全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 705
小麦籽粒内AGPase质体型小亚基的克隆和序列分析
康国章, 沈丙权, 王永华, 刘超, 郭天财 *, 朱云集
河南农业大学国家小麦工程技术研究中心, 郑州 450002
提要: 文章从小麦籽粒中克隆了淀粉合成关键酶 AGPase的质体型小亚基(SSU II)的 cDNA序列。其中间部分与 3端序列
与大麦 SSU II (Z48563)的同源性高达 97%, 但在 5端特异的转移肽切割位点却比Z48563缺失一段 113 bp序列。本文克隆
的 SSU II其特异 5端序列与已报道的大麦(Z48563)、小麦(536819)、玉米(AF334960)进行多序列比对和同源性比较显示,
它们的亲缘关系较远, 表明这可能是一个新的SSU II基因。另外, 在检测的22个现今推广面积较大的小麦品种中, SSU II 5
端缺失序列的现象都普遍存在。
关键词: 小麦; 淀粉; AGPase; 质体型小亚基; 转移肽切割位点
Cloning and Sequence Analysis of Plastidial Small Subunit of AGPase in Grains
of Wheat (Triticum aestivum L.)
KANG Guo-Zhang, SHEN Bing-Quan, WANG Yong-Hua, LIU Chao, GUO Tian-Cai*, ZHU Yun-Ji
Engineering Research Center for Wheat, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstracts: A cDNA sequence of 1 631 bp encoding plastidial small subunit (SSU II) gene of AGPase (GenBank
No. EU586278), was cloned by RT-PCR in grains of wheat. Sequence analysis showed that wheat SSU II was
83.2% identical to barely SSU II (Z48563) in the full sequences, and 97% identical in their middle and 3 regions.
Compared with SSU II (Z48563), there was a lack of a sequence of 113 bp in the unique 5 region. The multiple
sequences alignments and homology comparison of the unique 5 region of cloned SSU II of wheat AGPase with
barely (Z48563), wheat (AF536819) and maize (AF334960) were carried out, respectively. The results showed
that the cloned wheat SSU II didn t fall these species, suggesting that it could be a novel SSU II of AGPase. In
addition, the lack of cDNA sequences in unique 5 region of SSU II were all found in 22 wheat cultivars, which were
broadly croped.
Key words: wheat; starch; AGPase; plastidial small subunit; transit peptide cleavage site
收稿 2008-05-04 修定 2008-07-11
资助 中国博士后科学基金(20060390773)和河南省教育厅自
然科学基金(20 06 21 0 00 7)。
* 通讯作者(E-ma i l : gmzx-gu o@3 7 1.net ; T el : 03 7 1 -
6 3 5 5 8 2 0 1 )。
在作物淀粉合成过程中, ADPG焦磷酸化酶
(adenosine 5 diphosphate glucose pyrophosphorylase,
AGPase)的作用是将来自光合作用的葡萄糖 -1-磷
酸(G-1-P)和ATP转变成ADP葡萄糖(ADP-Glc)和
ADP, 其中ADP-Glc是合成淀粉的底物, 因此认为
AGPase是合成淀粉的关键酶(Linebarger等 2005)。
细胞内 AGPase分为胞质型(cytosolic)和质体型
(plastidial)两种, 每种均是由成对的两个大、小亚
基构成的异源四聚体(Morell等 1987; Bhave等
1990)。因此, 在植物细胞内AGPase存在着 4种亚
基: 即胞质型小亚基(cytosolic small subunit, SSU
I)、质体型小亚基(plastidial small subunit, SSU II)、
胞质型大亚基(cytosolic large subunit, LSU I)和质体
型大亚基(plastidial large subunit, LSU II) (Tetlow等
2004)。大亚基是酶的调节中心, 而小亚基是酶的
催化中心, 是酶别构效应的关键部位(Johnson等
2003)。大亚基分子量为 51~60 kDa, 小亚基分子
量为50~55 kDa, 二者之间的进化关系非常近(Doan
等 1999)。
不同植物细胞内, 编码 SSU I和 SSU II的基
因有差异。在玉米胚乳细胞内, 二者由 2个不同基
因所编码(Giroux和Hannah 1994)。但在大麦胚乳
细胞内, 二者是由同一个基因所编码, 只是第一个
外显子起始位点的不同, 造成二者cDNA长度有所
差异(Thorbjφ rnsen等 1996)。因此二者 cDNA序
列相似性超过 90%, 但 SSU II的 5端比 SSU I多一
个转运肽剪切位点(transit peptide cleavage site, 259
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bp), 这一切割位点认为是此亚基进入质体中的重要
识别位点, 所以SSU II的 cDNA序列稍长于SSU I。
小麦 S S U I 的 c D N A 克隆( G e nB a nk 登录号
AF492644、X66080、AF244997和 EF405961)已
有所报道(Ainsworth等 1993)。但对小麦 SSU II来
说, 其DNA序列(AF536819)仅Burton等(2002)作过
报道, 并克隆出其特异的 5端序列, 认为它与大麦
的 SSU II序列同源性非常高(95%以上)。本文分
离出一个小麦 SSU II的 cDNA全长, 其特异 5 端
与上述报道有较大差异, 认为它可能是一个新的
SSU II基因, 在中国小麦品种中普遍存在。
材料与方法
植物材料为黄淮麦区大面积推广的小麦
(Triticum aestivum L.)品种 ‘偃展4110’、‘豫农949’、
‘豫麦 34’、‘郑麦 9023’、‘豫农 202’、‘新麦 9号 ’、
‘矮抗 58’、‘ 洛麦 21’、‘周麦 18’、‘ 周麦 17’、
‘豫麦 49’、‘豫教 2号 ’、‘兰考矮早 8’、‘烟农 15’、
‘陕优 225’、‘小偃 81’、‘开麦 18’、‘内乡 188’、
‘漯麦 4号 ’、‘济麦 20’、‘豫麦 18’和 ‘鲁麦 22’以
及大麦(Hordeum vulgare L)品种 ‘豫大麦 1号 ’、‘驻
大麦 1号 ’、‘驻大麦 3号 ’和 ‘晋引 6号 ’。实验于
2006~2007年在河南农业大学科教示范园区进行。
试验地状况和管理均按马冬云等(2007)文中的方
法。
取上述小麦和大麦品种花后 20 d左右穗中部
的幼嫩籽粒(2 g左右), 去掉胚后, 置于液氮中, 研
磨至粉末状, 用 Trizol (Sigma公司)提取总 RNA。
cDNA合成参照M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit
(MBI公司)操作步骤进行。
根据GenBank中大麦 SSU II的 cDNA序列
(Z48563), 设计一对克隆小麦SSU II 5 端特异序列
的引物(P1): 5 GCCTCCCCTTCCAAGAT 3 (正向
引物)和 5 TGGAGTCTGACACGGCAC 3 (反向引
物) (扩增位点在 Z48563序列的 35~221 bp之间);
另外, 还设计一对扩增 SSU II cDNA全长的引物
(P2): 5 CCACCTCAATGGCGATGGC 3 (正向引物)
和 5 CCAGGGGCACTTCGCGTAA 3 (反向引物)
(扩增位点在 Z48563序列的 9~1 749 bp之间)。引
物均由北京奥科生物技术有限公司合成。
PCR扩增体系为 3 µL 10×PCR缓冲液、0.6
µL 10 mmol·L-1 dNTP、10 µmol·L-1正向和反向引
物各 1 µL、0.5 µL 2 U·µL-1 Taq DNA聚合酶、1
µL cDNA模板, 无菌双蒸水补充至 30 µL。PCR
扩增程序为95℃变性5 min; 95 ℃ 50 s, 56 ℃ 1 min,
72℃ 2.5 min, 35个循环; 72℃延伸 10 min。
将获得的 SSU II全长经T4 连接酶(MBI公司)
与 pMD20-T (大连宝生物公司)连接后, 转化大肠
杆菌DH5α, 经菌落PCR和质粒酶切鉴定为阳性的
单克隆进行测序。
上述阳性克隆由上海英骏生物技术有限公司
测序。测序结果在NCBI数据库(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/blast/)上进行同源性比较分析。
实验结果
1 小麦SSU II cDNA全长的克隆以及与大麦SSU II
比较
以小麦品种 ‘豫教2号 ’和大麦品种‘晋引6号 ’
籽粒RNA为模板, 用材料与方法中提供的扩增SSU
II cDNA全长的特异引物, 进行 RT-PCR扩增并电
泳的结果显示, 从大麦中克隆出 SSU I I 基因的
cDNA序列长度稍大于小麦中的 SSU II (图 1)。
测序结果表明, 从大麦中克隆出的 SSU I I
cDNA序列长度为1 741 bp, 与预期大小相同; 但从
小麦中克隆出的SSU II cDNA序列长度为1 631 bp。
序列分析显示, 大麦 SSU II的编码域长度为 1 542
bp, 小麦 SSU II编码域长度为 1 428 bp (图 2), 并将
小麦的 SSU I I 到 GenBank上登录, 序列号为
EU586278。
图 1 小麦和大麦籽粒中 SSU II cDNA全长的扩增
Fig.1 Amplification of cDNA sequences of SSU II genes
from grain of wheat and barely
M: DNA分子量标准; 1: 大麦 ‘晋引 6号 ’ 籽粒 SSU II 的
cDNA序列; 2 : 小麦 ‘豫教 2号 ’籽粒 SSU II的 cDNA序列。
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图 2 小麦 SSU II 与大麦 SSU II、小麦 SSU I 之间 5端特异 cDNA序列的比较
Fig.2 Comparisons on the unique 5 cDNA sequences of SSU II from wheat, barely and SSU I from wheat
Z48563: 大麦 SSU II的 cDNA序列; EF405961: 小麦 ‘豫教 2号 ’SSU I的 cDNA序列; a: 小麦品种 ‘Bobwhite’ SSU II 5端特异
的 cDNA序列(Burton等 2002); EU586278: 小麦 ‘豫教 2号 ’SSU II的 cDNA序列。下划线部分为 SSU II 5端特异的 cDNA序列;
P1 primers为扩增 SSU II 5端特异的 cDNA序列, 在大麦中, 扩出 SSU II 5 187 bp的一段 cDNA序列, 在小麦中，扩出 SSU II 5端
74 bp的一段 cD NA 序列。同源碱基以阴影显示。EU58 62 78、EF40 59 61 和 Z4 85 63 的中间序列与 3 端序列相同, 图略。
本文所克隆的小麦SSU II与Z48563的同源性
为 83.2%; 在中间及 3端序列, 二者的同源性高达
97%。但特异的 5端差异较大, 序列比对后发现,
本文所克隆的小麦 SSU II的 cDNA序列在 5端比
Z48563序列少 113 bp, 缺失长度高达 40%左右(图
2)。为了更清晰地显示这一差异, 我们设计一对专
门用于扩增 SSU II 5端的引物(引物序列见材料与
方法)。电泳结果显示, 从大麦品种 ‘晋引 6号 ’籽
粒 cDNA中扩增出预期的条带(187 bp); 而从小麦
品种‘豫教2号’籽粒cDNA中扩增出的条带(74 bp),
明显小于大麦的(图 3)。
采用软件DNAMAN 3.0预测小麦和大麦SSU II
cDNA序列所编码的蛋白质的结果显示, 大麦SSU II
编码 513个氨基酸, 而小麦 SSU II编码了 475个氨
基酸。在线分析预测的蛋白质(http://www.expasy.
org /cgi-bin/protparam), 发现大麦 SSU II的分子量
为56.05 kDa, 推测的等电点(pI)为6.11; 而小麦SSU
II的分子量为 52.01 kDa, 推测的等电点为 5.48。
虽然二者所编码蛋白质的分子量有一定差异, 但对
二者保守区域分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
structure/cdd/wrpsb.cgi)的结果表明二者均属于
图 3 小麦 ‘豫教 2号 ’ 和大麦 ‘晋引 6号 ’ 籽粒内SSU II
特异 5 端 cDNA序列的扩增
Fig.3 Amplification of the unique 5 cDNA sequences of
SSU II in grain of wheat ‘Yujiao 2’ and barely ‘Jinyin 6’
M: DNA分子量标准; 1和 2: 小麦 ‘豫教 2号 ’籽粒内 SSU
II特异 5 cDNA序列; 3和 4: 大麦 ‘晋引 6号 ’籽粒内 SSU II特
异 5 端 cD N A 序列。
AGPase小亚基家族。
将克隆的小麦 E U 5 8 6 2 7 8 的 5 端与大麦
(Z48563)、小麦(536819)、玉米(AF334960)进行
多序列比对, 并用DNAMAN得出它们之间同源进
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化树状图的结果(图4)显示, 本文所克隆的小麦SSU II
(EU586278)与它们之间的亲缘关系较远, 表明我们
所克隆SSU II序列与上述基因序列差异较大, 可能
是一个新的 SSU II基因。
此外, 本文所克隆的EU586278序列与我们已
克隆出的小麦 SSU I cDNA序列(EF405961)及
GenBank上报道的其它小麦 SSU I cDNA序列
(AF492644、X66080、AF244997和 EF405961)相
比, 其中间序列与 3 端之间的同源性在 95%以上
(图 2显示的仅是EU586278和EF405961序列比对
的结果, EU586278与其它序列比对的结果与此相
同, 图略); 但 EU586278的 5端与上述几个序列显
著不同, 它们之间的同源性非常低。这表明, 与大
麦相似, 小麦中的 SSU I和 SSU II也是由一个基因
编码的, 可能是第一个外显子的不同, 以致二者之
间的 cDNA序列有一定的差异。
2 中国其它小麦品种中 AGPase SSU II的 5端
cDNA特异序列的扩增
为研究上述克隆的特异 SSU II基因序列是否
在中国其它小麦品种上也有此特征, 除 ‘豫教 2号 ’
外, 我们还选用现今黄淮麦区大面积推广的 ‘偃展
4110’、‘豫农 949’、‘豫麦 34’、‘郑麦 9023’、
‘豫农 202’、‘新麦 9号 ’、‘矮抗 58’、‘洛麦 21’、
‘周麦 18’、‘周麦 17’、‘豫麦 49’、‘鲁麦 22’、
‘兰考矮早 8’、‘烟农 15’、‘陕优 225’、‘小偃
81’、‘ 开麦 18’、‘ 内乡 188’、‘ 漯麦 4 号 ’、‘
济麦 20’和 ‘豫麦 18’等 21个小麦品种, 扩增它们
籽粒内 SSU II 5 端特异的 cDNA序列, 并用 ‘豫大
麦 1号 ’、‘驻大麦 1号 ’和 ‘驻大麦 3号 ’3个大麦
品种作对照的结果(图 5)显示, 与 ‘豫教 2号 ’相同,
从 ‘偃展 4110’、‘豫农 949’、‘豫麦 34’等 21个
小麦品种均扩增出 74 bp的 SSU II 5 端特异 cDNA
条带, 与 ‘晋引 6号 ’相似, 从 ‘豫大麦 1号 ’、‘驻
大麦 1号 ’和 ‘驻大麦 3号 ’中均扩增出 187 bp的
SSU II 5 端特异 cDNA条带。这表明, 中国现今
小麦品种中广泛存在着本文所克隆的SSU II基因。
讨　　论
大麦的 SSU I和 SSU II是由同一基因所编码,
只是由于第一个外显子的不同, 造成两个基因转录
序列的差异。与 SSU I cDNA序列相比, 大麦的
SSU II (Z48563)在 5 端多了一个由 259 bp编码的
图 4 4个 SSU II基因 5端 cDNA特异序列的系统树状图
Fig.4 Dendrogram of the unique 5 cDNA sequences
from four SSU II genes
图 5 21个小麦品种和 3个大麦品种籽粒内 SSU II基因 5 端 cDNA特异序列的扩增
Fig.5 Amplification of the unique 5 cDNA sequences of SSU II from grains of 21 wheat cultivars and 3 barely cultivars
M: DNA分子量标准; 1、2和 3分别为 ‘豫大麦 1号 ’、‘驻大麦 1号 ’和 ‘驻大麦 3号 ’籽粒内 SSU II基因 5 cDNA特异序列;
4 ~ 2 4 分别为 ‘ 偃展 4 1 1 0 ’、‘ 豫农 9 4 9 ’、‘ 豫麦 3 4 ’、‘ 郑麦 9 0 2 3 ’、‘ 豫农 2 0 2 ’、‘ 新麦 9 号 ’、‘ 矮抗 5 8 ’、‘ 洛麦 1 号 ’、
‘ 周麦 1 8 ’、 ‘ 周麦 1 7 ’、 ‘ 豫麦 4 9 ’、 ‘ 鲁麦 2 2 ’、 ‘ 兰考矮早 8 ’、 ‘ 烟农 1 5 ’、 ‘ 陕优 2 2 5 ’、 ‘ 小偃 8 1 ’、 ‘ 开麦 1 8 ’、
‘内乡 188’、‘ 漯麦 4 号 ’、‘ 济麦 20 ’ 和 ‘ 豫麦 18 ’ 等 21 个小麦品种籽粒内 SSU II 基因 5 cDNA特异序列。
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转移肽切割位点, 因此造成这两个不同基因 cDNA
序列长度的不同(Thorbjφ rnsen等 1996)。本文从
小麦 ‘豫教 2号 ’籽粒中所克隆的APGase SSU II
的 cDNA序列(EU586278) (图 1), 其中间序列及
3 端与已报道从同一品种中克隆出的 S S U I
(EF405961)同源性非常高(图2), 这表明小麦与大麦
相似, SSU I和SSU II均由同一基因编码, 只是由于
第 1个外显子的不同, 才出现 2个不同的转录子。
Burton等(2002)根据大麦的 SSU II序列, 从小麦品
种 ‘Bobwhite’克隆出 SSU II特异的 5 端转移肽切
割位点的 cDNA序列, 并用嵌套式 PCR法克隆出
DNA序列(AF536819), 观察到它与大麦此基因
(Z48563)的同源性非常高, 且 5端转移肽切割位点
的 cDNA序列与大麦此段序列的长度基本相同(图
2)。但在本文所克隆的 SSU II cDNA序列的 5端
转移肽切割位点处, 则比大麦的SSU II (Z48563)和
Burton等(2002)克隆小麦的 SSU II 5端特异 cDNA
序列均缺失一段 113 bp序列(图 3), 仅有146 bp, 缺
失长度高达40%左右, 因而它们之间的亲缘关系较
远(图 4)。并且这一缺失在本文所检测的 22个小
麦品种中普遍存在(图 5)。由于缺失这段序列位于
编码域内, 所以本文所克隆小麦的SSU II亚基分
子量(52.01 kDa)小于大麦的 SSU II (56.05 kDa)。
今后的研究是克隆本文所用小麦品种籽粒内SSU II
和SSU I基因共有的DNA序列, 并将其与AF536819
进行比较, 进一步寻找某一碱基位点的突变, 是否
会导致 5 端转移肽切割位点 cDNA的一段序列缺
失。另外, 将本文所克隆的SSU II基因(EU586278)
和大麦的SSU II基因(Z48563)共同转到大肠杆菌中,
高效表达后, 提取其表达的蛋白质, 并在相同底物
的条件下研究此段序列的缺失是否会导致AGPase
的活性差异。
参考文献
马冬云, 郭天财, 查菲娜, 王晨阳, 朱云集, 王永华(2007). 种植密
度对两种穗型冬小麦旗叶氮代谢酶活性及籽粒蛋白质含量
的影响. 作物学报, 33: 514~517
Ainsworth C, Tarvis M, Clark J (1993). Isolation and analysis of
a cDNA clone encoding the small subunit of ADP-glucose
pyrophosphorylase from wheat. Plant Mol Biol, 23 (1):
23~33
Bhave MR, Lawrence S, Barton C, Hannah LC (1990). Identifi-
cation and molecular characterization of Shrunken-2 cDNA
clones of maize. Plant Cell, 2: 581~588
Burton RA, Johnson PE, Beckles KM, Fincher GB, Jenner HL,
Naldrett MJ, Denyer K (2002). Characterization of the genes
encoding the cytosolic and plastidial forms of ADP-Glucose
pyrophosphorylase in wheat endosperm. Plant Physiol, 130:
1464~1475
Doan DNP, Rudi H, Olsen OA (1999). The allosterically unregu-
lated isoform of ADP-glucose pyrophosphorylase from bar-
ley endosperm is the most l ikely source of ADP-glucose
incorporated into endosperm starch. Plant Physiol, 121:
965~975
Giroux MJ, Hannah LC (1994). ADP-glucose pyrophosphorylase
in shrunken-2 and brittle-2 mutants of maize. Mol Gen Genet,
243: 400~408
Johnson PE, Patron NJ, Bottrill AR, Dinges GR, Fahy BF, Parker
ML, Waite DN, Denyer K (2003). A low-starch barley mutant,
Risaφ16, lacking the cytosolic small subunit of ADP-glucose
pyrophosphorylase, reveals the importance of the cytosolic
isoform and the identity of the plastidial small subunit. Plant
Physiol, 131: 684~696
Linebarger CRL, Boehlein SK, Sewell AK, Shaw J, Hannah C (2005).
H ea t s t a bi l i t y of ma i ze e nd o sp e r m A D P -gl u c os e
pyrophosphorylase is enhanced by integration of a cysteine
in the N terminus of the small subunit. Plant Physiol, 139:
1625~1634
Morell MK, Bloom M, Knowles V, Preiss J (1987). Subunit struc-
ture of spinach leaf ADP glucose pyrophosphorylase. Plant
Physiol, 85: 182~187
Tetlow IJ, Morell MK, Emes MJ (2004). Recent developments in
understanding the regulation of starch metabolism in higher
plants. J Exp Bot, 406: 2131~2145
Thorbjφnsen T, Villand P, Kleczkowski LA, Olsen OA (1996). A
single gene encodes two different transcripts for the ADP-
glucose pyrophosphorylase small subuni t from barley
(Hordeum vulgare). Biochem J, 313: 149~154