全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 325
硒对盐胁迫下耐盐常夏石竹生物量和渗透物质含量的影响
王长泉1,* 刘涛2
山东理工大学1 基建处，2 生命科学学院，山东淄博 255049
提要 培养基中加施适量外源硒能够显著提高能耐盐的常夏石竹生物量，过氧化物酶(POD)活性，K+/ Na+比值，K+、Na+、
叶绿素和游离脯氨酸含量；降低质膜透性和可溶性糖含量；植株叶细胞质膜和液泡膜 V-H+-ATP 酶的活性增加。
关键词 常夏石竹；硒；耐盐；渗透物质；V-H+-ATP 酶活性
Effects of Selenium on Biomass and Osmoregulator in Salt-tolerant Dianthus
plumarius Under Salt Stress
WANG Chang-Quan1,*, LIU Tao2
1Department of Basical Construction, 2College of Life Science, Shandong University of Technology, Zibo, Shandong 255049, China
Abstract Salt-tolerant Dianthus plumarius variants were cultured in MS medium added 0.5% NaCl combined
with different concentrations of selenium to study the effect of selenium nutrition on biomass and the osmo-
regulator content and some other physiological indexs. Increase of selenium supply in the medium could signifi-
cantly enhance the biomass, proline content, peroxidase (POD) activity, ratio of K+ and Na+, absolute contents
of K+ and Na+, leaf plasmalemma and tonoplast V-H+-ATPase activity, while the cell memberane permeability and
soluble sugar content decreased in salt-tolerant Dianthus plumarius variants.
Key words Dianthus plumarius; selenium; salt-tolerant; osmoregulator; V-H+-ATPase activity
收稿 2004-09-10 修定 　2005-01-17
资助 山东理工大学科研基金项目(4040-304037)。
*E-mail: whitewater7006@sina.com
硒作为微量营养元素，特别是作为抗氧化
剂，在植物抗逆中的作用愈来愈受到人们的重
视[1~4]。其生理作用主要表现为：它是一些酶如
谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、磷脂过氧化氢谷胱
甘肽过氧化酶(PHGPX)的辅助因子，并促进这些
酶的活性而起到清除氧自由基的作用；以原料的
形式直接参与蛋白质的合成；为生物体内一种
tRNA链的组成成分，转运氨基酸以合成蛋白质以
及硒本身对不同活性氧的直接非酶促清除作用[1~5]。
本文检测了不同施硒量下能耐盐的常夏石竹生物量
和渗透物质含量变化，观察盐分胁迫下施加适量
外源硒对耐盐的常夏石竹渗透调节的影响，以期
能为研究硒提高植物抗逆性的机制提供参考。
材料与方法
常夏石竹(Dianthus plumarius)试管苗由山东理
工大学组培室提供。
耐盐常夏石竹植株的诱导采用王长泉等[6]的方
法：取常夏石竹试管苗的叶片经1.29×108 C·kg-1
的 g-射线处理后接种在MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2
mg·L-1 NAA+0.5% NaCl 的培养基中诱导不定芽，
连续选择 6 轮，获得能耐 0.5% NaCl 的不定芽，
将不定芽转入MS+0.4 mg·L-1 IBA 培养基上生根，
获得能耐盐植株。培养基中蔗糖浓度为30 g·L-1，琼
脂为6.5 g·L-1，培养的光照度为16~24 mmol·m-2·s-1，
光照时间10~12 h·d-1，于室温[(20±2)℃]中培养。
取耐盐的常夏石竹叶片转移到MS+2.0 mg·L-1 6-
BA+0.2 mg·L-1 NAA+0.5% NaCl+0.1、0.2、0.4、0.6
mg·L-1 Se 培养基中诱导不定芽及 MS+0.4 mg·L-1
IBA+0.5% NaCl+0、0.1、0.2、0.4、0.6 mg·L-1
Se 的培养基中再生植株，培养条件同上。一个半
月后取再生植株及其叶片测定各种生理指标，每
项指标重复 3 次。游离脯氨酸含量采用茚三酮比
色法测定[7]; K+、Na+含量采用火焰光度法测定[7];
可溶性糖含量采用 80% 乙醇提取后蒽酮比色法测
定[7]; 叶绿素含量测定用丙酮比色法[7]; 过氧化物酶
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(peroxidase, POD)活性以愈创木酚作底物，721型
可见分光光度计上测定反应液在470 nm波长下的
消光度[7]; 细胞质膜透性测定用电导法[7]。
制备细胞质膜和液泡膜微囊参照文献8和9的
方法并加以修改。分别取耐盐的常夏石竹和未经
盐处理的植株功能叶片30 g，洗净后置于捣碎器
中，加入60 mL预冷的匀浆缓冲液[含有50 mmol·L-1
的Hepes-Tris (pH 8.0)、3 mmol·L-1的乙二醇双(2-
氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、3 mmol·L-1 的 MgSO4、
0.5% (W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2 mmol·L-1 的
二硫苏糖醇(DTT)、0.2 mmol·L-1 的苯甲基磺酰氟
(PMSF)、5% (V/V)甘油]，并加入一定量的甘露
醇，使溶液与叶片的渗透势相等，8 次高速捣碎
(3 s·次-1，2次之间相隔10 s)，捣碎后用4层纱
布过滤，取滤液以13 000×g离心15 min (Beckman
45 Ti)除去线粒体、叶绿体及其他细胞碎片。取
离心后的上清液以80 000×g离心30 min，离心后
的沉淀用尖头细毛笔小心搅起并悬浮在18 mL的悬
浮液(含0.25 mol·L-1甘露醇的匀浆液)中，匀浆器
混合后，小心地把这种浓缩的膜微囊铺在 2 4 %
(W/W, 3 mL)∶34% (3 mL)∶41% (4 mL)蔗糖梯度
溶液[含 5 mmol·L-1 的 Hepes-Tris (pH 6.5)、
1 mmol·L-1的DTT]的表面，以100 000×g (Beckman
SW 40Ti)离心2 h后用吸管小心收集0%与24% 界
面的白色物质(液泡膜微囊)及 34% 与 41% 界面的
淡黄色物质(细胞质膜微囊)，用含有3 mmol·L-1
EGTA、10 mmol·L-1 的 Hepes-Tris (pH 6.5)、
1 mmol·L-1 的 DTT、30 mmol·L-1 的 MgSO4、0.2
m m o l ·L -1 的 PMS F 的稀释液稀释 3~5 倍，再以
100 000×g (Beckman 65Ti)离心30 min。离心后的
沉淀用尖头细毛笔小心搅起并悬浮在储存液[含有
40% 甘油、2 mmol·L-1 的 DTT、30 mmol·L-1 的
MgSO4、10 mmol·L-1的 Hepes-Tris (pH 6.5)]中，
用匀浆器混匀后分装于0.5 mL Eppendorf 管中，
放在液氮中冷冻后，置于 -70℃超低冰箱保存备
用。以上操作均在 0~ 4℃条件下完成。
V-H+-ATP酶水解活性参照Verstappen等[10]和
Fischer-Schliebs等[11]的方法测定，质膜V-H+-ATP
酶的活性用保温介质中有无0.1 mmol·L-1的 NaVO4
时酶活性之差表示，液泡膜V-H+-ATP酶活性用保
温介质中有无50 mmol·L-1的KNO3时酶活性之差表
示，800 mL反应液中含有30 mmol·L-1的Tris-Mes
(pH 7.5)、0.1 mmol·L-1 的(NH4)2MoO4、1 mmol·L-1
的 NaN3、1 mmol·L-1 的 MgSO4、0.03% (V/V) Tri-
ton X-100、3 mmol·L-1 的 ATPNa2、50 mmol·L-1
的 KCl，加入含20 mg膜蛋白的膜微囊启动反应，
反应温度为 37℃，反应时间为 30 min，反应结
束后加入反应终止液[0.1% SDS、0.35 mol·L-1
H2SO4、0.5% (NH4)2MoO4]，再加入50 mL 10% 维
生素C (VC)，反应显色40 min后于 750 nm处比
色 。
结果与讨论
1 硒对耐盐的常夏石竹生物量的影响
由图1 可知，硒明显促进试管苗的生长，提
高试管苗的生物量，差异达显著水平。施硒量超
过0.2 mg·L-1 时试管苗生长受抑，生物量不再增
加，甚至反而下降，表明浓度过高的硒对试管苗
生长不利。
2 硒对耐盐的常夏石竹叶中渗透调节物质和叶绿
素含量、PO D 活性以及质膜透性的影响
表1显示：(1)在施硒培养基上分化的耐盐常
夏石竹植株体内游离脯氨酸含量增加，脯氨酸的
含量变化趋势和植物生长量的变化趋势一致，而
可溶性糖的含量变化趋势恰好相反，说明脯氨酸
对耐盐常夏石竹植株生长有一定的渗透调节作用，
而可溶性糖则否；(2)培养基加硒后，耐盐的常夏
石竹植株内的 K+/Na+ 比值、K+ 和 Na+ 绝对含量都
增加；(3)加硒后的耐盐植株叶绿素含量略有增
图1 硒对耐盐的常夏石竹生物量的影响
Fig.1 Effect of Se on the fresh weight of salt-tolerant
Dianthus plumarius plants
表中数据用双因素方差法分析，P < 0 . 0 5，差异达显著水平。
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加；(4)耐盐的常夏石竹叶中POD活性随着硒浓度
的升高而增强，硒浓度高于 0.2 mg·L-1 时，POD
活性即呈下降趋势；(5)盐胁迫下施硒后常夏石竹
的细胞质膜透性下降。
3 硒对耐盐的常夏石竹细胞质膜和液泡膜 V-H+-
ATP 酶水解活性的影响
从表2 可以看出，随着硒浓度的提高，硒处
理后的耐盐常夏石竹叶细胞质膜V-H+-ATP酶活性
一直上升，超过 0.4 mg·L-1 后增长渐缓；液泡膜
V-H+-ATP 酶活性也随着硒浓度的升高而上升，差
异达到极显著水平。这显示常夏石竹对 K+、Na+
的选择性吸收能力增强，因而其耐盐性也增强。
参考文献
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Pase of Kalanchoe daigremontiana reveal structural differ-
ences of V-ATPase subunits of different plant species. Biol
Chem, 1997, 378: 1131~1139
表1 硒对耐盐的常夏石竹某些生理指标的影响
Table 1 Effects of Se on some physiological indexes of salt-tolerant Dianthus plumarius
施硒量/ 脯氨酸含量/ 可溶性糖含量/ K+/ Na+ K+含量/ Na+含量/ 叶绿素含量/ POD含量/ 膜透性/
mg·L-1 mg·g-1(DW) mg·g-1(DW) 比值 mg·g-1(DW) mg·g-1(DW) mg·g-1(DW) OD·min-1·g-1(DW) %
0 11.07** 84.33* 0.71* 29.34* 41.25* 17.46* 0.778* 38.71*
0.1 16.53** 68.45* 0.80* 35.26* 43.62* 20.11* 0.934* 35.56*
0.2 17.52** 72.28* 0.82* 37.34* 45.46* 22.37* 1.167* 32.58*
0.4 18.02** 70.46* 0.83* 39.42* 47.71* 24.23* 1.065* 34.52*
0.6 15.03** 66.54* 0.75* 33.23* 44.05* 19.46* 0.805* 36.10*
表中数据用双因素方差法分析。* 表示 5 % 水平，即差异显著；* * 表示 1 % 水平，即差异极显著。表 2 同此。
表2 硒对耐盐的常夏石竹叶细胞质膜和液泡膜
V-H+-ATP 酶活性的影响
Table 2 Effects of Se on the V-H+-ATPase activity
of plasmalemma and tonoplast in leaves of
salt-tolerant Dianthus plumarius

施硒量/mg·L-1
V-H+-ATPase活性/mmol(Pi)·mg-1(蛋白)·h-1
细胞质膜 液泡膜
0 24.2** 14.5**
0.1 30.4** 19.6**
0.2 32.0** 22.4**
0.4 34.1** 23.8**
0.6 35.3** 24.2**