全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月 499
青稞中b-1,3-葡聚糖酶的纯化及其抗血清的制备
黎柳君 魏慧敏 吴守锋 郭军伟 杜林方*
四川大学生命科学学院，成都 610064
Purification and Preparation of Antibody of b-1,3-Glucanase from Highland
Barley
LI Liu-Jun, WEI Hui-Min, WU Shou-Feng, GUO Jun-Wei, DU Lin-Fang*
College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China
提要 萌发的青稞种子经醋酸钠缓冲液抽提，50%~85% 硫酸铵分级沉淀，DEAE-Cellulose 52、CM-Sepharose Fast Flow
离子交换层析和 Sephadex G-75 分子筛层析，得到具活性的 b-1,3- 葡聚糖酶。SDS-PAGE 检测显示分子量 27 kDa 左右的
主带(95%)。将纯化的b-1,3- 葡聚糖酶对新西兰兔进行免疫制备抗血清，双向免疫扩散测定效价为 1:64。免疫印迹分析表
明纯化的 b-1,3- 葡聚糖酶免疫杂交带亦在 27 kDa 处。
关键词 b-1,3- 葡聚糖酶；青稞；纯化；抗血清；免疫印迹
收稿 2005-11-07 修定　 2006-03-13
资助　 高等学校骨干教师资助计划(20006502)。
*通讯作者(E-mail: dulinf@mail.sc.cninfo.net, Tel: 028-
85412766)。
b-1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)存在于大多数高
等植物种子中(Leubner-Metzger和Meins 1999)，
按植物种类、生理发育期或细胞定位的不同，认
为存在一个同功酶家族；按分子量、等电点、蛋
白一级结构、细胞定位、作用方式分为多种类型
(Leubner-Metzger 2003)。b-1,3-葡聚糖酶在细胞
分裂、小孢子发生、胚发生等生理发育活动中起
作用，且很有可能参与植物抵抗真菌的防御反
应，是一类重要的与病程相关的蛋白(pathogen-
esis-related protein, PR-2) (Leubner-Metzger 2003)。
青稞(Hordenm vulgare var. nudum Hook. F.)是我国
西藏和青海地区特有的高原作物，我们曾在青稞
种子的胚中检测到几种 b-1,3-葡聚糖酶，并分离
纯化了其中的一种(Ding等2003)。本文从青稞种
子抽提物 50%~85% 硫酸铵组分中，纯化出另一
种 b-1,3-葡聚糖酶，并制备其特异性抗血清，为
从分子水平上研究 b-1,3-葡聚糖酶提供了方法。
材料与方法
1 材料
青稞(Hordenm vulgare var. nudum Hook. F.)种
子采自西藏地区。
2 b-1,3-葡聚糖酶的分离纯化
取 100 g 青稞种子，经 0.02% 硝酸汞消毒，
用水冲洗后置于湿润纱布上于20℃下萌发40 h。
种子以1:3.5 (W/V) 加入冰冷的匀浆缓冲液A [50
mmol·L-1 醋酸钠，10 mmol·L-1 EDTA，5 mmol·L-1
b-巯基乙醇，10 mmol·L-1 苯甲基磺酰氟(PMSF)，
pH 5.0]，捣碎，静置40 min，离心(15 000×g，
20 min)，上清液为粗酶液。
粗酶液用 50 % ~ 8 5 % 饱和硫酸铵分级沉淀，
15 000×g 离心45 min，沉淀用缓冲液B (50 mmol·L-1
Tris-HCl，10 mmol·L-1 EDTA，5 mmol·L-1 b- 巯
基乙醇，pH 8.0)溶解，并对缓冲液B透析过夜。
已透析的酶液经预先用缓冲液 B 平衡好的 DEAE-
Cellulose 52离子交换柱(2 cm×8 cm)吸附，收集穿
透峰(活性峰)，对缓冲液C (20 mmol·L-1 醋酸钠，
10 mmol·L-1 EDTA，5 mmol·L-1 b-巯基乙醇，pH 5.0)
透析过夜，浓缩后上预先用缓冲液 C 平衡好的
CM-Sepharose Fast Flow离子交换柱(2 cm×8 cm)。
先用缓冲液 C 洗脱至 A280<0.05，再换用 0~0.5
mol·L-1 NaCl溶液进行线性梯度洗脱，收集活性组
分。冷冻干燥浓缩活性组分，施于缓冲液D (100
mmol·L-1 NaCl，20 mmol·L-1 醋酸钠，10 mmol·L-1
b- 巯基乙醇，pH 7.0)预先平衡好的葡聚糖凝胶
[Sephadex G-75柱 (1.2 cm×60 cm)]，流速18 mL·h-1，
并收集活性组分，得到4.1 mg b-1,3-葡聚糖酶。
以上步骤均在 4℃度下操作。
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3 蛋白质浓度与酶活性的测定
蛋白质浓度测定按 Bradford 法(Bradford
1976)，以牛血清白蛋白(BSA)为标准。0.1% (w/v)
海带多糖(Sig m a 公司)作为反应底物，DNS 法
(Wood 和 Bhat 1988) 测定反应生成的还原糖量。
1个单位的b-1,3-葡聚糖酶活力定义为1 min水解
生成1 mmol 还原糖(mmol·min-1·mg-1) (Ding等
2003)。
4 SDS-PAGE 及分子量测定
SDS-PAGE 参照 Laemmli 系统(Laemmli
1970)，分离胶和浓缩胶浓度分别为 15% 和 6%，
用考马斯亮蓝R-250染色。标准蛋白为Pharmcia
公司产品。
5 抗血清的制备和检测
5.1 抗血清的制备和效价的测定 参照张龙翔等
(1997)方法略有改动。基础免疫(0 d)为0.5 mL 2.0
mg ·mL-1 抗原加等体积的福氏完全佐剂，完全乳
化后注射于新西兰雌免腹股沟皮下及后脚掌；加
强免疫(10、20和30 d)为0.6 mL 2.0 mg·mL-1抗
原加等体积的福氏不完全佐剂，完全乳化后注射
于腹股沟皮下及后脚掌；第 3 次免疫后的第 3 天
耳静脉采血，用双向免疫扩散法(张龙翔等1997)
检测抗血清效价。若效价符合要求，第 4 次免疫
后的第8天进行心脏主动脉采血，4℃静置8 h后
离心(3 000×g，10 min)，吸取抗血清分装，-20℃
保存备用。
5.2 免疫印迹 粗酶液和纯化的b-1,3-葡聚糖酶经
SDS-PAGE 分离后，电转移至偏氟聚乙烯(PVDF)
膜上(Archambault等 1998) (400 mA，2 h)，在
含 5%脱脂奶粉的TTBS (20 mmol·L-1 Tris-HCl、
0.1% Tween 20、100 mmol·L-1 NaCl，pH 7.5)溶
液中封闭8 h。然后与 b-1,3-葡聚糖酶抗血清(按
照 1:2 000 稀释)室温孵育2 h，TTBS 洗膜 4次，
每次5 min。再用辣根过氧化物酶(HRP)耦联的羊
抗兔IgG抗体(按照1:10 000稀释)室温孵育1 h，
TTBS洗膜4次，每次5 min。用增强化学发光试剂
(ECL) (Amersham公司)进行反应，曝光，观察结果。
实验结果
1 b-1,3-葡聚糖酶的分离纯化
萌发青稞种子经醋酸钠缓冲液抽提，50 % ~
85%硫酸铵分级沉淀，DEAE-Cellulose 52和 CM-
Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-
75分子筛层析，获得 b-1,3-葡聚糖酶。SDS-PAGE
检测显示分子量27 kDa 左右的主带(95%)，并存
在非常微弱的副带(图 1)。
图1 纯化的b-1,3-葡聚糖酶SDS-PAGE分析
　　1：50%~85% (NH4)2SO4 沉淀组分(20 mg) ；2：DEAE-
Cellulose 52层析穿透峰(20 mg) ；3：CM-Sepharose Fast Flow
梯度洗脱组分(10 mg) ；4：Sephadex G-75 纯化的 b-1,3- 葡聚
糖酶(1 0 mg ) ；M：标准蛋白质分子量。
图2 双向免疫扩散图
中心孔为抗血清，周围孔为 b-1,3- 葡聚糖酶。
2 抗血清效价的测定
将纯化的b-1,3-葡聚糖酶对新西兰雌兔进行
免疫，制备抗血清。双向免疫扩散试验呈现一条
清晰沉淀线(图 2)，表明抗血清效价为 1:64。
3 抗血清特异性检测
免疫印迹分析显示：制备的抗血清与纯化的
b-1,3- 葡聚糖酶发生免疫反应，只在分子量 27
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27 kDa处有一条明显的免疫杂交带，表明其能专
一性地识别 b-1,3-葡聚糖酶。抗血清与粗酶液免
疫印迹时，除 27 kDa 的明显免疫杂交带外，还
出现67 kDa处微弱杂交带，推测粗酶液中可能存
在另一种分子量为67 kDa的b-1,3-葡聚糖酶，它
与27 kDa b-1,3- 葡聚糖酶的抗血清存在交叉反
应，是否如此，尚待进一步研究。免疫印迹时
我们曾采用增强化学发光(ECL)法，比常规的显色
法快速和灵敏。
参考文献
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activities. Method Enzymol, 160: 87~112
kDa 处出现单一杂交带，说明 b-1,3- 葡聚糖酶抗
血清制备成功；与粗酶液反应出现 2 条杂交带，
27 kDa 处的杂交带明显，而 67 kDa 处的杂交带
微弱(图 3)。
讨　　论
b-1,3-葡聚糖酶参与植物多种生理过程，如
花粉发育、受精、胚乳储藏物质的动用及细胞分
化等(Leubner-Metzger 2003)。有人认为b-1,3-葡
聚糖酶是种子萌发时的关键物质(Leubmer-Metzger
等 1995)。b-1,3- 葡聚糖酶大量表达和聚集，以
降解种皮和胚乳中可溶性 b-1,3-葡聚糖，从而利
于萌发胚的穿出(Bewley和Blank 1994)。分离得到
分子量为27 kDa的b-1,3-葡聚糖酶主带，并伴有
微弱的副带(图1)。我们用此方法曾从青稞发芽的
胚中分离到32 kDa的碱性b-1,3-葡聚糖酶(Ding等
2003)，查明青稞种子中存在至少2种b-1,3-葡聚
糖 酶 。
制备的抗血清与纯化的b-1,3-葡聚糖酶只在
图3 b-1,3-葡聚糖酶SDS-PAGE图谱与免疫印迹
　　样品经 SDS-PAGE (15%)，电转印到 PVDF 膜上，与制
备的抗血清(1:2 000)杂交。a：考马斯亮蓝染色；b：免疫印
迹检测。1 和 3：粗酶液(5、0.5 mg) ；2 和 4：纯化的 b-1,
3- 葡聚糖酶(5、0.5 mg)。