 。
总之，FLS 基因在植物中非常保守，在植物
的花色和雄性不育中起作用(Forkmann和Martens
2001)。采用基因工程的手段反义或正义抑制FLS
基因，已经获得了转基因花卉(Nielsen等2002)，
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图2 烟草FLS氨基酸序列与14种植物中FLS氨基酸保守序列比对
Fig.2 Comparison of FLS polypeptide from tobacco with consensus sequence of FLS polypeptide from 14 varieties of plants
　　FLS-Tab 为烟草 FLS 氨基酸序列；FLS-Con 为 14 种植物中 FLS 氨基酸保守序列，这 14 种植物为烟草、矮牵牛、马铃薯、
高杯花、洋桔梗、欧芹、金鱼草、月季、苹果、葡萄、拟南芥、蜜桔、洋葱和银杏。F L S - C o n 序列中大写字母表示完全
保守，小写字母表示高度保守；划线部分与数据库中 64 种双加氧酶及其相关酶类的保守序列高度相似，在这 64 种酶中除了上
面的 14 种 FLS 以外，还包括 18 种 FHT、3 种 ANS、5 种赤霉素 C20- 氧化酶、1 种天仙子胺 -6b- 羟基化酶、11 种 ACC 氧化酶、
1 种 D A O C S、1 1 种 I P N S。
但尚未得到雄性不育系。一般来说，雄性不育系
是杂交育种的必要条件。所以本文结果对采用基
因工程手段调控 FLS 基因的表达，改变花色和获
得雄性不育系等来说，是有一定参考意义的。
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