全 文 ：Vol131 , No15
pp1 583 - 586 　May , 2005作 　物 　学 　报ACTA A GRONOM ICA SIN ICA第 31 卷 第 5 期2005 年 5 月 　583～586 页
转几丁质酶和β21 ,32葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定
叶兴国1 　程红梅2 　徐惠君1 　杜丽璞1 　陆维忠3 　黄益洪3 Ξ
(1 中国农业科学院作物科学研究所 ,北京 100081 ;2 中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081 ;3 江苏省农业科学院遗传生理研究所 ,江苏
南京 210014)
摘 　要 : 利用农杆菌介导法将几丁质酶基因和β21 ,32葡聚糖酶双价基因导入小麦品种扬麦 10 号和 Bobwhite ,共得到了
13 株 T0 代转基因植株 ,2 个小麦品种的转化效率分别为 114 %和 110 %。T1 代植株赤霉病抗性鉴定结果表明 ,转基因
植株对赤霉病具有一定抗性 ,小穗发病率 4176 %～11176 % ,低于抗病对照和感病对照。T1 代植株分子检测结果表明 ,
外源基因分离比例为 2133∶1 ,较低的分离比例可能与外源基因的丢失有关。
关键词 : 小麦 ;几丁质酶和β21 ,32葡聚糖酶基因 ;农杆菌 ;转基因 ;赤霉病
中图分类号 : S512
Development of Transgenic Wheat Plants with Chitinase andβ21 , 32Glucosanase
Genes and Their Resistance to Fusarium Head Blight
YE Xing2Guo1 ,CHEN G Hong2Mei2 ,XU Hui2J un1 ,DU Li2Pu1 ,LU Wei2Zhong3 ,HUAN G Yi2Hong3
(1 Institute of Crop Sciences , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081 ;2 Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Agricultural
Sciences , Beijing 100081 ;3 Institute of Genetics and Physiology , Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing 210014 , Jiangsu , China)
Abstract :Most wheat diseases are caused by fungi pathogens , such as scab , powdery mildew , rust and take all1 Twenty to
thirty years ago , scab mainly happened in Southeast China , but it has extended into northwest and northeast China in the
latest two decades1 In normal years , this disease makes wheat production lost by 10 percent to 20 percent , but 30 percent
in its popular years1 However , it is very difficult to develop resistant materials to such kind of disease only by traditional
breeding technique because of the limited resistant resource in wheat , even though local variety Sumai 3 has been efficiently
used in commercial breeding for many years1 Therefore , it is very important to transfer some genes related to the resistance
of scab into wheat by genetic transformation1 Chitinase andβ21 ,32glucosanase genes were proved to be useful in controlling
fungi diseases at different extent in various plants1 The purpose of this research is to introduce chitinase andβ21 , 32
glucosanase genes into wheat for improving its resistance to scab1 Based on such a target , chitinase gene andβ21 , 32
glucosanase gene side by side (called as GCE) were constructed into binary vector pCAMBIA3301 ( Fig11) , and then
transformed into C58c1 Agrobacterium strain1 The immature embryos isolated from Yangmai 10 and Bobwhite were pre2
cultured for four days on callus induction medium , and then infected by the Agrobacterium strain1 After co2cultivation
steps , the explants were cultured on selection medium with 10 - 25 mgΠL G418 for callus induction and plant regeneration
in order1 Identified by leaf painting and PCR analysis , 13 T0 transgenic plants were finally obtained from the two varieties ,
with transformation frequencies of 114 % and 110 % , respectively1 T1 plants were further tested for genetic analysis and
scab resistance1 Southern blot showed that the alien genes were integrated into wheat chromosome by 1 - 2 copies in most
transgenic plants ( Fig15) 1 Northern blot showed that the alien genes were transcribed stably into RNA almost in all
transgenic plants ( Fig16) 1 PCR result indicated that the segregation ratio of the alien genes was 2133∶1 in the T1 progeny
( Table 1) , and the low rate might be related to the losing of the foreign genes1 Field test showed that five transgenic lines
of GCE26 , GCE211 , GCE213 , GCE216 , and GCE221 appeared good resistance to Fusarium head blight , and the infected
floret frequency with the pathogen varied from 4176 % to 11176 % ( Table 2) 1 The GCE gene performed scab resistance inΞ基金项目 : 国家转基因植物研究与产业化专项资助课题 ( Y032B222) 。
作者简介 : 叶兴国 (1963 - ) ,宁夏平罗县人 ,博士 ,研究员。主要从事小麦、大豆遗传转化工作。E2mail : yexg @mail1caas1net1cn
Received(收稿日期) :2004204212 , Accepted(接受日期) :20042072181

wheat according to this study , and the transgenic materials obtained can be potentially used in wheat scab resistance
breeding1
Key words : Wheat ; Chitinase and β21 , 32glucosanase genes ; A grobacterium tumef aciens ; Transformation ;
Fusarium head blight
　　小麦大多数病害属真菌性病害 ,如赤霉病、白粉
病、锈病、全蚀病等。赤霉病是南方麦区的主要病
害 ,一般减产 20 %～30 % ,近 10 年已扩展到北方春
麦区 ,减产幅度 10 %～20 %。目前小麦育种中利用
的赤霉病抗性基因主要来自于地方品种望水白和苏
麦 3 号 ,抗源比较单一 ,表现为数量遗传性状[ 1 ] 。因
此 ,需要拓宽小麦对赤霉病等真菌性病害的抗源 ,尤
其是利用基因工程途径将其他植物甚至动物中的抗
真菌基因导入小麦 ,丰富小麦中的抗真菌性病害基
因[ 1 ] 。研究表明 ,几丁质酶 (chitinase) 基因和β21 ,32
葡聚糖酶 (glucosanase) 基因分别控制几丁质酶和β2
1 ,32葡聚糖酶的合成 ,可催化几丁质和葡聚糖的水
解反应 ,破坏真菌细胞壁 ,抑制真菌的侵染和繁
殖[ 2 ,3 ] 。
Brogile 等首先证明了几丁质酶基因在植物中
的抗真菌作用 ,转几丁质酶基因烟草和油菜对立枯
丝核菌 ( Rhizoctonia solani)引起的猝倒病具有明显
抗性[ 4 ] 。将几丁质酶基因和β21 ,32葡聚糖酶双价基
因导入水稻、棉花、烟草等作物 ,转基因植株分别对
稻瘟病、黄萎病和炭疽病等真菌性病害表现一定抗
性[ 5～8 ] 。吴丽芳等利用低能氩离子束介导法将来源
于水稻中的几丁质酶基因导入了小麦 ,初步证明转
基因植株对赤霉病菌具有抑制作用[ 9 ] 。在建立小麦
农杆菌介导稳定转化体系的基础上[ 10 ] ,将几丁质酶
基因和β21 ,32葡聚糖酶双价基因导入小麦 ,对于提
高小麦对赤霉病等真菌性病害的抗性具有重要
意义。
1 　材料和方法
111 　小麦材料及其培养
　　小麦受体材料扬麦 10 号和 Bobwhite 分别由江
苏里下河和地区农科所和美国内布拉斯加州立大学
提供。取开花后 13～14 d 左右的未成熟籽粒 ,用
70 %酒精灭菌 2～3 min ,酒精完全挥发后剥取幼胚
接种在 MM 培养基 (MS 附加 2 ,42D 015 mgΠL ,42氨
基23 ,5 ,62三氯吡啶甲酸 212 mgΠL ,MES 110 gΠL )
上 ,黑暗条件下预培养 4 d (24～25 ℃) 。
112 　农杆菌菌系和载体
用于本研究的农杆菌菌系 C58c1 由美国内布拉
斯加州立大学提供 ,植物表达载体 pCAMB IA3301
由澳大利亚国际农业分子生物学应用研究中心提供 ,
几丁质酶基因和β21 ,32葡聚糖酶基因 ( GCE) 由本课
题组克隆并连接到植物双元表达载体 pCAMBIA3301
上[11 ] ,重组后 DNA 质粒构造见图 1。
图 1 pCAMBIA3301 GCE重组质粒
Fig11 The T2DNA structure in the recombination plasmid of pCAMBIA3301 GCE
H : Hi nd Ⅲ, Ba : Bam H Ⅰ, Bg : B gl Ⅱ, E : EcoR Ⅰ, Sa : S am Ⅰ, Hp : Hpal Ⅰ
113 　农杆菌2小麦幼胚共培养
农杆菌经平板培养、小量培养、大量培养逐级激
活 , OD650值 016～018 时 3 500 rΠmin 离心 10 min 收
集农杆菌 ,用 WCC1 液体共培养基 (1Π10 MS附加 410
mmolΠL 乙磺酸、200μmolΠL 乙酰丁香酮、1 %葡萄糖、
4 %麦芽糖、015 mgΠL 2 ,42D、212 mgΠL 42氨基23 ,5 ,62
三氯吡啶甲酸、0175 gΠL MgCl2 、100 mgΠL CH ,pH 511
～512)重悬农杆菌 ,使最后的 OD 值达到 017 左右。
将预培养 4 d 的小麦幼胚愈伤组织放入农杆菌液中 ,
21～22 ℃下感染 30 min ,然后转移到 WCC1 固体共培
养基上 ,黑暗条件下共培养 2～3 d(24～25 ℃) 。
114 　愈伤组织诱导和植株再生
共培养后将愈伤组织转移到 MM 附加 210 mgΠ
L Bialaphos ,50 mgΠL 塞孢霉素 ,50 mgΠL 万古霉素 ,
50 mgΠL ticarcillin 的筛选培养基上诱导胚性愈伤组
织。2～3 周将胚性愈伤组织分割转移到 MS 附加
510 mgΠL Bialaphos ,50 mgΠL 塞孢霉素 ,50 mgΠL 万
古霉素 ,50 mgΠL ticarcillin 的培养基上分化成苗。
485 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

115 　转基因植株检测
分蘖拔节期用棉球蘸 75μmolΠL 的 Liberty 除
草剂 ,涂抹在幼嫩叶片的中下部 ,用记号笔标记 ,2～
3 d 后观察。
孕穗期提取基因组 DNA ,分别对目的基因或标
记基因进行 PCR、Southern 和 Northern 检测。GCE
基因 PCR 引 物 chi25 为 5′2ATGAAGAAGAATAG2
GATGATG 23′, chi23 为 5′2TGAA TTTCCAAA TG2
GA GTCT23′; bar 基因 PCR 引物 bar25 为 5′2AA G2
CACGGTCAACTTCCGTA23′, bar23 为 5′2
GAA GTCCA GCTGCCA GAAAC 23′。
116 　转基因植株赤霉病抗性鉴定
开花期用微注射管向穗子中部小花注射赤霉病
菌混和孢子液 (含 F4、F15、F17、F34 四种高致病菌
株) ,10μLΠ小花、1 朵Π穗、3 穗Π单株 ,浓度 5 000 个
孢子ΠmL ,自接种后适时弥雾保湿 ,21 d 后调查发病
小穗数 ,计算发病小穗率。
2 　结果与分析
211 　T0 代转基因植株获得和检测
　　2001 年 5 月利用含 pCAMB IA3301 GCE 质粒
的 C58c1 农杆菌菌系感染扬麦 10 号幼胚 650 枚 ,获
得 26 株抗性再生植株 ,感染 Bobwhite 幼胚 400 枚 ,
获得 20 株抗性再生植株。经叶片涂抹除草剂检测
和 PCR 检测 ,来源于扬麦 10 号的阳性植株有 9 株
(图 2) ,来源于Bobwhite 的阳性植株有 4 株 ,转化效
率分别为 114 %和 110 %。转基因植株对 75μmolΠL
的 Liberty 具有 100 %的抗性 ,叶片没有枯死现象 ;
而野生型对照和假阳性植株对除草剂不具有抗性 ,
被涂抹叶片全部枯萎或涂抹除草剂部位枯死 (图
3) 。PCR 检测结果表明 ,转基因植株和阳性对照均
能扩增出几丁质酶基因片段 (900 bp ,图 4)和 bar 基
因片段 (425 bp) ,而野生型对照和假阳性植株均不
能扩增出目的基因和标记基因片段。
图 2 T0 转基因植株
Fig12 T0 transgenic plants
图 3 叶片涂抹除草剂检测
Fig13 Leaf painting test
注 :箭头所示为假阳性和阴性对照。
Note :non2t ransgenic and negative control pointed by arrow.
图 4 PCR检测
Fig14 PCR test
M :marker ;1 - 4 :transgenic plants ;N :negative check ; P :positive check
212 　T1 代转基因植株检测和遗传分析
用 GCE 基因片段做探针 ,对 T1 代转基因植株
DNA ( B am H Ⅰ酶切 16 h) 和 RNA 分别进行了
Southern 杂交分析和 Northern 杂交分析。Southern
检测表明 ,转基因植株和阳性对照均有明显杂交信
号 ,多数植株为 1～2 拷贝整合 ,约占 90 %左右 ,少
数植株为 3 拷贝整合 ,约占 10 %左右 ,杂交片段大小
为 4～18 kb ,野生型对照和假阳性植株没有杂交信
号 (图 5) 。Northern 检测表明 ,转基因植株中的
GCE 基因已经由 DNA 转录为 RNA ,且转录强度很
高 ,野生型植株中没有目的基因的转录表达 (图 6) 。
图 5 T1 代植株 Southern blot 检测
Fig15 Southern analysis of T1 plants
M :marker ;1 - 11 :transgenic plants ; N :negative CK; P :positive CK
图 6 T1 代植株 Northern blot 检测
Fig16 Northern analysis of T1 plants
1 - 13 :transgenic plants ;N :negative CK
585　第 5 期 叶兴国等 :转几丁质酶和β21 ,32葡聚糖酶双价基因小麦的获得和鉴定 　　　

对 T1 代转基因植株进行了几丁质酶基因的
PCR 检测 ,共检测了 90 株 ,其中的 63 株呈现阳性 ,
27 株呈现阴性 ,分离比例为 2133∶1 (表 1) 。
表 1 T1 代转基因植株中 GCE 基因 PCR检测
Table 1 Genetic analysis of GCE gene in the T1 generation tested by PCR
株系
Line
检测植株数
No1 of plants
tested
阳性植株数
No1 of positive
plants
阴性植株数
No1 of negative
plants
分离比例
Segregation
ratio
942121 30 20 10 2100∶1
942122 27 19 8 2138∶1
942222 33 24 9 2167∶1
合计 Total 90 63 27 2133∶1
213 　转基因小麦植株赤霉病抗性鉴定
2003 年 4 月在江苏省农科院网室中 ,对 T1 代
转基因植株接种赤霉病菌 ,进行了抗性鉴定 ,其中以
苏麦 3 号为抗病对照 ,安农 8455 为感病对照。结果
表明 , GCE26、GCE211、GCE213、GCE216、GCE221 等
5 个株系对赤霉病表现出较强抗性 ,小穗发病率
4176 %～11176 % ,显著低于感病对照的 3811 % ,明
显低于抗病对照的 16156 %(表 2) 。
表 2 部分 T1 代转基因植株赤霉病抗性鉴定结果
Table 2 Resistance test to scab of some T1 transgenic plants
材料
Material
病小穗
Floret infected
总小穗
Total floret
tested
发病率
Infection frequency
( %)
苏麦 3 号 Sumai 3 186 1 123 16156
安农 8455 An’nong8455 432 1 134 3811
GCE21 14 43 32156
GCE22 12 21 57114
GCE23 19 60 31167
GCE25 4 19 21105
GCE26 2 19 10153
GCE29 18 57 31158
GCE210 6 22 27127
GCE211 1 21 4176
GCE212 2 17 11176
GCE213 3 29 7169
GCE214 9 21 42186
GCE216 1 18 5156
GCE218 15 42 35171
GCE220 15 36 41167
GCE221 2 17 11176
GCE222 22 80 27150
3 　讨论
本研究利用农杆菌介导法将 GCE 基因分别转
入了优良小麦基因型扬麦 10 号和模式小麦基因型
Bobwhite ,不但拓宽了农杆菌转化小麦受体基因型
的范围 ,而且有利于转 GCE 基因小麦的育种利用。
转基因 T1 代中阳性植株与阴性植株的分离比例为
2133∶1 ,低于孟德尔显性单基因 3∶1 的分离规律 ,这
可能与外源基因容易丢失有关。
抗病性鉴定结果表明 ,转 GCE 基因小麦植株
对小麦真菌性病害之一的赤霉病表现了一定抗性 ,
这与 GCE 基因转入其他植物或作物中的功能一
致[ 4～9 ] 。笔者将继续对转基因植株进行赤霉病抗性
鉴定 ,筛选纯合稳定株系 ,并鉴定转基因植株对锈
病、白粉病等小麦真菌性病害的抗性。同时 ,利用转
基因植株与其他小麦优良品种杂交 ,将转基因材料
纳入小麦常规育种程序。由于外源基因抗病程度的
局限和病原菌生理小种的变异 ,导入单一外源基因
的抗性材料往往不是非常理想 ,其抗病性容易丧失。
通过重复转基因手段或杂交育种手段 ,将 2 个以上
外源抗病基因转入或聚合到同一个基因型中 ,如将
GCE 基因与 R I P 基因或 IA P 基因聚合 ,可能培育
抗病性更强的小麦材料。
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