全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 669
茉莉酸甲酯(MeJA)对贯叶连翘悬浮细胞生长和贯叶金丝桃素产量的影响
王保军 1, 张秀清 1, 孙立伟 1, 刘晓娜 2, 张京声 1, 孙君社 1,*
中国农业大学 1食品科学与营养工程学院, 2水利与土木工程学院, 北京 100083
提要: 培养基中添加 100 µmol·L-1 MeJA后, 贯叶连翘悬浮细胞生物量增加量和贯叶金丝桃素(HF)的产量分别是未经MeJA
处理的 1.3倍和 1.73倍; 培养 3 d时, 培养基中添加 100 µmol·L-1 MeJA能提高HF产量, 是未经MeJA处理的 2.4倍。
关键词: 贯叶连翘; 贯叶金丝桃素; 悬浮细胞; 茉莉酸甲酯
Effect of Methyl Jasmonate on Suspension Cells Growth and Hyperforin Pro-
duction of Hypericum perforatum L.
WANG Bao-Jun1, ZHANG Xiu-Qing1, SUN Li-Wei1, LIU Xiao-Na2, ZHANG Jing-Sheng1, SUN Jun-She1,*
1College of Food Science and Nutritional Engineering, 2College of Water Conservancy and Civil Engineering, China Agricultural
University, Beijing 100083, China
Abstract: The results showed that the application of 100 µmol·L-1 methyl jasmonate (MeJA) could promote the
accumulation of biomass and hyperforin (HF) contents in suspension cells, which were 1.3 times and 1.73
times higher than those in untreated suspension cells, respectively. Furthermore the production of HF were
significantly improved, which were 2.4 times higher than those in untreated suspension cells, when suspension
cells were treated with 100 µmol·L-1 MeJA after incubated for 3 days.
Key words: Hypericum perforatum L.; hyperforin; suspension cells; methyl jasmonate (MeJA)
收稿 2008-04-03 修定 2008-05-28
资助 国家自然科学基金(20 5 06 0 2 9)。
* 通讯作者(E -ma i l : su nj s h6 1 @1 6 3 . com ; T el : 0 1 0 -
6 2 7 3 7 5 0 1 )。
贯叶金丝桃素(hyperforin, HF)是贯叶连翘中的
主要成分之一, 它具有抗抑郁(Chatterjee等 1998)、
抗肿瘤(Schempp等 2002)、抗菌(Beerhues 2006)、
抗炎症和抗血管形成的作用, 能通过加强神经系统
中神经传递体的释放来调节神经系统(Medina等
2006), 因此越来越受到人们的关注。大田种植的
贯叶连翘容易受到病虫害、微生物和季节的影响,
产量和其中有用成分的含量不稳定(Murch等2000;
Southwell和 Bourke 2001)。植物组织培养技术可
以大量培养贯叶连翘细胞, 保证细胞生物量的增加,
还可以改变培养条件(Kirakosyan等2000)以调控和
提高细胞内目的产物的含量。
茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)作为一种
能够促进植物进行细胞防御应答和次级代谢产物合
成的化学诱导子, 对植物次级代谢物的生成有明显
促进作用(Ketchum等 1999; 曲均革等 2006; 罗建
平等 2006)。Sirvent和Gibson (2002)的研究表明,
在贯叶连翘小植株生长过程中添加 200 µmol·L-1
MeJA可显著提高植株内金丝桃素类物质的含量, 同
时植株内HF的含量也提高; Conceicao等(2006)的
研究表明, 经MeJA诱导的贯叶连翘悬浮细胞中一
系列类黄酮如倒捻子素、芒果苷、异槲皮素和毛
地黄黄酮的含量增高。
本文探讨MeJA对贯叶连翘悬浮细胞的生物量
和 HF积累的影响。
材料与方法
实验材料为从贯叶连翘(Hypericum perforatum
L . ) 种子获得的贯叶连翘组培苗。培养基为
MS+3%蔗糖 +0.6%琼脂。取生长 25 d的组培苗
上部幼嫩叶片诱导生成愈伤组织, 培养基为: 1/2 N
(硝酸钾 +硝酸铵) MS培养基 +0.4 mg·L-1 2,4-D; 培
养温度为(25±1) ℃; 光照时间为 16 h·d-1; 光照强度
为 40 µmol·m-2·s-1。培养 25 d将愈伤组织继代在
新鲜的继代培养基[1/2 N (硝酸钾 +硝酸铵) MS+
0.4 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT]上, 连续继代 3次。
取0.2 g结构疏松、性状均一和生长快的愈伤组织,
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放入装有 30 mL液体培养基[1/2 N (硝酸钾 +硝酸
铵) MS+0.4 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT]的100 mL
三角瓶中, 摇床振荡暗培养。培养条件: (25±1) ℃,
转速 120 r·min-1, 旋转半径 12 mm。悬浮细胞每
隔10 d继代一次, 接种量按新鲜培养基与原培养基
的比例为 3:1。实验所用贯叶连翘悬浮细胞已经
过 33代的继代培养, 具有稳定的形态特征和生长
速率。
MeJA用DMF (二甲基甲酰胺)溶解, 配制成
100 µmol·mL-1母液, 以 0.45 µm的滤膜过滤除菌。
分别将母液加到培养液中, 配制为 50、75、100
和 125 µmol·L-1的培养液。
测定HF时, 取稳定期悬浮细胞, 离心(9 600×g,
10 min), 沉淀经真空冷冻干燥 24 h后碾碎成粉末
状, 称取 0.5 g粉末, 加入 9.8 mL色谱甲醇和 0.2
mL吡啶。冰浴中超声波(JY-II超声波细胞粉碎机,
宁波新芝科器研究所)破碎提取, 超声条件为: 超声
时间 10 s、间隙时间 10 s、功率 300 W、超声
次数 30次。然后 9 600×g冷冻离心 15 min, 取上
清液经过0.45 µm有机系滤膜过滤后进行高效液相
检测(刘晓娜等 2007)。整个过程尽量在避光和低
温下进行, 以避免提取物的光和热分解。用Agilent
1200 系列高效液相色谱仪分析检测, 色谱柱为
Agilent XDB-C18 (4.6 mm×150 mm, 5 µm); 检测器为
G1314B可变波长检测器; 进样量为 20 µL。流动
相 75%乙腈(色谱纯, Fisher)和 25%水相(乙酸 -三
乙胺缓冲液, pH 6.5), 流速 1 mL·min-1, 检测波长为
290 nm。
以甲醇(色谱纯)溶解贯叶金丝桃素标品(HF, ≥
97.0%, 德国Alexis公司), 配制HF (2.5、5、10、
15、20、25、50、75和 100 µg·mL-1)标准溶液。
峰面积与标准溶液的标准方程为: Y=13.833X-
16.118, 相关性 R2≥ 0.999 [Y为峰面积, X为HF的
浓度(µg·mL-1)]。
经处理的贯叶连翘悬浮细胞冷冻离心(9 600×
g, 10 min)去除上清液, 收集细胞沉淀, 真空冷冻干
燥 24 h, 至恒重后, 称干量。
按公式: HF产量 =细胞干重(g·L-1)×HF含量
(mg·g-1),计算HF产量。
实验数据均采用 SAS 8.0 (Anova)进行差异显
著性分析(α=0.05)。
结果与讨论
1 贯叶连翘细胞的生长和HF合成
(1)图1显示, 贯叶连翘悬浮细胞的生长周期为
14 d, 2~5 d内细胞分裂生长快; 培养第 8天细胞生
物量达到最大; 之后细胞进入稳定期, 随着培养基
中糖类和一些营养成分的消耗, 细胞分裂生长减慢,
生物量基本上保持稳定; 后期细胞出现凋亡现象, 再
加上培养液随摇床的振动, 细胞裂解增加, 生物量
略有下降。细胞培养 10 d时转接入新鲜培养基中,
其细胞生长延滞期较短。
(2)细胞生长过程中, HF合成呈现一个动态的
变化过程。由于用稳定期的细胞接种, 其细胞内的
HF含量较高, 随着细胞生长的加快, HF的含量迅速
下降。第 4天的HF达到最低, 与悬浮细胞生长曲
线相对应, 第 4天时悬浮细胞生长最快, 生物量急
速增加。随着培养时间的增加, 细胞生物量增加变
慢, HF的含量开始增加。细胞生长到 12~14 d时
的 HF含量达到最大(图 1)。
2 MeJA对贯叶连翘悬浮细胞的生长和HF产量的
影响
MeJA能促进贯叶连翘细胞内HF含量的积累
(Sirvent和Gibson 2002)。
(1)不同浓度的MeJA对悬浮细胞生物量和HF
产量的影响不同。较低浓度MeJA对贯叶连翘悬
浮细胞生物量的影响不显著, 100 µmol·L-1 MeJA显
著促进悬浮细胞生物量积累, 细胞干重是不经MeJA
处理的 1.3倍。高浓度MeJA对细胞生物量积累的
促进不明显(图 2-a)。
图 1 贯叶连翘悬浮细胞的生长和HF的积累
Fig.1 Growth of H. perforatum suspension
cells and accumulation of HF
植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 671
(2)不同浓度MeJA都能促进细胞内HF积累,
浓度为 75 µmol·L-1和 100 µmol·L-1的MeJA显著
促进 HF 的积累(图 2 -b、c ) , 后者的积累量最
大 。
3 MeJA诱导的贯叶连翘悬浮细胞内HF含量变化
随着培养天数的增加, 添加100 µmol·L-1 MeJA
的悬浮细胞内HF的含量, 呈现先降后升的变化趋
势(图 3), 培养 4 d的含量降到最低。培养 8 d进
入稳定期, 经MeJA诱导的悬浮细胞内HF含量达到
最大, 比不经MeJA处理的提高 1.73倍。培养 14
d不经MeJA处理的悬浮细胞中HF含量达到最大
值 。
4 不同时间添加MeJA对贯叶连翘悬浮细胞生长
和HF产量的影响
在细胞生长的对数期, 添加MeJA对细胞内次
图 2 不同浓度MeJA对悬浮细胞生物量、
HF含量和产量的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of MeJA on
contents of biomass, HF and the production
of HF in suspension cells
图 3 贯叶连翘悬浮细胞中HF的积累
Fig.3 Accumulation of HF in H. perforatum suspension cells
级代谢产物的促进作用最明显(Qian等 2004; 曲均
革等 2006)。本实验在悬浮细胞生长的第 3天添加
100 µmol·L-1 MeJA, 培养14 d测定悬浮细胞生物量
的结果表明, MeJA显著的提高了细胞生物量, 是不
经MeJA处理的 1.1倍(图 4-a)。细胞培养的第 1、
图 4 培养后不同时间添加MeJA对悬浮细胞生物量、
HF含量和产量的影响
Fig.4 Effect of addding MeJA at different time on contents of
biomass, HF and the production of HF in suspension cells
植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月672
5和7天分别添加100 µmol·L-1 MeJA与第3天的细
胞生物量增加差异不明显, 而第 9和 11天添加, 则
加速细胞的凋亡和裂解, 以致细胞生物量比不经
MeJA处理的略有降低, 但在统计学上没差异。细
胞培养3 d时添加MeJA的HF含量和HF产量显著
提高, 是未经MeJA处理的 2.4倍。其他时间添加
MeJA的HF含量有不同程度的提高, 培养 1、7和
9 d添加MeJA的产量也高于不经MeJA处理的HF
产量(图 4 - b、c )。
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