全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月 219
收稿 2003-05-13 修定 　 2003-09-22
资助　 湖北省教育厅科学基金项目(2001A27003)和“八六
三”项目(2001AA241051)。
* E-mail: hbdhli@sohu.com,Tel: 0712-2345590
一种根系分泌物中有机酸的前处理和高效液相色谱检测方法
李德华1,2,* 贺立源2 李建生3 刘武定2
1 孝感学院生物系，孝感 432100；2 华中农业大学资源环境学院，武汉 430070；3 中国农业大学农学与生物技术学院，
北京 100094
A Method for Pretreatment and Determination of Organic Acid in Root Secre-
tion by High Performance Liquid Chromatography
LI De-Hua 1,2,*, HE Li-Yuan 2, LI Jian-Sheng3, LIU Wu-Ding2
1Department of Biology, Xiaogan College, Xiaogan 432100; 2College of Resources and Environment, Huazhong Agricultural
University, Wuhan 430070; 3College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094
提要 改进了根系分泌有机酸的前处理和高效液相色谱检测方法。将 DEAE 纤维素层析法直接用于根系分泌物中有机酸
的富集浓缩，并与旋转蒸发浓缩的回收率进行了比较。结果表明，DEAE 纤维素柱层析有较高的回收率，可用于根系分
泌物中有机酸的富集浓缩，特别适用于大批量样品的前处理。确定了反向高效液相色谱同时检测草酸、酒石酸、马来酸、
苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸等 7 种有机酸的条件。玉米根系分泌物样品中可检出苹果酸等 5 种有机酸。
关键词 根系分泌物；有机酸；层析；RP-HPLC
根系分泌物是一个古老而又年轻的研究领
域。早在 18 世纪，人们就已注意到根系分泌物
的作用。尤其是近 30 年以来，人们对植物根系
分泌物的组成和作用有了更深刻的认识。有关根
系分泌物的组成、运转及在土壤结构形成、土壤
矿物风化、活化土壤养分、促进养分吸收和根际
土壤养分移动及抗毒(Al、酸)害中的作用已多有
报道[1~3]。根系分泌物有200多种，其种类和数量
随植物类型、根际环境而异[2]。其中，低分子有
机酸是根系分泌物的主要成分，它是具有 1 至数
个羧基的小分子碳水化合物。常见的主要有柠檬
酸、酒石酸、马来酸、苹果酸、甲酸、乙酸、
草酸、琥珀酸、富马酸、丙酸等。在特殊情况
下，还分泌特有的有机酸。有机酸的分子结构和
荷电特性可影响土壤中的许多过程，因而其与植
物根际营养的关系也是显而易见的。
某些逆境因子胁迫可诱导植物根系大量分泌
有机酸，这是对生态环境的一种适应性反应[4,5]。
分离、纯化和测定根系分泌物中低分子有机酸,对
理解植物抗逆性的机制很有意义。迄今，这方面
的报道甚少。过去常用气相色谱测定有机酸，但
这种方法需要长时间的衍生化作用，而且高温易
使所欲测定的有机酸分解。目前用离子色谱和
HPLC 方法测定较流行[6~8]。本文探讨根系分泌物
中有机酸样品的收集和浓缩的前处理，以及反向
高效液相色谱(RP-HPLC)检测根系分泌物样品中草
酸、酒石酸、马来酸、苹果酸、乙酸、柠檬
酸、琥珀酸等 7 种有机酸的方法，并以之研究和
比较了不同耐铝性玉米自交系根系分泌有机酸的差
异。
材料与方法
1 有机酸 HPLC 分析条件的选择
用 RP-HP LC 法测定。仪器：岛津 LC-6 A。
色谱柱：Hypersil C18，5 mm，4.6 mm × 250
m m。对流动相、流动相 pH 和流速进行选择,最
后确定对草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、马来
酸、柠檬酸和琥珀酸等 7 种有机酸同时测定的分
析条件。各有机酸标样均为分析纯，其中L-苹果
酸为Sigma公司产。有机酸的定量按峰面积计算,
采用外标法(两点标准曲线法)。
2 有机酸的柱层析富集和浓缩
DEAE纤维素柱(1.2 cm×8 cm, 填装DEAE32
约 9 mL)和阴离子交换树脂柱(717#，40~60 目,
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0.5 cm×7 cm,内装717强碱型阴离子交换树脂约
1.5 g)层析柱进行分离和比较。它们的前处理流程
为: 蒸馏水浸洗→1 mol.L-1 HCl浸泡4 h→蒸馏水
洗至中性→1 mol.L-1 NaOH浸泡4 h→双蒸水浸洗
至中性。
草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、马来酸、
柠檬酸和琥珀酸等7种有机酸计13.8 mg(表2)溶于
250 mL 蒸馏水，通过 DEAE 纤维素或阴离子交换
树脂层析柱，然后用 25 mL 双蒸水洗柱，流速
均为0.5~0.6 mL.min-1。有机酸洗脱液为15 mL 1
mol.L-1 HCl，流速：0.4~0.5 mL.min-1。对照为
相同量的有机酸不过柱。每处理重复 3 次。收集
液和对照用真空旋转蒸发仪蒸发(40℃)至近干，
定容至 1~2 mL，冰冻(-20℃)保存用于有机酸
HPL C 测定。以对照为 100 %，计算各有机酸的
回收率。
3 根系分泌有机酸样品的制备
选用本室筛选的耐铝性不同的2个玉米自交
系——Z01(耐铝)和 Z02(铝敏感)。种子经 0.1%
HgCl2 表面灭菌 15 min，冲洗后播于沙盘，出苗
后切去胚乳，移入 1/2 玉米营养液，3 d 后改用
全营养液,采用 Magnavaca的玉米营养液配方[9]，
pH 4.3。幼苗培养15 d后，进行三价铝(营养液
中添加0.1 mmol.L-1 AlCl3)处理，以不施铝为对
照。培养期间每天通气 5~10 min 并调节 pH，自
然光照，每 2 d 更换 1 次营养液。
于处理后24 h收集根系分泌物。每处理随机
取3株植株。将植株根系置于300 mL 0.2 mmol.
L-1 CaCl2 溶液中，在自然光下放置 5 h，每处理
重复 2 次。按本文建立的方法制备有机酸分析样
品：根系分泌物收集液通过 DEAE 纤维素层析柱
(1.2 cm×8 cm, 内装DEAE32约9 mL), 然后用
25 mL 双蒸水洗柱去除阳离子等杂质，流速均为
0.5~0.6 mL.min-1。用15 mL 1 mol.L-1 HCl洗脱有机
酸，流速：0.4~0.5 mL.min-1。洗脱液用真空旋
转蒸发仪蒸干(40℃)，以少许双蒸水溶解并定容至
1~2 mL，冰冻(-20℃)保存用于有机酸 HPLC 测
定。有机酸样品的测定按本文建立的RP-HPLC 测
定方法进行：Hypersil C18 柱，5 mm，4.6 mm×
250 mm；流动相为0.5% (NH4)2HPO4，pH 2.85；
流速为0.6 mL.min-1; 进样量20 mL; 检测波长214
n m 。
结果与讨论
1 有机酸 HPLC 检测方法的建立
在有机酸RP-HPLC测定法中,流动相浓度、流
速和pH 是影响有机酸分离和测定的3 个因素[10]。
比较0.5% KH2PO4 和 0.5% (NH4)2HPO4 2 种流动相
对7种有机酸的分离效果表明，0.5% (NH4)2HPO4
在较高的 p H 下分离各组分良好，故选定 0 . 5 %
(NH4)2HPO4 作为流动相。流速对各有机酸的保留
时间和峰形有明显的影响，考虑到各组分色谱峰
的分离度和样品分析时间，以0.6 mL.min-1的流速
最好。pH 对有机酸在流动相中的离解度有影响。
由于各有机酸的pKa值不同， 所以pH对各有机酸
的影响也不同。根据分析这 7 种有机酸不同个数
组合在pH 2.4~3.0流动相中的分离效果，我们认
为，虽然较低的 pH 有利于各有机酸的分离，但
考虑到分析时间和对色谱柱的保护，最后选定流
动相 pH 为 2.85。
最终选定的有机酸 HPLC 测定条件为：柱型
为Hypersil C18，5 mm，4.6 mm × 250 mm；流
动相0.5% (NH4)2HPO4，pH 2.85；流速为0.6 mL.
min-1; 进样量20 mL; 检测波长214 nm。在上述测
定条件下，得到有机酸混合标样和玉米根系分泌
物样品的色谱图(图 1)。
用各浓度混合标准样品(浓度范围为0.1~200
mg.L-1)进行测定，除草酸和酒石酸的分离略差
外，其他组分均得到很好分离。以样品质量浓
度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到各有机
酸的线性回归方程，其线性相关系数r>0.99。在
上述测定条件下，各有机酸的检测限为0.05~10.8
(表 1)。
2 两种层析柱的有机酸回收率比较
用上述建立的有机酸RP-HPLC 测定方法，以
混合有机酸(浓度0.1~2.5 mg.L-1)标样(不进行层析、
蒸发等样品处理过程)为对照(100%)，比较 DEAE
纤维素和阴离子交换树脂两种层析柱的层析效果表
明， DEAE 纤维素效果较好，除酒石酸外(小于
90%)，各有机酸的回收率在 93.7%~102.3% 之
间。阴离子交换树脂对柠檬酸等不易洗脱，回收
率较低(小于 80%，表 2)。因此，我们选择 DEAE
纤维素层析富集浓缩有机酸。
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表1 有机酸的相对响应值和检测限
有机酸 保留时间 / min 相关系数(r) 检测限/ mg.L-1 回归方程 浓度范围/mg.L-1
草酸 4.58 0.9905 0.6 y = 25737x + 25357 0~100
酒石酸 4.99 0.9943 3 y = 3783.6x + 6696.8 0~100
苹果酸 6.13 0.9942 3.9 y = 2994.5x + 8758.2 0~100
乙酸 8.15 0.9929 5.9 y = 2028.6x + 818.74 0~100
马来酸 8.94 0.9999 0.05 y = 229909x - 11915 0~10
柠檬酸 9.78 0.9987 5.7 y = 1920.5x + 1567.9 0~200
琥珀酸 12.88 0.9925 10.8 y = 995.45x + 3909 0~200
回归方程中，y为峰面积，x为浓度。
表2 两种柱层析的有机酸加标回收率比较

有机酸
加入量/ DEAE纤维素柱 阴离子交换树脂柱
mg 回收量/ mg 回收率/ % 回收量/ mg 回收率 %
草酸 1.0 0.96±0.01 95.8±0.7 0.97±0.06 97.2±3.2
酒石酸 1.0 0.81±0.04 81.4±2.1 1.00±0.31 100.4±18.0
苹果酸 1.2 1.27±0.06 102.0±5.0 0.96±0.10 87.2±5.3
乙酸 0.5 0.47±0.02 93.7±2.0 0.49±0.01 98.8±0.8
马来酸 0.1 0.10±0.01 95.8±3.0 0.08±0.01 77.5±3.3
柠檬酸 5.0 4.83±0.20 96.5±2.3 3.82±0.23 76.3±2.7
琥珀酸 5.0 5.11±0.60 102.3±6.9 4.41±0.13 88.1±1.5
图 1 有机酸的RP-HPLC检测
1.草酸；2.酒石酸；3.苹果酸；4.乙酸；5.马来酸；6.柠檬酸；7.琥珀酸。tR 为保留时间。
以较低浓度(0.1~2.5 mg.L-1)有机酸标样进一步
进行 DEAE 纤维素层析柱的回收试验，并与旋转
蒸发浓缩回收率进行比较的结果表明，DEAE 纤
维素柱层析各有机酸的回收率在92.2%~106.3%之
间，但酒石酸仅 8 7 % ，原因尚不清楚。有机酸
经旋转蒸发浓缩后，除乙酸(低于 85%)外，其它
各组分的回收率为 92.7%~108%(表3)。
另外，研究有机酸混合标样经层析、旋转蒸
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发两步后的回收率的结果表明，经 DEAE 纤维素
柱层析、旋转蒸发处理后，酒石酸、乙酸和马
来酸的回收率有所降低。其中，酒石酸回收率小
于 85%，其他组分在 86.2%~100% 之间(表 3)。
总之，DEAE 纤维素柱层析具有较高的回收
率，可用于根系分泌物中有机酸的富集浓缩，特
别适用于大批量样品的分析。
3 样品分析实例
玉米根系分泌物样品中共检出柠檬酸、苹果
酸、琥珀酸、乙酸、马来酸等5种有机酸(表 4)。
两个玉米自交系根系分泌有机酸有较大差异。铝
处理后，耐铝自交系 Z01 的苹果酸分泌量为不作
铝处理的 3 倍，而敏感自交系 Z02 琥珀酸分泌量
则减少 5~6 倍。我们以前的研究[9]表明，铝胁迫
可显著增加耐铝自交系 Z01 根系中的 NADP- 苹果
酸脱氢酶活性, 以致造成根内苹果酸的积累和分泌
量增加。
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表4 不同耐铝性玉米自交系根系分泌物中的有机酸含量比较
mg.g-1(根FW).h-1

自交系
苹果酸 乙酸 马来酸 柠檬酸 琥珀酸 总量
-Al3+ +Al3+ -Al3+ +Al3+ -Al3+ +Al3+ -Al3+ +Al3+ -Al3+ +Al3+ -Al3+ +Al3+
Z01 4.8 15.2 1.1 0.7 — 0.04 — — 13.2 5.0 19.2 20.9
Z02 15.0 10.2 3.2 3.0 — — — — 58.9 9.2 77.0 22.4
-Al3+：不加 Al3+ 的对照；+Al3+:加 0.1 mmol.L-1 Al3+；—:低于检测限。
表3 DEAE纤维素柱层析及旋转蒸发的有机酸回收率比较

有机酸

加入量/
层析 蒸发 层析+蒸发

mg 回收量/mg 回收率/% 回收量/mg 回收率/% 回收量/mg 回收率/%
草酸 0.2 0.19±0.01 94.0±3.0 0.20±0.03 100.4±17 0.19±0.01 94.4±3.0
酒石酸 1.0 0.87±0.09 87.0±9.8 0.94±0.03 94.3±2.8 0.82±0.08 82.1±9.2
苹果酸 1.0 1.02±0.04 102.1±3.5 1.01±0.01 100.6±0.5 1.03±0.04 102.7±3.6
乙酸 1.0 1.06±0.08 106.3±7.8 0.83±0.05 82.8±6.4 0.88±0.06 88.0±6.5
马来酸 0.1 0.09±0 92.4±1.8 0.09±0.01 93.3±8.4 0.09±0.00 86.2±1.7
柠檬酸 2.0 1.84±0.10 92.2±5.4 2.17±0.10 108.6±4.8 2.01±0.12 100.2±5.9
琥珀酸 2.5 2.41±0.12 96.5±4.8 2.32±0.03 92.7±1.5 2.24±0.10 89.5±4.5