全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 2期，2005年 4月202
一种改进的富含多糖的芒果组织中完整总RNA 提取方法
杜中军 徐兵强 黄俊生* 王家保 徐立
中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室，热带生物技术研究所，海口 571001
An Improved Method for Extracting Intact Total RNA from Mango Tissues
Rich in Polysaccharides
DU Zhong-Jun, XU Bing-Qiang, HUANG Jun-Sheng*, WANG Jia-Bao, XU Li
State Key Laboratory for Tropical Crop Biotechnology, Institute of Tropical Bioscience, Chinese Academy of Tropical Agricultural
Sciences, Haikou 571101
提要 2 次用 0.25 体积无水乙醇和 0.11 体积的 5 mol·L-1 醋酸钾溶液(pH 4.8)去除多糖，并用硼酸和聚乙烯吡咯烷酮去除多
酚，成功地从0.2~0.3 g富含多糖和多酚的芒果嫩绿色、砖红色和转绿期的叶片以及果皮和果肉组织中提取到完整总RNA，
所提取的 RNA 在体外能成功进行反转录合成 cDNA。此法的全过程共需要 22~24 h。
关键词 多糖；芒果；RNA 提取
收稿 2004-07-26 修定 　 2004-10-27
*通讯作者(E-mail: dwlizj@yahoo.com.cn，Tel：0898-
66890763)。
从植物组织中提取纯度高、完整性好的 RNA
是进行植物分子生物学研究的必要前提和关键。
植物组织中的多酚、多糖和蛋白质以及其他次生
代谢物质影响 RNA 的提取[1]。有关富含多糖的猕
猴桃[2]、葡萄[3]、紫丁香和糖槭[4]等植物组织中总
RNA 的提取已有所报道，但从富含多糖的芒果组
织中提取总 RNA 的报道尚未见。我们在采用已有
方法提取总 RNA 时发现，芒果组织中过多的多糖
形成难溶胶状物，在LiCl沉淀之后无法进行下一
步操作，其原因是芒果组织中多糖含量远远高于
一般植物。为此，本文在López-Gómez 等[5]所报
道方法的基础上，改进并提出了一种能从富含多
糖的芒果组织中提取完整总 RNA 的方法，并对一
些实验操作细节作了总结，现报道如下。
材料与方法
1 材料
以我院种质资源圃的芒果(Mangifera indica L.)
为试材，分别取嫩绿色、砖红色、转绿期叶片
以及果皮和果肉组织。
2 方法
2.1 RNase的灭除 所用的研钵、药匙和剪刀用75%
的工业酒精燃烧处理；吸头、离心管、LiCl 和
醋酸钾溶液以及蒸馏水用 0 . 1 % 焦碳酸二乙酯
(DEPC)浸泡 24 h 后高温灭菌；70% 乙醇用 DEPC
处理过的玻璃仪器和 DEPC 水配制；由于提取缓
冲液中含有去污剂 SDS，故用灭菌蒸馏水配制后
进行高温灭菌即可；实验过程中始终戴手套和口
罩，以避免皮肤、汗水和呼吸带来的 R N a s e。
2.2 琼脂糖凝胶电泳 采用DEPC水配制pH 8.0的
Tris-硼酸 -EDTA 电泳缓冲液TBE，电泳槽用0.4
mol·L-1 NaOH 浸泡 4 h 以上，电压为 10 V·cm-1。
2.3 提取方法 提取缓冲液由下述组成：2%(W/V)
SDS、2%~5%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-40、
50 mmol·L-1 EDTA、150 mmol·L-1 Tris-HCl，1
mol·L-1 硼酸调节 pH 到 7.5，然后高温灭菌。
预先用 75% 的工业酒精燃烧处理研钵、药匙
和剪刀各 1，置冰中冷却后，再连续 2 次加入液
氮以冷却研钵、药匙和剪刀。
预先称量估计0.3 g 样品的多少，然后根据
估计直接剪取约0.3 g样品放入经液氮冷却的研钵
中，立即加入液氮，再加入约 2%(W/V)的 PVP-
40，研磨样品至细粉状，用燃烧处理并液氮冷却
后的药匙将细粉状样品转入到预先在室温下加入
技术与方法 Techniques and Methods
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600 mL 提取缓冲液的 2 mL 离心管中，然后在通
风橱中立即加入30 L 约5%体积巯基乙醇， 0.25
体积无水乙醇和0.11体积的5 mol·L-1醋酸钾溶液(pH
4.8)，旋涡混匀1 min；立即加入0.8体积的氯仿/
异戊醇(49∶1)，混匀后于冰上静置 5 min，再
在 4℃下以20 000×g离心 10 min；取上清液，加
入等体积酚酸/氯仿(1∶1)，混匀后于 4℃下以
20 000×g 离心 10 min；取上清液，再加入 0.25
体积无水乙醇，等体积氯 / 异戊醇(49∶1)混匀，
4℃下以20 000×g 离心 10 min；取上清液，加入
0.6体积8 mol·L-1 LiCl，使其终浓度为3 mol·L-1，
-20℃下放置8 h后，于4℃下以20 000×g 离心90
min；用 3 mol·L-1 LiCl 洗涤 2次，用600 mL 的
DEPC 水重新溶解沉淀；加入0.8 体积的氯仿，混
匀后4℃下以18 000×g离心10 min；加入5 mol·L-1
醋酸钾溶液(pH 4.8)使其终浓度为0.3 mol·L-1，用
2体积无水乙醇沉淀，-20℃放置过夜或8 h以上；
并于4℃下以18 000×g离心 20 min；用 70%乙醇
洗涤 2 次，以 50 mL 的 DEPC 水重悬 RNA 或以乙
醇沉淀的形式于 -80℃超低温冰箱保存。
2.4 cDNA的合成 采用大连宝生物工程有限公司
生产的 AMV 反转录酶，用 DNA 酶消化后的总 RNA
为模板，在 0.5 mL 离心管中加入 2 mg 模板总
RNA、4 mL 5 倍缓冲液、2 mL dNTP 混合液各
2.5 mmol·L-1、20 U核糖核酸酶抑制剂、50 pmol
的 Oligo(dT)18 引物、10 U 的 AMV 反转录酶，加
DEPC 水至总体积20 mL，轻轻搅拌后于室温放置
10 min后移入 42℃恒温槽中保温1 h，冰浴冷却
2 min。然后以合成的cDNA 为模板用芒果乙烯受
体基因设计的特异引物进行PCR反应。5 端引物为：
5 AAGACTACACTTGTTGAGCTAGGAG 3 ；3
端引物序列为：5 AAAGATCATGAGCACACAGC 3 。
实验结果
1 RNA 质量分析
测定不同组织总 RNA 的 OD260 和 OD280 值的结
果(表 1)表明，嫩绿色叶片总 RNA 的 OD260/OD280
比值大于 2.0，显示其纯度最高，产量也最高。
这可能是由于旺盛代谢幼嫩组织中次生代谢物质较
少，R N A 含量本身较高之故。但砖红色叶片的
OD260/OD280 比值最低为1.73，实验表明主要是由
于砖红色色素较难去除所致。转绿期叶片、果皮
和果肉的RNA产量分别为215.5、196.5和 188.5
mg ·g-1(FW)，其 RNA 的 OD260/OD280 比值分别为
1.83、1.81 和 1.96。
另外，对芒果 5 种不同组织中所提取的 RNA
进行琼脂糖凝胶电泳分析(图 1)发现，25S和 18S
泳带清晰，没有弥散现象，表明提取的 R N A 较
完整，没有发生明显的降解。
2 合成的 cDNA 用作 PCR 模板
分别以不同芒果组织所提取的总 RNA 为模板
反转录，以合成的 cDNA 为模板，采用芒果乙烯
受体基因设计的特异引物进行 PCR 反应，得到乙
烯受体基因片段与预期片段的大小(520 bp)相符(图
2)，说明获得的 RNA 可用于反转录反应。
讨　　论
芒果组织中不仅含有大量的多酚，还含有大
图2 芒果不同组织的总RNA电泳图谱
图1 芒果不同组织总RNA电泳图谱
1 ~ 5 分别代表转绿期、砖红色、嫩绿色叶片及果皮和果
肉。图 2 同此。
表1 芒果不同组织总RNA的 OD值
材料 OD260 OD280 OD260/OD280 产量/mg·g-1 (FW)
嫩绿色叶片 0.641 0.272 2.36 320.5
砖红色叶片 0.452 0.261 1.73 226.0
转绿期叶片 0.431 0.235 1.83 215.5
果皮 0.393 0.217 1.81 196.5
果肉 0.377 0.192 1.96 188.5
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量的多糖，实验去除较为困难，影响了高质量
RNA 的获得。去除多糖的方法有低浓度乙醇沉淀
法[6]和醋酸钾沉淀法[7]，提高缓冲液中NaCl浓度
也有助于去除多糖[8]。Su和Gibor[9]在去除褐藻中
的多糖时发现，只有结合使用乙醇和醋酸钾时效
果才佳。本文采用 López-Gómez 等[5]的方法，用
0.25体积无水乙醇和0.11体积的5 mol·L-1醋酸钾
溶液可以去除多糖杂质。我们在利用该法时发
现，此法能较为彻底地去除多酚，但得到的沉淀
在经过3 mol·L-1 LiCl 洗涤后，由于多糖的存在，
沉淀很难溶解。考虑到提取液中已经含有大量醋
酸钾，因此在以酚酸/氯仿抽提后，再加入0.25
体积无水乙醇，利用无水乙醇和醋酸钾结合的方
法，可以克服上述沉淀以3 mol·L-1 LiCl洗涤后不
易溶解的缺点。在沉淀溶解后再以氯仿提取，即
可较彻底地去除蛋白质等杂质。
本文用酒精燃烧处理研钵、药匙和剪刀，能
避免很多方法中用130℃或180℃长时间烘烤的缺
点，可节省时间和减少能耗，避免操作中的污染
和RNase 去除不彻底以及遗留核酸交叉污染的缺
点；另外，预先连续 2 次以液氮冷却研钵和药
匙，可以保证组织一旦放入研钵中后就处于冷冻
环境，也可保证研钵处于相对较长时间的冷冻状
态，再在加样后浇 1 次液氮即可足以保证样品直
到转移后都处于低温状态，从而避免由于液氮冷
冻不足而导致温度回升以致内源 RNase 对 RNA 降
解和多酚氧化，以及研磨期间再次加液氮引起粉
末飞溅致使样品损失和交叉污染的后果；还有，
预先称量估计后直接剪取，可避免由于样品称量
再研磨所导致的褐变；本法在研磨过程中增加聚
乙烯吡咯烷酮可避免芒果组织的氧化，去除多
酚。加入样品后再加 5% 体积的巯基乙醇则可避
免提取液在贮存过程中和转移样品时巯基乙醇的挥
发，从而增加了实验的安全性。用 10 V·cm-1 电
压，在 20 min 左右完成电泳，可有效避免 RNA
在电泳过程中的降解，降低 R N A 的变性程度。
参考文献
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