全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 697
花生油酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的高效表达
殷冬梅， 崔党群*
河南农业大学农学院，郑州 450002
提要：将克隆的油酸脱氢酶基因(AF900663)亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES6/CT，从大肠杆菌中筛
选到含有目的基因的重组质粒 pYES/HO-A，用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株 INVSc I中，经半乳糖诱导后，收
集菌体，用气相色谱质谱(GC-MS)仪分析转化酵母的脂肪酸色谱的结果表明，HO-A所编码的酶具有油酸脱氢酶活性，能
将酵母内源性油酸转化为亚油酸，油酸脱氢酶的表达量为15.6%，高于已有的报道。
关键词：花生；油酸脱氢酶基因；酿酒酵母；功能鉴定
Function Expression of Oleate Desaturase Gene from Peanut in Sacchromyces
cerevisiae
YIN Dong-Mei, CUI Dang-Qun*
College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: Oleate desaturase is the rate limiting enzyme of the desaturation of linoleic acid in the production of
an essential fatty acid. The 1.14 kb fragment in plasmid pRSET/HO-A encoding oleate desaturase was subcloned
into the yeast- Escherichia coli shuttle vector pYES6, thus an expression recombinant plasmid pYES/HO-A
contatining target gene was constructed. The pYES/HO-A was introduced into defective mutant INCSc1 of
Saccharomyces cerevisiae by LiAc method. Oleate desaturase activity was expressed under appropriate media
and temperature conditions, the level of linolenic acid reached 18.6% of the total yeast fatty acids by GC-MS
detection, and the function of oleate desaturase in S. cerevisiae was verified. Total fatty acids was extracted and
esterified, then analyzed by gas chromatography. A novel peak corresponding to linoleic methyl ester standards
was detected with the same retention time. GC-MS analysis demonstrsted that the novel peak was linoleic acid
methyl ester. These results exhibited ∆12 fatty acid desaturase activity, converting oleicto linoleic specifically.
Key words: peanut; oleate desaturase; Saccharomyces cerevisiae; function identification
收稿 2007-03-23 修定 2007-06-26
资助 河南省重点科研项目(2 00 2AA20 70 04 )。
* 通讯作者(E-ma i l：cdq6 2 @sohu .com；T el：0 3 7 1 -
63558122)。
花生种子中富含油酸和亚油酸。油酸脱氢酶
是亚油酸合成的关键酶，催化油酸(18:1)在∆12位
上脱氢生成亚油酸(18:2)(Page等 1994；Schmidt
等1994)，其一般存在于植物细胞的内质网和叶绿
体膜上(Alonso等 2003)。不饱和脂肪酸(如油酸、
亚油酸等)在增加膜的流动性中起作用，通过改变
脂肪酸脱氢酶活性，可调节膜脂的不饱和程度，
从而增加生物体抗盐和抗寒能力(Ishizaki-Nishizawa
等 1996)。随着人们对高品质植物油的需求增加，
用基因工程手段调节不饱和脂肪酸含量的研究受到
越来越多的关注(Sayanova 等 1997；Pir t le 等
2001)。但由于油酸脱氢酶具有膜结合蛋白的特
性，迄今还没有有效的方法将其纯化并在蛋白水
平上作进一步的研究，对其结构和功能以及表达
调控尚应作更深入的研究。本文将我们从花生中
克隆的油酸脱氢酶基因(殷冬梅和崔党群2006)构建
穿梭表达载体 pYES/HO-A转化至酿酒酵母中，通
过半乳糖的诱导获得了外源目的蛋白的高效表达，
现报道如下。
材料与方法
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)营养缺陷
型 INVScI及大肠杆菌／酿酒酵母穿梭表达载体
pYES6/CT购自 Invitrogen公司。限制性内切酶、
T4 DNA 连接酶、蛋白质分子量标准购自宝生物
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( 大连 ) 生物工程有限公司，稻瘟霉素购自
Invitrogen公司，酸洗玻璃珠、鲑鱼精DNA购自
Sigma公司，培养基、聚乙二醇(PEG3350)等生
化试剂购自上海生物工程有限公司。
根据HO-A序列设计简并引物，在其两端各
加 1个特异酶切位点 EcoRI、BamHI，以花生总
RNA为模板进行 RT-RCR扩增，目的片段连接入
克隆载体 pMD18-T，转化大肠杆菌 DH5，挑取
阳性克隆交宝生物(大连)生物工程有限公司测序，
验证为正确的克隆命名为 pMD/HO-A。将 pMD/
HO-A和表达载体 pYES6/CT分别用EcoRI、BamHI
双酶切， 琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收 1 140
bp目的条带和表达载体 5 800 bp片段，将其按 5:
1比例 16 ℃连接过夜后，取 10 µL转化大肠杆菌
DH5α，次日 PCR检菌，鉴定为阳性克隆的单菌
落用质粒提取Kit提取质粒，酶切鉴定正确的质粒
由宝生物(大连)生物工程有限公司测序，确定目
的基因在 pYES6中正确的读码框和插入方向。重
组质粒命名为 pYES/HO-A。感受态细胞制备采用
Sangon高效感受态细胞转化Kit，重组质粒的转
化、酶切鉴定及阳性克隆的筛选按常规分子生物
技术进行。质粒DNA转化酵母采用改进的醋酸锂
法。
重组质粒在酿酒酵母中诱导表达时，挑 1个
转化重组子单菌落，接入 15 mL含有稻瘟霉素及
2%葡萄糖的 SC选择性培养基中，30 ℃振荡过夜
培养；测定过夜培养物的 OD600值。将适量过夜
培养物 4 000×g离心 5 min (4 ℃)，弃去上清液。
将细胞重悬在 50 mL诱导培养基中，于 22 ℃下
继续振荡培养。细胞加入诱导培养基中后于 0、
4、8、1 2、1 8、2 4、2 8、3 2、3 6、4 2 h 分
别从三角瓶中取 5 mL培养物于 4 ℃下 4 000×g离
心 5 min，弃上清液，收集的培养细胞用无菌水
冲洗 1次后，将细胞沉淀保存在 -80 ℃中备用。
在细胞培养过程中，每隔 24 h补加 1次半乳糖至
终浓度为2%。重组蛋白检测中必需制备的细胞裂
解物用酸洗玻璃珠小规模制备酵母细胞裂解物的方
法较为方便。
分析酵母油脂的脂肪酸时，取上述收集的酵
母沉淀，加入适量裂解缓冲液和等体积的酸洗玻
璃珠，涡旋 30 s，然后放在冰上 30 s；4 min
内重复 4次以裂解细胞。然后加入等体积的氯仿:
甲醇:水(2:1:2)抽提，取氯仿层，加入等体积 1%
H2SO4-甲醇进行甲基化处理，于55 ℃水浴中放置
6 h后，加入正已烷回溶，具体方法参见寇秀颖
和于国萍(2005)一文并略有改动。脂肪酸分析用
日本岛津GC-9A和GCMA-QP5000 仪器分析。
实验结果
1 重组表达质粒pYES/HO-A的构建和酶切鉴定
用 EcoRI、BamHI双酶切将HO-A基因从质
粒 pMD/HO-A上切下连入pYES6.0/CT，经质粒的
快速检测法筛选得到重组表达质粒 pYES/HO-A，
重组质粒经EcoRI、BamHI双酶切产生1 140 bp和
5 800 bp两条片段，表明外源片段已经插入表达
载体 pYES6/CT中(图 1)。测序结果表明外源片段
HO-A插入方向正确、插入顺序合适。
2 油酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达
将重组质粒pYES/HO-A转化到酿酒酵母营养
缺陷型 INVScI，在 SC固体培养基上筛选转化子，
经质粒检测得到重组酵母工程菌，按前述方法进
行诱导表达。从诱导后开始，每间隔 4~6 h取样，
离心收集发酵液，用于相同条件下培养的酿酒酵
母上清液作为对照。在诱导 4~42 h期间的工程菌
发酵液中均可检测出重组蛋白，说明HO-A在酿
酒酵母中已获得表达，以诱导 36 h 时的发酵液中
图 1 重组质粒 pYES/HO-A的酶切电泳图谱
Fig.1 Electropherogram of restriction enzymes
identification of recombinant plasmid
　　M：DN A Ma rk e r；A、B：Ec o RI 和 Ba m H I 双酶切重
组质粒 p MD / H O -A；C：重组质粒 p MD / H O -A。
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目的蛋白含量为最高(图 2)。将收集的菌体经甲酯
化处理后，进行气相色谱分析的结果出现保留时
间(5.207)与亚油酸标准品一致的特异脂肪酸峰(图
3)，而插入空载体的无此峰出现。对酵母油脂中
出现的这个特异峰进一步进行气质联谱(GC-MS )
分析证实为亚油酸。说明油酸脱氢酶基因在酿酒
酵母中获得了表达，于是原来不产生亚油酸的酿
酒酵母由于外源油酸脱氢酶基因的导入，其内源
图 2 酿酒酵母中重组蛋白在不同诱导时期的表达
Fig.2 Expression of the recombinant proteins in S. cerevisiae
at the different inducible time
油酸转化为亚油酸。
讨　　论
一般说来，选择合适的载体和受体菌，对表
达外源基因非常重要。酿酒酵母是单细胞真核生
物，既具有大肠杆菌等原核生物繁殖快、易培养
的优点，又可对蛋白质产物进行适当加工，如修
饰、折叠和分泌等，是最早发展成为基因表达系
统的优良宿主菌，至今已广泛用于表达各种各样
的外源基因(Covello和 Reed等 1996；Kuiper等
2005；张琦等 2004；Hao等 2005；王德培等
2006)。本文选择酿酒酵母营养缺陷型 INVSc1为
图 3 脂肪酸甲酯的气相色谱和气相色谱 /质谱图谱
Fig.3 Gas chromatogram and gas chromatogram-mass spectrometry of fatty acid methyl esters
a：含有质粒 p Y E S / H O -A 的酵母脂肪酸；b：亚油酸甲酯标准品。
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受体菌，pYES6/CT为表达载体。pYES6/CT是
一种酵母游离型质粒，也是一种穿梭质粒，它在
大肠杆菌和酵母菌中都稳定存在。它带有酵母
GAL1启动子，受半乳糖的诱导。本文中油酸脱
氢酶基因获得了稳定表达，表达量高达 15.6%，
这是迄今花生酸脱氢酶基因在真核生物中的最高表
达量(Jung等 2000)。由于油酸脱氢酶是形成亚油
酸的限速酶，并且不同基因型，尤其是油酸 /亚
油酸(O/L)比差异较大的花生品种，其油酸脱氢酶
序列有明显的差别，因此我们构建了不同O/L比
基因型的表达载体，诱使其在酵母中表达，发现
不同基因型的油酸脱氢酶表达量明显不同，O/L
比值高的表达量低，结果油酸脱氢酶的蛋白活性
也低，从而限制了亚油酸的形成，提高了该基因
型的 O/L比值(待发表资料)。
培养条件对酿酒酵母的蛋白表达量有很大影
响。本文将最佳诱导时间确定为 36 h，诱导的最
理想温度为 22 ℃ (数据未列出)。这一诱导温度
与我们在原核表达该基因的诱导温度相同(Yin等
2007)，说明诱导温度对蛋白表达量有较大影响。
植物脂肪酸脱氢酶基因的表达受 ABA、温
度、光照、盐和伤害刺激等多种因子调节，表
达具有组织特异性(Berberich等1998；Nishiuchi等
1997)，这也可能是同一品种在不同年份间脂肪酸
差异明显的原因。如何调控脂肪酸脱氢酶基因的
稳定表达，油酸脱氢酶与其他脂肪酸脱氢酶以及
作用底物与 cytb5之间的关系，尚待深入探讨。
近年来，国内外一些实验室从不同的油料作物中
克隆出油酸脱氢酶基因，但由于花生基础理论研
究起步较晚，故许多研究，尤其是花生脂肪酸代
谢调控的研究更是落后于其他作物。本文结果为
进一步构建花生油酸脱氢酶特异表达载体，利用
种子特异性启动子，使其在花生的种子中特异地
积累油酸或亚油酸，改变脂肪酸组成以满足人们
对营养的需求提供了可能。
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