全 文 ：第 21 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　7 月
Vol.21　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2001
杀配子染色体特异 RAPD标记及山羊草属
与普通小麦间分子多态性的研究
郭长虹　石锐　王同昌　李集临
(哈尔滨师范大学生物系 哈尔滨 150080)
摘　要　以普通小麦“中国春” 、三个“中国春”具杀配子染色体的二体异附加系及作为三个杀配子
基因种源的三种山羊草为材料 ,用 46个 10 nt随机引物对基因组 DNA 进行扩增 ,以筛选杀配子
染色体特有的 RAPD标记 ,并检测普通小麦与三种山羊草之间的 RAPD多态性 。结果表明:46个
引物中有 35个扩增出比较稳定的 RAPD产物 。其中引物 OPF-14和OPQ-09分别在普通小麦“中
国春”-山羊草附加系间扩增出多态性产物;因而认定 OPF -141300与 OPQ -09800 、OPF -141160与
OPQ-09770 、OPF-141280分别为三个杀配子染色体 3C 、Gcl和 2C的特异性 RAPD标记 ,可以用于
快速跟踪鉴定 3C 、Gcl 、2C杀配子染色体。对三种山羊草与普通小麦“中国春”进行了基因组 DNA
多态性分析 ,结果表明 ,35个引物在“中国春”中共扩增出 162个产物 ,在离果山羊草 、拟斯卑尔脱
山羊草 、柱穗山羊草中分别扩增出 140 、154和 155个产物;三种山羊草与“中国春”之间的共有扩
增产物分别为 69 、87 、96个 ,占总扩增产物的 29.61%、37.70%和 43.44% 。上述结果 ,从分子水
平揭示了山羊草属与普通小麦之间存在着较近的亲缘关系 。
关键词　杀配子染色体;小麦;山羊草属;RAPD标记;分子多态性
STUDIES ON RAPD MARKERS SPECIFIC TO GAMETOCIDAL
CHROMOSOMESAND MOLECULE POLYMORPHISM BETWEEN
TRITICUMAESTI VUM AND AEGILOPS SPECIES
GUO Chang-hong 　SHi Rui　WANG Tong-chang　LI Ji-lin
(Department of Biology ,Harbin No rmal University ,Harbin 150080)
Abstract　In order to screen specific RAPD markers of the gametocidal chromosomes and to investi-
gate the DNA molecular polymorphism , 46 random primers were used in PAPD analy sis of common
wheat variety “Chinese Spring” -gametocidal chromosome additional lines and three Aegilops species
as the donors of the gametocidal chromasomes.Products amplified w ith 35 of 46 primers w ere ob-
served , and the specif ic RAPD markers of the three gametocidal chromosomes were determined ,
namely OPF-141300 and OPQ -09800 fo r chromosome 3C , OPF-141160 and OPQ -09770 for GCL
and OPF -141280 for 2C.In addition , 162 , 140 , 154 and 155 products amplified wi th 35 primers
from common wheat “Chinese Spring” , Aegilops triuncialis , A.Speltoides and A.cylindrica , re-
spect ively , and 69 , 87 and 96 products are common to “Chinese Spring” and three Aegi lops species ,
respectively.It w as show n that close relationship in molecule level between common wheat and
第一作者简介:郭长虹:(1971-),女 ,博士 ,副教授 ,从事细胞分子遗传学。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870417)
收稿日期:2001-2-16
Aegi lops is revealed.
Key words　gametocidal chromosome;wheat;Aegi lops;RAPD marker;molelular polymorphism
　　杀配子染色体(Gametocidal chromosomes)能够
引起小麦染色体断裂并产生染色体缺失 、易位等畸
变 ,它可以导致不含杀配子基因的配子发生染色体
畸变而致死或半致死 ,以保证自身的优先传递 。这
种染色体大多来自山羊草属[ 1] 。杀配子染色体的
作用强度受普通小麦基因型的影响 ,在某些普通小
麦品种中 ,杀配子染色体所诱导的染色体畸变不足
以杀死配子 , 这种畸变可以遗传给后代[ 2] 。近年
来 ,人们利用山羊草属的杀配子染色体在小麦遗传
育种研究中开展了大量的工作[ 3 ,4] 。
RAPD技术自问世以来 ,由于它操作简便和较
低的费用而被广泛应用在遗传制图[ 5] 、遗传多样性
分析[ 6] 、品种鉴定[ 7]和跟踪鉴定外源染色体[ 8]等方
面的研究中[ 13 ,14] 。由于 RAPD 反应所扩增出的
DNA片段多为重复顺序 ,而不同染色体和不同染色
体组之间 DNA的差异可以由这些重复序列反映出
来 ,因此 , RAPD技术在鉴定和标记外源染色体及研
究近缘种属间的遗传关系上发挥着重要作用 。本文
对三个“中国春”小麦具不同杀配子染色体的二体异
附加系 、作为三个杀配子染色体种源的三种山羊草
及“中国春”小麦进行了 RAPD分析 ,试图筛选出杀
配子染色体的特异 RAPD标记 ,并分析三种山羊草
与普通小麦基因组之间的 DNA顺序的多态性。
图 A　OPQ-09扩增结果 1、分子量标准(Gene Ruler TM100bpDNA Ladder Plus), 上数第 7 条带为 800bp 2、中国春 3、拟
斯卑尔脱山羊草 4、DAGcl 5、离果山羊草 6、DA3C 7 、柱穗山羊草 8 DA2C
Fig.A　RAPD profile of OPQ-09 Primered amplification 1.molecular weight marker(Gene RulerTM100bp DNA Ladder Plus
)2 .CS 3.A.speltoides 4.DAGcl 5.A.triuncialis 6.DA3C 7.A.cylindrica 8.DA2C
图 B　OPF-14扩增结果 1.分子量标准(Gene Ruler TM 100bp DNA Ladder Plus), 上数第四条带为 1kb 2.DAGcl 3.拟
斯卑尔脱山羊草 4.DA3C 5.离果山羊草 6.DA2C 7.柱穗山羊草 8.中国春
Fig.B　RAPD Profile of OPF-14 Primered amplification 1.molecular w eight marker(Gene Ruler TM 100bp DNA Ladder
Plus)2.DAGcl 3.A Speltoides 4.DA3C 5.A.triuncialis 6.DA2C 7.A.Cy lindrica 8.CS
1.材料与方法
1.1 实验材料 实验所用材料有普通小麦“中国春” 、
离果山羊草(Aegilops triuncialis 2n=28 , UUCC)、
拟斯卑尔脱山羊草(A.Speltoides , 2n=14 , SS)、柱
穗山羊草(A.cylindrica , 2n=28 , CCDD)、分别来
自这三种山羊草的三条带有杀配子基因的染色体的
“中国春”二体异附加系:CS-DA3C(简写为 DA3C ,
来自离果山羊草)、CS-DAGcl(简写为 DAGcl ,来自
拟斯卑尔脱山羊草)、CS -DA2C(简写为 DA2C ,来
自柱穗山羊草)。供试材料普通小麦“中国春” 、离果
山羊草 、DA3C 、DAGcl由日本京都大学 Tsunewaki
教授提供;DA2C 由日本京都大学 Endo 教授提供;
拟斯卑尔脱山羊草 ,柱穗山羊草从中国农科院品种
资源研究所引入。
1.2小麦 DNA 提取:采用本实验室改进的微量提
取法 。称 100 mg 小麦叶片 ,加入 500 ml提取缓冲
液于 Eppendorf管中研成匀浆 ,冰上静置 30分钟;
10000 rpm 离心 5 分钟 ,取上清液加等体积酚 , 混
匀 ,11000 rpm 离心 5分钟 ,用等体积的酚/氯仿/异
戊醇抽提;11000 rpm 离心 5 分钟 , 取上清 , 加入
4333 期　　　　　郭长虹等:杀配子染色体特异 RAPD标记及山羊草属与普通小麦间分子多态性的研究
1/10体积的醋酸钠(pH 5.2)、2 倍体积无水乙醇 ,
-20℃沉淀 30分钟 , 11000 rpm 离心 5 分钟;70%
乙醇洗 , 真空干燥。加 50μl TE 缓冲液 , 加入
1ulRNA 酶(10 ug/ml)37℃消化 30分钟;再经酚/氯
仿/异戊醇抽提 、沉淀 、70%乙醇洗;干燥后 ,溶于 50
μl TE缓冲液中 。
1.3　RAPD分析:所用引物均为 Operon 公司生产
OPF-14引物核苷酸序列为 TGCTGCAGGT , OPQ-
09引物核酸序列为 CCCCCTATCA ,反应体积为 20
μl ,其中包括 10 mM Tris-HCl(pH 8.3)、50 mM
KCl 、1.5 mM MgCl2 、dN TP 、15 ng 引物 、30 ng 模板
DNA 、μU Taq酶 ,反应在 PTC -100 热循环仪上进
行。每个循环反应 95℃ 15 秒 、37℃45秒 、72℃ 1
分钟 , 45个循环 , 72℃延伸 5分钟。扩增产物在 1.
5%的琼脂糖凝胶上电泳 , EB 染色 ,紫外观察并照
相。以 Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus标准
分子量做对照 ,用 Kodak Digotal Science ID Ver 2.0
分析软件估计每个产物的相对分子量。
1.4　染色体特异性标记的识别:染色体特异性标记
是指那些可变的 、具有染色体特异性的 RAPD扩增
产物。如果某产物在山羊草中被扩增出来 ,同时它
又在对应的“中国春”具杀配子染色体二体异附加系
中被扩增出来 ,但在“中国春”中却不存在 ,则将该扩
增产物视为该条杀配子染色体的特异 RAPD标记。
2　结果与分析
2.1　山羊草属杀配子染色特异 RAPD标记
在所用的 46 个随机引物中 ,经多次重复 ,有 2
个引物可以扩增出特异产物 ,此特异产物稳定地出
现在“中国春” ———杀配子染色体二体附加系 、易位
系中 ,而在“中国春”中不出现(图 B)。引物 OPQ -
09在 DA3C 和 GC1GC1中分别扩增出 800 bp 、770
bp产物 ,这两个产物也分别出现于离果山羊草和拟
斯卑尔脱山羊草中 ,说明 OPQ -09800 、OPQ -09770
是杀配子染色体 3C 和 GCl的特异 RAPD标记 ,可
用于检测杀配子染色体 2C和 GC1GC1。引物 OPF
-14 在 DA3C 、DAGcl 和 DA2C 中分别扩增出
1300bp 、1160bp和 1280bp的 RAPD产物 ,并且这三
个产物也分别从离果山羊草 、拟斯卑尔脱山羊草和
柱穗山羊草中被扩增出来 ,可以认定 ,OPF-141300 、
OPF-141160 、OPF -141280分别为杀配子染色体 3C 、
GCl、2C 的特异 RAPD 标记 ,并可用于检测杀配子
染色体 3C 、GCl和 2C 。
2.2　普通小麦“中国春”与山羊草基因组间的分子
多态性分析
46个随机引物中有 35个引物可以扩增出稳定
的 RAPD产物 ,其余 11个引物未能扩增到或仅扩
增出微量的 RAPD 产物 。35 个随机引物在“中国
春”与三种山羊草之间分别扩增出的产物数及共有
的扩增产物数列于表 1。实验结果表明 ,不同引物
的扩增产物数为 2 ～ 10个 ,扩增产物的分子量为 0.
2 ～ 3.5 kb。35个引物在“中国春”中共扩增出 162
个产物;在离果山羊草 、拟斯卑尔脱山羊草和柱穗山
羊草中分别扩增出 140 、154和 155个产物 ,三种山
羊草与“中国春”之间的扩增产物总数分别为 233 、
229和 221 ,相同的产物数分别为 69 、87和 96个 ,占
扩增产物总数的 29.61%、37.70%和 43.44%;三种
山羊草与“中国春”之间的不同 RAPD产物分别为
164 、142和 125个 ,占扩增产物总数的 71.39%、62.
30%和 56.56%。这代表着三种山羊草与普通小麦
“中国春”之间存在着种间基因组 DNA 的分子相似
性 ,从分子水平上揭示出这三种山羊草属染色体组
(UUCC 、SS 、CCDD)与小麦 AABBDD染色体组之间
存在着较高水平的 DNA 顺序的相似性。另外 ,不
同引物所揭示的多态性程度也不同 ,有的高达 90%
以上(如 F14),有的则完全没有揭示出多态性(如
A09)。
3　讨论
3.1　山羊草属杀配子染色体的 RAPD标记及其应
用
杀配子染色体自 1975年被发现[ 9]以来 ,在小麦
的遗传和育种方面均得到了广泛的应用 ,尤其在小
麦缺失制图[ 3]方面显示了它独特的价值 。近年来 ,
利用杀配子染色体产生的小麦缺失体系与分子标记
综合利用 ,不仅有助于构建饱合度高的遗传图谱 ,而
且还可以将遗传图与染色体图相互比较 ,使遗传距
离转化为特定染色体区域内的物理距离成为可能 ,
有助于基因的克隆操作 。同时 ,杀配子染色体还可
应用于小麦与近缘野生种属间染色体易位系的创
制。据报道 ,利用来自离果山羊草的杀配子染色体
3C诱导黑麦 1R染色体与小麦染色体间的易位频
率可高达 8%左右[ 4] 。然而 ,迄今为止 ,人们对杀配
子染色体本身的研究还不够深入 ,在杀配子染色体
的跟踪检测方面也主要依赖于染色体的 C-分带技
术 ,限制了对它的应用。因此 ,进一步对它进行更加
深入的研究 ,尤其在分子水平揭示杀配子基因的本
质 ,是十分必要的。本文找到了 3个杀配子染色体
的特异 RAPD 标记 ,这些标记经回收克隆后 ,可在
Southern杂交或原位分子杂交中作为探针使用。在
当前直接用这些分子标记对杀配子染色体进行示
踪 ,对于加快育种应用中的筛选鉴定进程显然是非
434 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
常有利的 。杀配子染色体 GCL 是含有杀配子基因
的拟斯卑尔脱山羊草的染色体片段易位到“中国春”
小麦染色体2B 长臂上[ 1] 。本文找到的 2个GCL 染
色体的 RAPD标记应该在这段易位的拟斯卑尔脱
　　表 1供试引物及其在不同物种中的 RAPD产物数以及普通小麦“中国春”与三种山羊草属植物之间
产生的共有扩增产物数
　　Table 1　RAPD loci and products common to CS and three Aegilops species generated by 35 random
primers from CS and Aegilops
引物
primer
“中国春”
CS
离果山羊草
A.triuncialis
共有标记
common
拟斯卑尔脱山羊草
A.spoltoides
共有标记
common
柱穗山羊草
A.cy lindrica
共有标记
common
A01 3 2 2 2 2 2 2
A02 5 3 1 4 2 3 2
A03 4 4 4 4 4 4 4
A06 4 4 2 5 2 5 3
A08 3 4 1 8 2 4 2
A09 3 3 3 3 3 3 3
A13 4 3 1 2 1 3 2
A17 8 7 3 6 2 6 3
A19 6 5 5 6 6 6 6
B01 3 2 0 2 1 3 2
B03 4 5 2 4 3 3 2
B07 2 2 2 2 2 2 2
B08 5 3 1 5 3 4 3
B17 7 4 2 5 3 4 2
F01 5 4 2 5 3 4 2
F03 2 1 0 2 1 1 1
F05 5 3 1 3 2 4 2
F06 4 5 1 5 2 6 2
F07 6 7 1 5 2 7 3
F08 6 5 2 7 3 6 3
F09 5 3 2 4 2 5 2
F13 10 7 5 6 4 7 6
F14 6 5 1 6 1 9 3
G06 5 4 1 4 3 3 2
G08 4 3 1 2 1 3 2
G09 4 5 2 4 2 5 2
I06 4 2 0 2 1 2 2
I19 4 4 2 2 1 5 3
I20 6 4 1 7 4 5 3
Q05 4 3 2 4 2 3 2
Q09 6 8 5 10 4 9 4
Q10 3 3 1 4 2 5 3
Q14 3 4 2 5 2 4 2
Q15 6 6 5 6 6 7 6
Q18 3 3 3 3 3 3 3
总数 162 140 69 154 87 155 96
Total
山羊草染色体片段上并与杀配子基因连锁 ,但是否
就是杀配子基因的标记 ,还有待于进一步研究 。研
究中发现 , OPF-14即 F 14 , OPQ-09 即 Q-09几个杀
配子染色体的 RAPD 标记间存在着分子间的差异
和联系。如 OPF -141300 ,OPF -141280分别为 GCL
和 2C的标记 。二者之间片段大小非常相似 ,但 3C
的OPF -141160标记则与它们有一定的差异;OPQ
-09800与 OPQ-09770分别为 GCL 和 3C 的分子标
4353 期　　　　　郭长虹等:杀配子染色体特异 RAPD标记及山羊草属与普通小麦间分子多态性的研究
记 ,二者之间片段大小也非常相似 ,但 2C却没有此
标记 。这似乎说明几个杀配子染色体的 DNA 顺序
之间存在着同源性 ,这个性质反映了杀配子基因功
能上的相似性与结构上的相似性之间必然存在的关
系。
有必要说明的是 ,在反应条件与体系适宜的情
况下 , RAPD扩增产物的重复性和稳定性与选用的
随机引物有密切关系 。因此 ,进行 RAPD分析应重
视选取可以获得重复性和稳定性较好的扩增产物的
引物 ,并以其扩增结果的分析为确定研究结论的依
据。
3.2　山羊草与普通小麦基因组间的遗传差异
在小麦野生近缘种属中 ,山羊草属与小麦的亲
缘关系最近[ 10] 。在本研究中涉及的三个山羊草物
种与普通小麦“中国春”之间扩增出来的相同产物占
总产物的比例分别为 29.61%、37.70%和 43.44%,
远高于普通小麦与其它近缘野生种之间的 RAPD
分析值。刘树兵等研究表明长穗偃麦草与普通小麦
的相同扩增产物的比例仅为 19.44%[ 11] 。我们曾
做过黑麦与普通小麦的 RAPD产物比较 ,相同扩增
产物的比例仅为 15.11%(未发表)。这一结果进一
步从分子水平上证明了山羊草属与普通小麦有着较
近的亲缘关系。三个山羊草物种与普通小麦“中国
春”之间的相同 RAPD产物的比例不尽相同 ,离果
山羊草最低 ,拟斯卑尔脱山羊草次之 ,柱穗山羊草最
高 ,反映了它们与普通小麦间亲缘关系的差异 。原
因可能是柱穗山羊草(CCDD)有着与普通小麦相同
的D染色体组 ,拟斯卑尔脱山羊(SS)S 组染色体与
普通小麦的 B组染色体亲缘关系较近 ,而离果山羊
草(UUCC)的染色体组与 A 、B 、D 染色体组亲缘关
系较远 ,与前人用细胞遗传学方法的研究得到的结
果相吻合[ 12] 。三种山羊草与普通小麦之间多态性
扩增产物比例分别为 71.39%, 62.30%, 56.56%,
遗传上的差异是明显的。这说明尽管山羊草与普通
小麦间的亲缘关系很近 ,但在山羊草属与普通小麦
染色体组的分化及进化过程中遗传变异还是普遍存
在的 。
参　考　文　献
1.Endo , T.R.Gametocidal chromosomes and their induction
of chromosome mutations in wheat.1990.Jpn.J.Genet ,
65:135 ～ 152
2.Endo , T.R.Indution of chromosomal strue tural changes by
chromosomes of Aegilops cylindrica L.I n common w heat.
J.Hered , 1988 , 79:366 ～ 370
3.Gill , K.S.Gill , B.S.and Endo , T.R.I dentification and
highdensity mapping of gene-rich regions in chromosome
group 5 of w heat.Genetics.1996 , 143:1001 ～ 1012.
4.Endo , T.R.Structural changs of rye chromosome 1R in-
duced by a genetocidal chromosome , J.pn.J Genet , 1994 ,
69:13～ 19
5.Welsh J , McClelland M .Fingerpringting genomes using PCR
with arbitr ary primers .Nucleic Acids Res , 1990 , 18:6531
～ 6535
6.HE s , Ohm , Mackenzie S.Detection of DNA sepuence poly-
morphisms among whea t v arieties.Theo r Appl Genet.1992 ,
84:573 ～ 578
7.吴敏生 , 戴景瑞 , 王守才.RAPD 在玉米品种鉴定和纯度
分析中的应用.作物学报.1999 , 25(4):489～ 493
8.Peil , A.E.Schumann , V.Schwber t , et al .RAPDs as
mo lecular markers for the detection of Aegilops markgrafii
chromatin in addition and euploid introg ression lins of
hexaploid w heat.Theor , Appl.Genet .1997 , 94:934 ～
940
9.Endo , T.R.and Tsunewaki , K .Sterility of common
whea t with Aegilops triuncialis cytoplasm.J.Hered , 1975 ,
66:13～ 18
10.木原均.普通小麦系の一祖先 たる DD 分析种の发现.
生研时报.1947 , 3
11.刘树兵 , 贾继增 , 王洪刚等.长穗偃麦草(Agropyron e-
long tum , 2n=14)与普通小麦间的多态性及 E 组染色体
的特异 RAPD标记.作物学报 1998 , 24(6):687～ 690
12.童一中 , 褚祈编译.小麦细胞遗传学.北京:农业出版
社 , 1983
13.张恒庆 , 安利佳 , 祖元刚.红松 RAPD 实验中各组成成
分含量对实验结构的影响.植物研究 , 1999 , 19(2)183
～ 188
14.崔继哲 ,祖元刚 , 关晓铎.羊草种群遗传分化的 RAPD
分析 I:扩增片段频率的变化.植物研究 , 2001 , 21(2):
272～ 277
436 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷