全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第3期，2005年6月 365
关于茚三酮法测定脯氨酸含量中脯氨酸与茚三酮反应之探讨
李绍军 龚月桦 王俊儒 梁宗锁*
西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌712100
收稿 2004-11-12 修定 　 2005-01-27
资助　 国家自然科学基金(90302005)。
*通讯作者(E-mail: liangzs819@163.net , Tel: 029-87092373)。
测定脯氨酸含量的方法通常用磺基水杨酸或
酒精提取再与酸性茚三酮反应生成稳定的红色产
物，然后于波长 520 nm 处比色，通过标准曲线
或回归方程计算脯氨酸的含量。关于其测定原
理，一些植物生理学实验指导明确指出：“在酸
性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色
产物，用比色法于520 nm波长下测定脯氨酸的含
量。”[1,2]然而，在各种生物化学教科书[3~6]中描述
氨基酸茚三酮反应时，则为：“在弱酸性条件
下，2个亚氨基酸——脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮
反应并不释放 NH3，而直接生成黄色化合物，其
结构式如图 1，最大光吸收在 440 nm。”为了对
两种教材中不同的说法进行比较，我们查阅了各
种文献，设计一些试验并进行了验证。
1 两种说法的来源
关于黄色产物及其最大光吸收在440 nm的描
述广泛存在于国内生物化学教科书[3~6]和少数植物
生理学实验指导[7]中，生化教科书一般没有指出
该反应的具体反应体系，文献7在“实验55”中
同意生化教科书的说法并有详细步骤，根据其中
的参考文献我们发现其主要来源于 Hyman[8]的文
献。文献 8 指出其反应体系由 NaCN、醋酸缓冲
液、水合茚三酮组成，脯氨酸或羟脯氨酸与之反
应后的产物是黄色的，最大吸收峰在440 nm。文
献 7 来源是 8，反应体系更改成为 KCN、柠檬酸
缓冲液、水合茚三酮、脯氨酸。在文献7 第3 版[1]
中则取消了这个试验。
关于红色产物及其最大光吸收在520 nm 的描
教学园地 Teaching
图1 黄色产物
述主要在植物生理学逆境指标测定脯氨酸含量实验
中[1,2,9~12]。这些文献认为脯氨酸与酸性茚三酮反应
生成红色物质，有互变异构体I和II(图2)。产物
在酸性条件下最大吸收峰520 nm，碱性条件下最
大吸收峰630 nm[10]。反应体系是醋酸缓冲液、水
合茚三酮、脯氨酸。
通过资料对比我们提出以下几个问题：(1)有
无氰化物对反应产生何种结果？(2)酸性体系以柠
檬酸为好还是醋酸为好？(3)产物在水相好还是甲
苯相中更好？我们设计了相应试验并进行了验证。
2 验证试验
实验中用到的试剂有：10 mg·mL-1 标准脯氨
酸溶液、酸性茚三酮溶液(2.5 g茚三酮，加入60
mL 冰醋酸和40 mL 2 mol·L-1 磷酸，于70℃下加
热溶解，冷却后贮于棕色试剂瓶中备用)、分析
纯冰醋酸、0.2 mol·L-1 pH 5.0 的柠檬酸溶液、
KCN。用各自不加脯氨酸的体系溶液调零，以龙
尼柯(上海)仪器有限公司WFJ 7200型可见光分光
光度计测定可见光区域实验产物的吸收曲线。
图2 红色产物互变异构体I和II
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2.1 氰化物对反应的影响 我们设定反应体系为：
2 mL 标准脯氨酸溶液、2 mL 酸性茚三酮、2 mL
冰醋酸，一支试管加入 0.005 g KCN，另一试管
不加KCN，均于水浴中加热 20 min。结合文献资
料与实验结果(图 3)发现，脯氨酸与茚三酮共热，
有 KCN 时产物为黄色，可见光区域最大吸收峰在
420 nm 处，说明结构可能为图 1；无 KCN 时产
物为红色，最大吸收峰为 520 nm，显示结构可
能为图 2。从化学反应机制来说，由于存在氰化
物与不存在氰化物两种情况下生成的产物及其颜色
不同，说明两者很可能是不同的反应。
图 4 中，反应体系为：2 mL 标准脯氨酸溶
液、2 mL 酸性茚三酮、0.005 g KCN，一支试
管加入2 mL冰醋酸(pH 1.0)，另一试管补充2 mL
蒸馏水(1 mol·L-1 NaOH调pH至7.0)，均于水浴中
加热 20 mi n。结果显示：有 KCN、无醋酸时，
反应产物呈黄色，产物吸收峰并不是440 nm，而
是 430 nm；有 KCN 和醋酸时，反应产物呈橙黄
色，吸收峰是 420 nm。可见酸性强弱移动了吸
收峰，显示其产物在不同 pH 下的结构是可变的。
K C N 是剧毒物质，为了安全、快速、准确
测定起见，我们认为应采用无 KCN 的脯氨酸与酸
性茚三酮共热的体系更加合理。因此，以下实验
都采用无 K C N 的体系。
2.2 不同酸性支持体系对脯氨酸与酸性茚三酮反
应的影响 在脯氨酸含量测定中，测定系统有用
柠檬酸的[7]，更多是用醋酸[2,8~10]。我们分别用柠
檬酸和醋酸进行了实验。图 5 中反应体系为：
2 mL 标准脯氨酸溶液、2 mL 水合茚三酮、2 mL
柠檬酸溶液。3 支试管分别作未加热、水浴加热
8 min和水浴中加热20 min实验。结果(图5)显示：
在未加热时，溶液颜色未发生变化，说明脯氨酸
与茚三酮可能没有进行反应；在柠檬酸系统中，
沸水浴中加热 8 min 后，有淡红色产物生成，且
在波长为520 nm处有最大吸收值；当继续加热到
20 min时，出现了红色沉淀，将该红色沉淀过滤
后测得的吸光值明显下降，但吸收峰仍为520 nm。
图3 KCN对脯氨酸测定吸收曲线的影响
图4 在KCN存在时醋酸对脯氨酸测定中吸收曲线的影响
图5 加热时间对测定脯氨酸柠檬酸体系吸收曲线的影响
用冰醋酸取代柠檬酸，体积不变，用1 mol·
L-1 HCl和1 mol ·L-1 NaOH调pH至1.5，加柠檬酸
的试管置于水浴中8 min，加冰醋酸的试管在水浴
中为20 min。结果(图 6)显示：用柠檬酸时其特
征吸收峰值较低；用醋酸时同样浓度的脯氨酸和
茚三酮反应，加热8 min后开始显现红色，20 min
后溶液颜色深度稳定，产物特征吸收峰更明显。
图 5、图 6 的结果表明醋酸优于柠檬酸，以下实
验均采用冰醋酸、脯氨酸、茚三酮反应体系。
2.3 水相与甲苯相对脯氨酸测定的影响 产物可溶
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于水相与甲苯相，何种溶液相测定产物浓度最
好？图 7 中反应体系为：2 mL 标准脯氨酸溶液、
2 mL酸性茚三酮、2 mL冰醋酸，分别用1 mol·L-1
NaOH调 pH 1.0和 3.0，于水浴中共热20 min。图
8反应体系与图7相同，冷却后用甲苯萃取产物。
结果表明，在可见光区域，不同 pH 值条件下生
成的产物特征吸收峰不管溶于水相还是甲苯相都是
520 nm，产物是红色。水相中 pH 的变化会极大
影响产物特征吸收峰的吸收值(图7)，而甲苯中pH
的变化对吸收值几乎没有影响(图 8)。
3 结束语
3.1 两种反应的实质 具a-氨基基团的氨基酸与酸
性茚三酮反应为：氨基酸首先被氧化成醛、NH 3
和 CO 2，而茚三酮被还原；接着反应生成的氨和
茚三酮还原产物再与另一分子水合茚三酮缩合生成
紫色物质[13]。
而脯氨酸与酸性茚三酮反应(不管是柠檬酸还
图6 柠檬酸与醋酸对测定脯氨酸吸收曲线的影响
是醋酸作为酸性体系)，加热反应后的最终产物是
红色的。在这个反应中，脯氨酸应是缩合了两分
子茚三酮，产物呈红色，最大吸收波长是520 nm
附近，不是 440 nm。脯氨酸与酸性茚三酮直接
加热反应结果可能如下：
在有氰化物参与时发生的是另一反应，产物
是黄色的，仅缩合一分子茚三酮。反应结果可能
如 下 ：
图8 不同pH下甲苯相中产物的吸收曲线
图7 不同pH下水相中产物的吸收曲线
如果要对脯氨酸与酸性茚三酮反应做出详
细、完整的反应历程说明，还需对产物结构作鉴
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定，对反应机制也应进一步研究。
3.2 生化教材修改建议 结合文献资料和我们的试
验，我们认为，不少生化教科书描述脯氨酸与酸
性茚三酮反应[3~6]值得商榷。首先，茚三酮反应
是特指有a-氨基基团的氨基酸与酸性茚三酮生成
紫色产物的反应，产物进行比色测定时波长为
570 nm[7]; 而脯氨酸和羟脯氨酸是亚氨基酸，没有
独立的a-氨基，所以并不如平常所说的是简单的
茚三酮反应。尽管如此，脯氨酸仍然能够与酸性
茚三酮发生化学反应，但不属于普通意义上的氨
基酸茚三酮反应。据此，我们认为生化教材在描
述脯氨酸与酸性茚三酮反应时应作适当修改: (1)脯
氨酸是亚氨基酸，没有具a-氨基的氨基酸酸性茚
三酮反应；(2)脯氨酸可以与茚三酮反应，在酸性
条件下生成的直接产物是红色的，最大吸收峰值
是520 nm；(3)脯氨酸与茚三酮在有氰化物存在时
反应产物是黄色或橙黄色，最大吸收值是
420~430 nm(准确的峰值需进一步提纯产物测定)。
3.3 最佳测定条件 尽管脯氨酸和茚三酮反应的机
制仍有待研究，但根据实验结果我们认为，如果
从高效、安全的角度考虑宜采取如下方法：用醋
酸作为酸性条件，茚三酮与脯氨酸水浴共热 2 0
min 以上，反应产物用甲苯萃取，建立标准曲线
或回归方程计算含量。具体方法可参见文献 1 、
2、9。
参考文献
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