全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (3): 365–371　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0660 365
收稿 2015-12-09　　修定 2016-01-27
资助 农业部现代农业技术体系苹果专项资金(MATS Z2250-
20701)。
* 通讯作者(E-mail: renxl@nwsuaf.edu.cn)。
苹果MdHB-1基因启动子中的乙烯响应元件对外源乙烯的响应分析
王豪杰1, 姜永华1, 刘艳利1, 戚英伟2, 刘翠华1, 任小林1,*
1西北农林科技大学园艺学院, 陕西杨凌712100; 2宁夏大学农学院, 银川750021
摘要: 通过PlantCARE和PLACE软件在线分析预测表明, 在苹果MdHB-1启动子中存在一个乙烯响应元件(距ATG上游576 bp)。
为了探究该启动子中的乙烯响应元件对不同浓度乙烯的响应, 以苹果品种‘皇家嘎拉’ (Malus domestica Borkh. cv. Royal
Gala)基因组DNA为模板, 用PCR方法扩增得到长度分别为680 bp (含有乙烯响应元件)和485 bp (不含有乙烯响应元件)的启
动子序列, 构建GUS报告基因瞬时表达载体, 依靠农杆菌介导转化烟草叶片, 检测经过不同浓度乙烯利(0、500、1 000和1 500
mg·L-1)处理的转基因烟草叶片的GUS蛋白活性。结果表明, 该乙烯响应元件受到外源乙烯正调控作用, 随着处理的外源乙
烯浓度的增大, 正调控效应先升高达到最大值后逐渐减弱, 500 mg·L-1乙烯利能最大程度地提升乙烯响应元件活性。
关键词: 苹果; MdHB-1; 瞬时表达; 乙烯响应元件
苹果MdHB-1基因 (GenBank登记号JQ678788)
可编码336个氨基酸, 含有HD-Zip结构域, 属于HD-
Zip家族转录因子。于巧平等(2012)首次从苹果‘皇
家嘎拉’花器官中克隆得到MdHB-1基因, 与拟南芥
AtHB-1有49%同源性、与番茄LeHB-1有58%同源
性, 而在HD-Zip保守区与拟南芥和番茄的同源性
分别达到87%和85%。HD-Zip转录因子为植物所
特有(Ariel等2007), 在植物中的生物学功能也是多
种多样的, 如调控LeACO1基因的表达(Lin等2008),
参与平衡赤霉素(GAs)与乙烯(ETH)、脱落酸(ABA)
之间的关系, 调控玫瑰衰老进程(Lu等2014), 以及
光敏色素B通过负调控AtHB-2的表达来抑制细胞
伸长(Steindler等1997)等。李兴亮(2014)研究发现
MdSnRK2.4可以磷酸化修饰MdHB-1, 调节其活性
进而影响乙烯合成关键酶MdACO1。现有报道指明
MdHB-1可能调控MdACO1的表达, 而有关MdHB-1
转录因子的其他方面的功能则未见有报道。
启动子是能与转录因子和RNA聚合酶结合从
而调控该启动子下游基因的一段DNA序列(聂丽
娜等2008; 王璇等2014), 在基因的转录频率、转录
起始、表达程度方面等都起到极其重要的作用(卢
荣江等2015), 而启动子上的各种响应元件则是其
响应各种不同环境因素的关键区域, 针对启动子
上响应元件的研究有助于深入了解启动子感应外
界环境变化进而调控基因表达的机制, 为挖掘基
因的功能以及将基因推向实际应用奠定良好的基
础。通过将不同启动子片段与报告基因连接, 构
建植物瞬时表达载体, 是研究启动子功能和顺式
作用元件的简便、有效的方法(余丽等2010)。为
了初步探究位于苹果转录因子MdHB-1启动子上
游−576 bp的乙烯响应元件对外源乙烯的响应特
征, 克隆获得了长度为680和485 bp的MdHB-1启动
子片段并构建瞬时表达载体, 转化烟草叶片。经
过不同浓度乙烯利诱导处理, 依据GUS蛋白的酶
活性的变化来反映乙烯响应元件在该启动子中的
作用。这对于了解乙烯对MdHB-1基因的影响以
及该基因对乙烯合成的调控有一定的参考作用。
材料与方法
1 植物材料与主要试剂
苹果品种‘皇家嘎拉’ (Malus domestica Borkh.
cv. Royal Gala)种植于西北农林科技大学园艺场;
本氏烟(Nicotiana benthamiana)烟草种子由本实验
室保存, 将烟草种子种于无菌基质中, 待长出5~6
片叶时可用于侵染。
DNA marker、限制性内切酶、T4 DNA连接
酶购自TaKaRa生物工程有限公司, 2×Es Taq Mas-
terMix购自北京康为世纪生物科技有限公司, 胶回
收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技公
司, GUS蛋白组织化学染色底物X-Gluc (5-溴-4-
氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸)、检测GUS蛋白活性
的反应底物4-MUG (4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛
酸苷)和荧光标曲制作所需标样4-MU (4-甲基伞形
酮)均购于北京索来宝生物科技有限公司。
植物生理学报366
2 菌株和质粒
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株
EHA105、瞬时表达载体pCMBIA0390由本实验室
保存, 大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH5α
购自天根生化科技公司, pMD19-T载体购自TaKa-
Ra生物工程有限公司。
3 MdHB-1基因启动子中乙烯响应元件特征分析
PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/
webtools/plantcare/html/) (Lescot等2002)和PLACE
(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?lang=
en&pj=640&action=page&page=newplace) (Higo等
1998)可在线预测启动子的顺式作用元件的位置、
序列、功能以及含有相似元件的物种。
4 苹果MdHB-1基因缺失启动子的克隆及重组T载
体的构建
采取改良的CTAB法(Doyle和Doyle 1987)提
取‘皇家嘎拉’苹果叶片基因组DNA, 经1%琼脂糖
凝胶电泳检测完整, 可用于后续试验。根据苹果
基因组电子序列运用Primer5.0软件设计克隆缺失
启动子引物(表1)。以苹果基因组DNA为模板, 在
20 μL PCR扩增体系(10 μL 2×Es Taq MasterMix、
6.4 μL无菌ddH2O、2 μL DNA模板、0.8 μL
MdPS、0.8 μL MdPA)和PCR扩增程序(94°C预变性
3 min; 94°C 30 s, 57°C 30 s, 72°C 40 s扩增30个循环;
72°C延伸10 min)下克隆目的启动子。PCR产物纯
化回收后, 连入pMD19-T载体, 热击转化大肠杆菌
DH5α, 将50~100 μL已转化大肠杆菌菌液均匀地涂
布于含有100 mg·L-1氨苄青霉素的LB固体培养基
上, 37°C倒置培养48~36 h, 挑取单克隆放于含有氨
苄青霉素(100 mg·L-1)的LB液体培养基中, 在37°C
震荡培养7 h, 进行菌液PCR检测, 选取阳性克隆送
往北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。运
用DNAMAN软件比对测序结果, 挑选匹配的阳性
克隆, 进行后续实验。
5 瞬时表达载体的构建
扩繁已鉴定的大肠杆菌单克隆, 采用质粒提
取试剂盒提取重组T载体质粒pMD19T-Md680、
pMD19T-Md485和pCMBIA0390空载体质粒, 对以
上三种质粒分别进行双酶切(BamHI、EcoRI)处理,
纯化回收目的片段, 在4°C条件下连接12 h, 将重组
pCMBIA0390质粒转化大肠杆菌, 经硫酸卡那霉素
(50 mg·L-1)筛选和菌液PCR检测后, 扩繁阳性单克
隆, 提取质粒进行双酶切验证。
6 农杆菌转化及农杆菌介导的烟草转化
将已验证的重组pCMBIA0390载体通过CaCl2
冻融法转化到根癌农杆菌EHA105感受态细胞中,
吸取100~200 μL已转化的农杆菌菌液均匀地涂布
于含有硫酸卡那霉素(50 mg·L-1)和利福霉素(25
mg·L-1)的LB固体培养基上, 于28°C倒置培养2~3 d,
挑取单克隆, 进行菌液PCR验证, 获得阳性菌株。
吸取已鉴定过的20~30 μL根癌农杆菌菌液接种于
含有卡那霉素(50 mg·L-1)和利福平霉素(25 mg·L-1)
的LB液体培养基中, 放置于28°C、200 r·min-1条件
下振荡培养12~28 h, 离心(3 619×g, 5 min)收菌, 用
渗透缓冲溶液[27.8 mmol·L-1 d-葡萄糖、100
μmol·L-1乙酰丁香酮、50 mmol·L-1 2-(N-吗啉)乙磺
酸(MES)、2 mmol·L-1 Na3PO4]重新悬浮菌液, 将菌
液OD值稀释为0.3~0.4。选取长势、叶龄一致的
烟草叶片, 浸泡于农杆菌菌液中, 抽真空使菌液侵
入烟草叶片, 放于无菌培养皿中在光照培养箱(25°C、
光照时间16 h·d-1、光照强度216 μmol·m-2·s-1、湿度
75%)中培养。
7 启动子活性验证及不同浓度乙烯利处理转基因
烟草叶片
转基因烟草培养48 h后, 放于染色液[10 mL染
色液包含: 0.1 mL 50 mmol·L-1 K3Fe(CN)6、0.1 mL
50 mmol·L-1 K4Fe(CN)6、0.64 mL 1 mol·L
-1 Na2H-
PO4、0.36 mL 1 mol·L
-1 KH2PO4、0.2 mL 0.5
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物名称 序列(5′→3′) 限制性内切酶
MdP680S cg-ggatccGCGTCTCGTAAGCACCTTCCACAT BamHI
MdP680A cg-gaattcCTTTTCCGGCTAAACAACTGATCTCTT EcoRI
MdP485S cg-ggatccACCTAGAAGCGACACCCTG BamHI
MdP485A cg-gaattcTTCCGGCTAAACAACTGATC EcoRI
王豪杰等: 苹果MdHB-1基因启动子中的乙烯响应元件对外源乙烯的响应分析 367
mol·L-1 Na2EDTA、0.1 mL Triton X-100、1 mL甲
醇 , 以及30 mg X-Gluc溶于250 μL二甲亚砜
(DMSO)]中37°C染色12 h, 分别用75%和90%乙醇
脱色至乙醇无绿色然后拍照。配制浓度分别为
0、500、1 000和1 500mg·L-1的乙烯利溶液, 将已转
化24 h的转基因烟草叶片放于乙烯利溶液中浸泡5
min, 取出放于直径5 cm的无菌培养皿中, 在光照
培养箱中培养24 h, 液氮速冻进行下一步实验。
8 GUS蛋白荧光测定
将已经速冻的转基因烟草叶片研磨成粉状, 参
考Xu等(2010)的方法提取GUS蛋白进行荧光定量
分析, 每个处理进行4个重复。取GUS蛋白上清液5
μL, 用天根Bradford蛋白质定量试剂盒测定提取液
中蛋白含量。以每分钟水解4-MUG生成1 nmol
4-MU的酶量作为一个酶活力单位, GUS基因表达活
性以每毫克(mg)蛋白的酶活力来计算, 结果表示为
nmol (4-MU)·min-1·mg-1 (蛋白)或pmol (4-MU)·min-1·mg-1
(蛋白)。蛋白标准曲线按照天根试剂盒测蛋白说明
书进行, 4-MU荧光标曲以100 nmol·L-1、1、10、100
μmol·L-1浓度梯度进行制作。
实验结果
1 MdHB-1基因启动子中乙烯响应元件特征分析
经过PlantCARE和PLACE在线软件预测分析,
该乙烯响应元件位于起始密码子ATG上游−576 bp
位置, 序列为ATTTCAAA, 该元件已在番茄(Lycop-
ersicon esculentum) (Montgomery等1993)、康乃馨
(Dianthus caryophyllus) (Itzhaki等1994)、智利番茄
(Lycopersicon chilense) (Tapia等2005)和茄子(Sola-
num melongena) (Rawat等2005)上报道过。
2 苹果MdHB-1基因缺失启动子的克隆
以纯化的‘皇家嘎拉’苹果基因组DNA为模板,
通过PCR反应克隆长度分别为680和485 bp的启动
子片段, 回收纯化后连入pMD-19T载体, 经菌液
PCR检测获得阳性克隆, 然后测序验证所克隆序列
为目标序列, 结果见图1。
3 GUS瞬时表达载体的构建及根癌农杆菌的转化
本试验选取含有CaMV35S的重组pCMBIA0390
作为阳性对照(本实验室已有菌株)、野生烟草叶
片作为阴性对照 , 将已经过双酶切验证的重组
pCMBIA0390载体(图2)和pCaMV35S0390载体通
过CaCl2冻融法分别转入根癌农杆菌EHA105感受
图1 MdHB-1基因启动子的琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the promoter of MdHB-1
M: DL 2000 marker; 1: MdHB-1启动子680 bp片段; 2: MdHB-1
启动子485 bp片段。
图2 重组pCMBIA0390质粒双酶切检测
Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant pCMBIA0390
M: 15 000 marker; 1: MdHB-1启动子680 bp片段; 2: MdHB-1
启动子485 bp片段。
态细胞中, 经硫酸卡那霉素和利福平霉素筛选并
通过菌液PCR验证, 结果显示已成功获取两种启动
子不同片段的GUS蛋白瞬时表达载体(图3)。
4 启动子诱导GUS基因在转基因烟草中的瞬时表
达分析
将经过鉴定的含有pCMBIA0390-CaMV35S、
pCMBIA0390-MH680和pCMBIA0390-MH485的
EHA105农杆菌扩大培养、离心收菌、用缓冲悬浮
液重新悬浮稀释, 通过抽真空使农杆菌侵入烟草
组织, 培养48 h后进行组织化学染色(图4)。经过组
织染色, 显示三种启动子均具有启动GUS基因表达
植物生理学报368
的能力。说明680和485 bp这两个片段的启动子含
有所必须的启动元件, 具有启动子活性。
5 MdHB-1启动子对不同浓度乙烯利的响应分析
分别用浓度为0、500、1 000和1 500 mg·L-1
乙烯利处理含有680和485 bp启动子的转基因烟草,
经过GUS蛋白荧光定量分析显示, 两种转基因烟
草在500和1 000 mg·L-1外源乙烯处理条件下, GUS
蛋白活性均上调。当乙烯利浓度增大为1 500
mg·L-1时, GUS蛋白活性下降, 基本恢复到对照水
图3 CaMV35S启动子和MdHB-1基因启动子瞬时表达载体
示意图
Fig.3 Transient expression vector of CaMV35S and the pro-
moter of MdHB-1
从上至下依次为CaMV35S、MdHB-1启动子680 bp和485 bp片段。
图4 转基因烟草叶片的GUS组织化学染色
Fig.4 Histochemical staining of the transgenic tobacco
A~D分别为含有CaMV35S启动子、MdHB-1启动子680 bp、485 bp片段和野生型(阴性对照)烟草叶片。
平。两个启动子序列(680和485 bp)相对于对照组,
经过500 mg·L-1乙烯利处理的GUS蛋白活性分别上
调2.5和2.8倍, 经过1 000 mg·L-1乙烯利处理的GUS
蛋白活性分别上调1.6和1.8倍, 当用1 500 mg·L-1乙
烯利处理时, GUS蛋白活性则上调0.86和1.2倍。在
乙烯利处理条件下, 含有680 bp启动子的转基因烟
草GUS蛋白活性要明显低于含有485 bp启动子的
转基因烟草(图5)。
讨　　论
启动子中的顺式作用元件作为转录调控的重
点区域, 能够响应外界环境变化进而调控基因的
表达, 在其调控中起着不可或缺的作用。本研究
中首先对启动子序列进行软件分析预测, 发现在
ATG上游−576 bp位置存在一个乙烯响应元件, 序
列为ATTTCAAA, 该序列与康乃馨、智利番茄中
乙烯响应元件序列一致, 而与番茄、茄子中的乙
烯响应元件存在一定差异(表2), 根据报道称该元
件参与番茄果实的成熟、康乃馨的衰老和智利番
茄的胁迫响应等(Montgomery等1993; Itzhaki等
1994; Tapia等2005)。构建两个启动子瞬时表达载
图5 不同浓度乙烯利处理转基因烟草GUS蛋白活性荧光定
量分析
Fig.5 Fluorescent quantitative analysis of the transgenics
tobacco treated by ethephon in different concentrations
P485: 含有485 bp启动子的转基因烟草; P680: 含有680 bp启
动子的转基因烟草。
体, 通过化学组织染色显示, 两个启动子片段(680
和485bp)都具有启动GUS基因表达的活性, CaM-
V35S强启动子强烈促进GUS基因的表达。Xu等
(2010)推测在VpSTS基因启动子−1559~−749 bp的
王豪杰等: 苹果MdHB-1基因启动子中的乙烯响应元件对外源乙烯的响应分析 369
位置存在调控抑制区域, 致使含有长度为749、
467和162 bp启动子的活性高于含有1 559 bp的启
动子。在本实验中, 含有680 bp启动子的GUS蛋白
活性明显低于含有485 bp启动子的GUS蛋白活性,
推测可能是由于在485~680 bp这个区域内存在抑
制区域, 抑制启动子的活性所致。经过不同浓度
乙烯利处理, 两个启动子片段都可以响应乙烯诱
导, 并且在500 mg·L-1乙烯利处理时, 都可以诱导启
动子使GUS蛋白活性达到最大值。随着乙烯利浓
度的增大, GUS蛋白活性下降。朱敏等(2014)研究
发现外源乙烯处理‘皇家嘎拉’苹果, MdHB-1基因
表达量在0~1 d下调, 在7~21 d表达量升高, 在21 d
达到最大值。吕培涛(2014)用乙烯处理能够显著
诱导RhHB-1的表达。结合本研究我们推测乙烯对
‘皇家嘎拉’苹果MdHB-1基因的调控可能涉及启动
子的多个区域, 在不同的发育时期, 由相应的启动
子区域参与调控苹果对乙烯的响应。Yang等
(2013)指出植物基因转录调控复杂多变, 基因启动
子中的激素响应元件往往存在位置、序列和预测
不一致的现象。Xu等(1996)研究表明, 在番茄成熟
期间, E4基因响应乙烯的调控转录可能涉及至少
两个顺式作用元件。余丽等(2010)推测乙烯和茉
莉酸针对病程相关基因(pathogenesis-related gene)
的调控涉及到启动子的多个区域。植物针对外界
环境的反应, 大多数情况下有多种激素参与共同
调控(Mauch-Mani和Mauch2005; 袁晶等2005), 由
此我们推测外源乙烯对485 bp启动子诱导作用更
加明显, 可能是由于在485 bp区域内存在未知的可
以响应乙烯的元件或者由于在乙烯的诱导下, 其
他某种激素参与调控485 bp启动子的活性。综上
所述, 乙烯对‘皇家嘎拉’苹果MdHB-1基因启动子
的调控可能涉及该启动子的多个区域, 不同浓度
乙烯对与乙烯响应元件结合的乙烯响应因子的调
控作用不同, 也可能是乙烯调控该启动子的影响
因素之一, 因此我们将继续深入地探究这一顺式
作用元件在苹果MdHB-1启动子中的作用机制, 为
解析MdHB-1基因在苹果乙烯代谢调控中的作用
提供重要的实验证据, 也为挖掘MdHB-1基因其他
的功能提供一些线索。
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表2 乙烯响应元件信息
Table 2 The information of ethylene-responsive elements
物种 基因名称 序列
番茄 E4 AATTCAAA
康乃馨品种‘White Sim’ GST1 ATTTCAAA
智利番茄 TLC1.1 ATTTCAAA
苹果品种‘皇家嘎拉’ MdHB-1 ATTTCAAA
茄子 SmCP AATTCAAA/G
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Response analysis of the ethylene-responsive element of MdHB-1 promoter to
exogenous ethephon
WANG Hao-Jie1, JIANG Yong-Hua1, LIU Yan-Li1, QI Ying-Wei2, LIU Cui-Hua1, REN Xiao-Lin1,*
1College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, China; 2Agricultural College, Ningxia University,
Yinchuan 750021, China
Abstract: Through the analysis of PlantCARE and PLACE, there is an ethylene-responsive element which is
about 576 bp apart from the upstream of ATG exists in the promoter of MdHB-1 gene. In order to explore how
this cis-element responds to different levels of ethylene, 680 bp of the promoter having ethylene-responsive ele-
ment and 485 bp of the promoter not having the element were coloned by PCR method using the genomic DNA
of ‘Royal Gala’ apple (Malus domestica) as template. Two fragments were fused to a β-glucuronidase gene
(GUS) to construct transient expression vectors and then transformed into the wild tobacco by Agrobacteri-
um-mediated transient method. The quantitative fluorometric GUS of the transgenic tobacco treated with the
different concentrations of ethephon (0, 500, 1 000 and 1 500 mg·L-1) were detected. The results show that ethe-
phon could positively regulate the ethylene-responsive element of the promoter and, as the concentrations of the
ethephon rose, the activity of GUS increased in the first stage, and then decreased. The 500 mg·L-1 of ethephon
had the maximal promotion for the ethylene-responsive element.
Key words: Malus domestica; MdHB-1; transient expression; ethylene-responsive element
Received 2015-12-09 Accepted 2016-01-27
This work was supported by the Modern Agricultural Industry Technology System of China for Apple (Grant No. MATS Z225020701).
*Corresponding author (E-mail: renxl@nwsuaf.edu.cn).