全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 383
新疆3 种藜科盐生植物NHX 基因的克隆与序列分析比较
蔡伦 张富春* 马纪 李金耀 陈邦党 恩特马克·布拉提拜
新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046
Cloning and Sequence Analysis of NHX Genes from Three Species of Halo-
phytes from Xinjiang
CAI Lun, ZHANG Fu-Chun*, MA Ji, LI Jin-Yao, CHEN Bang-Dang, Entemark·Bulatibai
Key Laboratory of Molecular Biology, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Xinjiang Key Laboratory of
Biological Resources and Genetic Engineering, Urumqi 830046, China
提要 从新疆野生植物盐角草(Salicornia europaea)、盐爪爪(Kalidium foliatum)和盐穗木(Halostachys caspica)中分别克隆了
约 1.7 kb 的 NHX 基因 cDNA 片段，此片段均包含了 NHX 完整基因，三者之间有较高的同源性，盐角草 NHX 基因与盐爪
爪 NHX 基因同源性达 92.81%，盐角草与盐穗木同源性达 92.19%，盐爪爪与盐穗木同源性达 97.66%。它们与其它几种藜
科盐生植物如滨藜、碱蓬、灰绿藜的 NHX 基因同源性也很高，达到 80% 以上，与拟南芥同源性也达到 86%。此基因在
植物尤其是藜科盐生植物中高度保守，其编码的功能性蛋白可能在影响植物耐盐中起作用。
关键词 盐生植物; NHX基因; RT-PCR; 植物耐盐
收稿 2004-12-13 修定 　2005-03-20
资助 国家“863”项目(2004AA227110-2)、国家科技攻
关西部科技行动项目(2001BA901A32)和教育部春晖计
划项目。
*通讯作者(E-mail: zfc@xju.edu.cn, Tel: 0991-8583517)。
采用植物基因工程技术培育耐盐、耐旱植物
新品种是十分热门的研究课题，主要是从细胞膜
和分子水平上探讨植物耐盐的细胞生物学机制以及
提高作物抗盐性的途径。其内容包括盐生植物质
膜和液泡膜质子泵及 Na+、K+ 转运蛋白与细胞离
子稳态重建的机制，各种渗透调节剂相关的基
因、盐生植物质膜和液泡膜 Na+(K+)/H+ 逆向转运
蛋白、K+ 转运蛋白及 H+-ATPase、H+-PPase 等基
因克隆和功能分析，目的在于查明植物耐逆性的
应答过程和耐逆应答功能蛋白以提高植物耐逆性的
分子机制[1]，为培育作物耐盐新品种，开发利用
盐碱地提供新的植物资源材料。目前，已经证实
盐过敏感(salt overly sensitive，SOS)信号途径在
植物耐盐方面起着关键的调控作用，并同时控制
着离子的自身稳衡(homeostasis)[2]。这一信号通路
中Na+/H+ 逆向转运蛋白基因(NHX)备受人们关注，
它所编码的蛋白存在于植物细胞液泡膜上，可以
将Na+区隔化至液泡中，避免细胞质中的高Na+盐
毒害，维持高的K+/Na+ 比，达到离子平衡和渗透
平衡，以提高植物的盐耐特性，从而减轻或防止
植物生长受抑制等[3~5]。
盐角草、盐爪爪和盐穗木均为藜科(Chenopo-
diaceae)植物。盐角草为一年生草本，高 10~40
c m，在新疆分布较广，常生于水沟边缘、盐湖
周围和积水洼地的盐沼地段，呈小面积分布，根
际土土壤盐分 8.59% 条件下盐角草能良好生长，
属稀盐盐生植物；盐爪爪为小半灌木，高 20~50
c m，在新疆全疆有分布，生于洪积扇扇缘地带
及盐湖边的潮湿盐土、盐化沙地、砾石荒漠的低
湿处，在根际土土壤盐分 3.2 2 % 环境下生长良
好，在重度盐渍土上常形成优势群落或与盐穗
木、柽柳属植物共同组成群落，属稀盐盐生植
物；盐穗木为灌木，高 50~200 cm，在新疆全
疆分布，其生境土壤中强度盐渍化，土表常可见
到盐霜，属旱生、旱中生稀盐盐生植物。这些
植物对于利用野生耐盐碱基因来改良作物性状，
培育耐盐碱的作物品种有重要意义。Na+/H+ 反向
运输载体(NHX)是植物细胞液泡膜上的跨膜蛋白，
可以将 Na+ 在液泡中区隔化，可以避免高浓度的
Na+ 在细胞质中产生毒害。采用RT-PCR 技术从盐
角草、盐爪爪和盐穗木中扩增出 NHX 基因片段，
有助于探讨盐生植物的耐盐机制和培育出耐盐碱的
优良作物品种。
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月384
材料与方法
盐角草(Salicornia europaea)和盐爪爪
(Kalidium foliatum)为我们实验室培养的，盐穗木
(Halosta-chys caspica)采自新疆五家渠干旱盐碱地
区。大肠杆菌 D H 5 a 菌株为我们实验室保藏菌
种。pMD18-T 测序载体、RNA 提取试剂盒、PCR
产物回收试剂盒、DNA marker、BamHI和HindIII
限制性内切酶、exTaq 酶以及 RT-PCR 和 PCR 引
物均购自Takara公司。测序试剂盒购自美国PE公
司，其它试剂均为分析纯。
总 RN A 的提取依据操作试剂盒进行。
根据已发表的相关 NHX 基因序列，设计 7 对
PCR 引物，其中的 5 条引物序列为：2P1: 5
T TT CA AG TA AA AA AG A AG CA GT TT TT CC G 3 ;
3P1: 5 TCTTGCTATTGGTGCCATATTTGCTGC-
AACAGATTC 3; 1P2: 5 CCACGACCTCCAAA-
GACGGGTCGCAT 3; 2P2: 5 GGTTTGGTCAGCA-
TACCAAACACCA 3; 3P2: 5 ATCGTACTCGTG-
ATCATGATTGCATT 3。依照 TaKaRa RNA PCR
Kit 操作指南进行，反转录用Oligo(dT)作下游引
物，反应条件：42℃ 30 min, 99℃ 5 min，5℃ 5
min。PCR 反应用 NHX 基因序列设计特异性引物
(盐角草：3P1 和 2P2，盐爪爪：2P1 和 3P2，盐
穗木：3P1 和 1P2)。扩增参数：94℃ 2 min；
94℃ 30 s，52.5℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循
环；72℃ 10 min。反应产物进行琼脂糖凝胶电
泳检测。
根据已获得的核心片段设计 3 RACE 引物，
盐角草引物序列为：3P1: 5 GATCACGAGCAC-
TATAACTATTGTCC 3, 3P2: 5 GAGCTCC-
ATATTGCTTGGTTTACTCATG 3；盐爪爪引物
序列为：3P1: 5 TGACTGAGAGTTCAAGA-
GTAACCACCAAG 3, 3P2: 5 GCTGTGAG-
CTCCATATTGCTCGGTTTA 3; 盐穗木引物序列
为：3P1: 5 ACCCGTCTTTGGAGGTCGTG-
GAATC 3, 3P2: 5 TGATGTGGACAACCAGG-
ATGAAGGA 3; P4: oligo(dT)。依照TaKaRa 3-
Full RACE Core Set 操作指南进行。反转录用Oligo
dT-3 sites Adaptor Primer作下游引物，反应条
件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。PCR
反应用NHX基因序列特异性引物3 P2和3 sites
Adaptor Primer进行。扩增参数：94℃ 2 min；
94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min；35 个循
环；72℃ 10 min。反应产物进行琼脂糖凝胶电
泳检测。由于条带太多，用3 P1和3 sites Adaptor
Primer 进行半巢式PCR，模板为第 1次 PCR 反应
产 物 。
根据 GenBank 已发表的相关 NHX 基因序列，
在 5 端起始密码子处设计引物 P1：5 TCAGG-
ATCCATGTGGTCACAGTTAAGC 3，下游引物分
别为3种植物扩增核心序列的下游引物(盐角草：
2 P 2，盐爪爪：3 P 2，盐穗木：1 P 2 )，对 N H X
基因读码框5 端未知序列进行扩增。扩增参数：
94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min
30 s， 35个循环；72℃ 10 min。反应产物进行
琼脂糖凝胶电泳检测。
根据已获得的核心片段、5端序列和3 RACE
产物设计引物full P1: 和full P2 (盐角草: 5 CTCGGA-
T T C C C T G T C C T A T G T T C T G T C 3 ，盐爪爪：
5 GTCTCCGAATTCTCTCTCCTATGTTCTG 3，
盐穗木：5 TGTCGCTTAGCTTTCTTTTCTCA-
G T T C C 3)，进行PCR 反应。扩增参数：94℃
2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，35个
循环；72℃ 10 min。反应产物进行琼脂糖凝胶
电泳检测。
按Takara公司PCR Fragment Recovery Kit说
明书进行 P C R 产物的回收。回收的 N H X 基因
cDNA 片段与 pMD 18-T 载体在 T4 DNA 连接酶的
作用下 1 6 ℃过夜，使 N H X 基因 c D N A 连接到
pMD 18-T 的载体上。连接产物转化感受态细胞，
感受态的制备及转化按参考文献 6。
为鉴定克隆的 c D N A 序列，对 p M D 1 8 - T /
NHX 重组质粒进行纯化，并用 BcaBEST primer
RV-M和 BcaBEST primer M13-47 对盐角草、盐爪
爪和盐穗木NHX 基因 cDNA 在 PE377 全自动测序
仪进行双向 DNA 序列测定，所得序列用 PE 公司
SeqEd v1.0.3软件进行分析。
实验结果
1 NHX 基因全长序列的获得
利用提取的总RNA，以Oligo(dT)为引物进行
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 385
反转录得到单链 cDNA 为模板，再以设计的 PCR
引物进行扩增，得到NHX基因片段，长度为1 700
bp 左右。盐角草 NHX 基因 cDNA 命名为 SeNHX，
盐爪爪 NHX 基因 cDNA 命名为 KfNHX，盐穗木
NHX 基因 cDNA 命名为 HcNHX。RT-PCR 产物经
1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，与我们预计的大小一致
(图 1)。
2 盐角草、盐爪爪和盐穗木NHX cDNA 序列分析
对重组质粒用 BcaBEST primer RV-M 和
BcaBEST primer M13-47进行双向测序，SeNHX核
苷酸长度为1 683 bp，KfNHX核苷酸长度为1 683
bp，HcNHX 核苷酸长度为1 737 bp (图 2)。
3 序列同源性分析
用 D N A M A N 对盐角草、盐爪爪和盐穗木
NHX 基因与碱蓬、滨藜和灰绿藜等 NHX 基因进行
同源性分析显示，所克隆的 cDNA 为 NHX cDNA。
其中，盐角草与盐爪爪同源性达93.17%，盐角草
与盐穗木达87.64%，盐爪爪与盐穗木达93.05%。
与其它藜科植物如碱蓬同源性达 86%，与滨藜达
89% (图 3)。　
讨 论
一般认为，非生物胁迫是多基因控制的性
状，但通过转单基因的方法也能获得转基因耐盐
植株[7,8]。通过 RT-PCR 技术扩增盐角草、盐爪爪
和盐穗木 NHX 基因，对比前人已发表的 NHX 基
因序列设计引物，从盐角草、盐爪爪和盐穗木总
RNA 中扩增出目的片段。序列分析表明，NHX
基因在植物中尤其是藜科植物中是高度保守的，
它可能编码一种功能性蛋白。藜科植物属于三类
盐生植物(真盐生植物、假盐生植物和泌盐盐生植
物)中最耐盐的真盐生植物，具有特殊的适应性结
构，如叶肉质化，能大量吸收盐分并通过离子区
隔化将盐分局限于液胞以及老叶中，它们能大量
吸水以保持细胞膨压，稀释体内盐分，并通过老
叶或茎的脱落减轻盐分危害[9]。
液泡膜中的Na+/H+ 反向运输体可促进离子在
液泡中的分室效应，跨液泡膜的 pH 为其提供能
量。从拟南芥中分离出的 AtN H X 基因，与哺乳
动物NHE 反向运输体具有序列相似性[10,11]。在转
基因拟南芥和转基因西红柿中过量表达 AtNHX，
可在液泡膜中积累大量的运输体和极大地提高它们
的耐盐性[10,12]。拟南芥 NHX 基因在 NHX 基因突变
的酵母中表达，可以使酵母由盐敏感型转变为盐
耐受型[11]。水稻自身NHX 基因的过量表达也能提
高其耐盐性[13]。这些结果显示，AtNHX 基因家族
经离子液泡区隔化效应能较大程度上增强植物的耐
盐性，通过转化并过量表达 N H X 基因，对于增
强离子的转运能力、解除离子对细胞毒害、提高
植物盐耐受等方面有重要意义[8,13,14]。钠离子和氯
离子区隔化在液泡中，不仅可作为有效的渗透调
节剂，同时还可减小细胞毒性。植物细胞的生长
主要是由液泡体积的膨胀调控的，所以，钠离子
和氯离子的区隔化不仅有利于减轻离子毒害并进行
渗透调节，而且对细胞的发育也是必需的。
盐角草、盐爪爪和盐穗木是常见于新疆高度
图1 RT-PCR扩增产物的凝胶电泳
1: DL2000+15000 marker; 2: SeNHX(a), KfNHX(b), HcNHX(c)。
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月386
a. 盐角草
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b. 盐爪爪
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c. 盐穗木
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图 2 盐角草、盐爪爪和盐穗木 NHX 基因 cDNA 序列
植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 387
盐渍化地区的藜科植物，分别属于草本、小半灌
木和灌木，它们的耐盐性依序逐步减弱，表明草
本植物比灌木适应外界盐碱环境的能力更强。本
文克隆这 3 种藜科植物 NHX 基因，它们的序列有
较高的同源性。此外，这 3 种植物是新疆分布较
广的盐生植物，其中，盐角草已经被公认为世界
上最耐盐的植物。从序列比对分析可以看出，它
们的 NHX 基因相对于其他植物来说同源性更高和
系统进化关系更近，推测 NHX 基因在这 3 种植物
耐盐性中可能具有相同的作用，也为进一步深入
研究新疆盐生植物 NHX 的分子进化关系提供了基
础资料。
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图3 盐角草、盐爪爪和盐穗木与其它几种藜科
植物的 NHX 基因同源性比较和系统分析
　　a: 藜科植物 NHX 基因的同源性分析；b: 藜科植物 NHX 基
因的系统关系。