全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 355
脯氨酸测定方法的改进
职明星* 李秀菊
河南科技学院农业生物工程研究所，河南新乡453003
Improvement on the Method for Measuring Proline Content
ZHI Ming-Xing*, LI Xiu-Ju
Agricultural Biotechnology Institute, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang, Henan 453003, China
提要 25 mg·mL-1 的酸性茚三酮溶液至少可以保存35 d，它与同体积脯氨酸充分反应的最大浓度为156 mg·mL-1，当样品提
取液的浓度大于 100 mg·mL-1 时，需适当稀释。酸性茚三酮与脯氨酸充分显色的时间至少 30 min 沸水浴。
关键词 脯氨酸; 酸性茚三酮; 测定方法
收稿 2004-11-11 修定 　 2005-03-14
资助 河南省高校创新人才培养工程项目(2001513)。
*E-mail: sxhzmx@hist.edu.cn, Tel: 0373-3040483
测定植物脯氨酸含量一般多采用酸性茚三酮
显色法。已有文献表明，酸性茚三酮在 4℃低温
避光处可以稳定保存 1~3 d[1~10]，因此需随用随
配，很不方便。另外，不同实验指导书中测定
的样品提取液和酸性茚三酮在沸水浴中加热时间也
不一样。通常认为，当脯氨酸的含量在10 mg·mL-1
以下，同时显色液中茚三酮的浓度要达到 1 0
mg ·mL -1 时才能保证脯氨酸充分反应[11]。为此，
我们对酸性茚三酮显色测定脯氨酸的方法作了一些
改 进 。
实验方法
1 溶液的配制与保存
配制25 mg·mL-1 酸性茚三酮溶液时，称取茚
三酮5.0 g，放入500 mL的烧杯中，加入120 mL
的冰醋酸和80 mL的6 mol·L-1磷酸，于70℃的水
浴锅中加热溶解。
配制脯氨酸标定溶液时，称取0.050 g 脯氨
酸，配成100 mg·mL-1 溶液 500 mL。取部分溶液
稀释 1 倍，得到 50 mg·mL-1 的脯氨酸溶液。
2 显色时间的测定
分别取浓度为50 和 100 mg·mL-1 的脯氨酸溶
液各2 mL，放入50 mL的试管中。再加25 mg·mL-1
酸性茚三酮 2 mL 和冰醋酸 2 mL，混匀后放入水
浴锅中煮沸，每隔5 min后重复1次，共计10组。
最后一组试管煮沸 5 min 后，取出全部试管，在
常温下冷却后加 20 mL 的甲苯，充分振荡萃取静
置后，用756分光光度计测定520 nm(最大吸收峰)
处的光密度。重复 4 次。
根据脯氨酸与酸性茚三酮反应产物与其含量
的多少成正比的关系，从煮沸时间最短的开始，
对两种不同浓度溶液(50 和100 mg·mL-1的脯氨酸)
反应生成物的测定值(OD 值)进行连续的相关分
析，以检验结果的可靠性。
3 脯氨酸溶液与同体积25 mg·mL-1的酸性茚三酮
充分反应的最大浓度的测定
取4 mL 的 20 000 mg·mL-1 脯氨酸溶液，用2
倍稀释法依次稀释至浓度为2.44 mg·mL-1，再分别
加入2 mL 的 25 mg·mL-1 酸性茚三酮和2 mL冰醋
酸混匀，然后放入水浴锅中煮沸 30 min 充分显
色。取出冷却后加入 20 mL 甲苯萃取。用 756 分
光光度计测定 520 nm 处的光密度。重复 4 次。
确定脯氨酸最大浓度时，先根据测定值做出
脯氨酸和 O D 值关系的实测图。从理论上来讲，
OD值的大小和脯氨酸含量应该在一定的范围内成
直线关系，当脯氨酸含量很高时，茚三酮反应完
毕，反应曲线会变成一条与 X 轴平行的直线，即
OD 达到一个稳定值，最大值就是在该稳定点对
应的脯氨酸含量。用 SPSS 统计软件，做出线性
回归模拟直线方程，但是并不能找到该稳定值。
因为该反应属于有机反应，当茚三酮含量低于一
定值时，并不能按固定的比例进行反应，所以最
大值应在实测值近似直线段。为了准确找到这一
最大值，我们依据试验设计时脯氨酸含量呈二倍
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法增加，O D 值相应也呈二倍关系，做出 O D 值
之间的倍数值，并计算其与 2 之间的差异显著
性。另外，计算每递增一组脯氨酸和 OD 值的相
关系数，验证浓度的最大值。
4 酸性茚三酮溶液保存时间的测定
按照上述方法每隔5 d配制25 mg·mL-1 200 mL
的酸性茚三酮溶液，并将其均分到100 mL的试剂
瓶中，分别放在 4 和 -20℃的冰箱中待用。连续
配置 8 次，最后一次配制后的第 2 天进行测定。
从每次配制的25 mg·mL-1 酸性茚三酮溶液中
各取 2 mL 加到 50 mL 的试管中，分两组，再分
别加入2 mL 冰醋酸 +2mL 的 50 mg·mL-1 脯氨酸溶
液和2 mL 冰醋酸 +2 mL 的 100 mg·mL-1 脯氨酸溶
液，混匀后放入水浴锅中煮沸30 min 充分显色。
取出冷却后，加 20 mL 甲苯，充分振荡萃取。用
756 分光光度计测定520 nm 处的光密度变化。
实验结果
1 显色时间对测定结果的影响
由图 1 可知，在沸水浴煮沸的初期，50 和
100 mg·mL-1的脯氨酸溶液的OD值均随显色时间的
增加而逐渐增大，30 min左右达到相对稳定的值，
说明测定脯氨酸的显色时间达到30 min以上即可。
两个溶液的相关系数均大于0.99，说明两者的变
化趋势相似。这与张殿忠等[11]的结果基本相似。
2 酸性茚三酮与脯氨酸反应的关系
现有的实验指导书中，制作标准曲线设定的
脯氨酸浓度一般为 6~25 mg·mL-1，这一浓度范围
内的 OD 值依然较低[11]，而且都没有明确指出 25
mg·mL-1 的酸性茚三酮溶液与同体积的脯氨酸充分
反应的最大浓度是多少。一般来说，随着脯氨酸
浓度的增大，反应产物也应同比例增大，脯氨酸
浓度达到最大值后，反应产物即由于茚三酮不足
而无法继续生成红色产物，以致红色产物的 O D
值不再随脯氨酸浓度的增加而等比例增大。我们
按照浓度加倍法依次从低浓度到高浓度增加脯氨酸
含量，分别与同体积的25 mg·mL-1 的酸性茚三酮
溶液反应，测定反应产物的 OD 值时，发现脯氨
酸的浓度小于156.25 mg·mL-1时，脯氨酸的浓度增
大 1 倍，OD 值也增大 1 倍，相关系数均在 0.99
以上(表 1 )。可见，脯氨酸的浓度在 1 5 6 . 2 5
mg·mL-1 以下时，同体积的25 mg·mL-1 酸性茚三酮
可与之充分反应。
3 酸性茚三酮溶液保存时间与贮藏温度的关系
由图 2 可见，在 4 和 -20℃暗条件下保存 0~
35 d的酸性茚三酮溶液，均能与同体积浓度分别
为50 和 100 mg·mL-1 的脯氨酸溶液充分反应后的
O D 值之间保持一个稳定值，而且浓度为 1 0 0
mg·mL-1 脯氨酸的OD 值是浓度为50 mg·mL-1 脯氨
酸的OD值的 2倍。这说明在 -20 和 4℃暗条件下
的酸性茚三酮至少可以保存35 d。这比现有方法
中采用4℃下暗条件保存2~3 d延长了 30 d [1,2]，
这样测定更加准确和方便。另外，-20 和 4℃的
图1 显色时间与OD值的关系
表1 不同浓度脯氨酸及其与同体积25 mg·mL-1的酸性
茚三酮反应产物的 OD 值的关系
脯氨酸溶液 OD520 OD值2n/n 相关系数 浓度/mg·mL-1
0 0
2.44 0.018 1
4.88 0.036 2.042 0.999
9.77 0.073 2.008 0.999
19.53 0.149 2.045 0.998
39.06 0.311 2.093 0.999
78.13 0.642 2.066 0.999
156.25 1.260 1.963 0.999
312.50 2.250 1.786** 0.998
625.00 3.720 1.653** 0.993
1 250.00 6.075 1.633** 0.989
2 500.00 8.820 1.452** 0.976
5 000.00 10.890 1.235** 0.941
10 000.00 10.740 0.986** 0.849
20 000.00 10.758 1.002** 0.758
　　OD520 值为 4 次重复的平均值；OD 值 2n/n 为两个相邻浓度
脯氨酸显色产物的 O D 值的比值，其理论值为 2 。
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贮藏条件对试剂没有明显的影响。
讨　　论
由于我们的实验仅做到保存35 d，此后是否
还可以继续使用尚需进一步探讨。但一般情况
下，用脯氨酸测定抗逆性的实验，1 个月时间就
能满足实验要求。
为了更准确测定脯氨酸含量，保证反应液中
有充足的酸性茚三酮，当样品提取液中脯氨酸浓
度大于100 mg·mL-1时，建议样品提取液作适当稀
释后测定。如果产物中出现悬浮物时，应考虑样
图2 酸性茚三酮保存时间与贮藏温度对OD值的影响
品提取液的稀释或者增加甲苯的使用量。但增加
甲苯使用量时需要增加萃取时间和振荡次数，而
且这也仅局限于呈现极少量悬浮物时。反之，如
果样品提取液中脯氨酸含量较低和产物较少时，
要适当减少甲苯的使用量，使测得的 OD 值尽可
能保持在理想的范围内。
此外，所用试剂中的脯氨酸为白色结晶或者
白色结晶性粉末，茚三酮为白色或浅黄结晶性粉
末。如果出现结块或变色时，应注意其质量问题。
参考文献
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