全 文 ：第 32卷 第 2期
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.
2 3 No
.
2
植 物 研 究
B U L L E双 N O F B O T A N IC AL R卫 SE AR CH
20 3年 4月
A Pr i l
,
2X() 3
T D Z 诱导花生幼叶的不定芽和体细胞胚发生的组织学观察 ’
林荣双 王庆华 梁丽混 肖显华
(烟台大学生化系 , 烟台 2 64 0 5)
摘 要 花生实生苗幼叶接种 于 M S + DT Z 0 . Zm岁 L + N A A 0 . 4 m岁 L 诱导培养基上经诱导培
养 ,继而转移到无激素培养基 M S 可获得不定 芽和体细胞胚 。 组 织学观察表明 , 花生不 定芽和
体细胞胚均起源于愈伤组织表层 , 不定芽为多细胞起源 , 而体细胞胚起源于单个胚性原始细胞 。
体细胞胚的发育经历 多细胞原胚 、球形胚 、 心形胚 、 鱼雷胚和子叶胚等时期发育成小植株 。
关键词 花生 ;不定芽发生 ;体细胞胚发生 ;组织学研究
H I S T O L O G I C A L S T U D Y O N A D V E N T I T IO U S B U D F O RM A T I O N
A N D S O M A T I C E M B R Y O G E N E S I S O F P E A N U T
(A R A C H I S H YPO G A E A L
.
) L E A F L E T S
L IN R o n g 一 S h u a n g WA N G Qi n g 一 H u a L IA N G L i 一 K u n X IA O X i a n 一 H u a
( D
e P a rt m e n t of B io e h e m i s tyr
,
Yan t ia U in
v e sr i ty
,
Yan t苗 264 00 5 )
A bs tr a e t hT i
s p a p e r d e a l s w iht a h i s ot l o g i e a l o b s e vr a it o n o f a d v e n ti it o u s b u d fo mr
a it o n a n d s o m a t i e
e m b巧。罗 n e is s of 拌 an u t ( Aacr h is h” o g a e a L . ) l e眼e t s . Avd en it it ou s b u d s an d e m b口 o id s d e v e l叩 e d
for m 山e le afl e ts 。 f 4 一 d a y 一 ol d s e e d l i n g s o n M S b a s a l m e d i u m s u p p l e m e n te d w iht T D z 0
.
Zm岁 L a n d
N A A 0
.
4 m群L , a n d d e v e l o p e d i n ot lP a n il e tS a ft e r ht e y w e er atr n s fe er d o n ot M S m e d i u m w iht o u t a yn
p h y ot h o mr
o n e
.
H i s to l o g ie al o b s e vr a t io n s s h o w e d ht a t bo ht
a d v e n t i ti o u s b u d s a n d so m a t i e e m b砂0 5 d e -
v e l o p e d for m
t h e s u far
e e o f ht e e a l l u s
.
H o w e v e r
, a d v e n it ti o u s b u d s o ir g i n a te d for m
e e ll m a s s w h i l e 5 0
-
m a ti e e m b钾 0 5 o ir ig n a t e d for m o n e s in gl e e lbn 卿o g e n i e e e l l
.
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e so m a it e e m b珊 0 5 d e v e l o p e d d i er e t l y
i n t o p l a n d e rs w iht or
t s a n d b u d s ht or u gh m u lit e e l lu la r p or e m b耳。 , g l o b u l a r , h e a rt 一 s h a p e d , ot 甲 e d o
一 s h a P e d a n d e o yt le d o n s at g e s
K ey wo
r ds P e an u t ; a d v e n t i ti o u s b u d fo mr
a t io n ; s o m a ti c e m b叮 o g e n e s is ; h i s t o fo g i e a l s tu d y
花生是一种世界范围内广泛种植的豆科植
物 , 在我国北方诸省也是一种重要 的经济作物 。
花生易受多种病毒病 、 真菌病及虫害的侵染而造
成大幅减产 ,严重时可绝产 t ` 1 。 植物基因工程为
花生的种质改良 , 培育抗性品种提供了一条崭新
的途径 。 但由于花生的组织培养起步晚 ,难度大 ,
进展缓慢 , 因而严重限制了基因工程技术在花生
改良中的应用研究 。 近几年来 , 花生组培工作有
了较大的进展 。 国外不少学者通过器官发生和胚
胎发生途径获得再生植株 [ ’ 一 ’ 〕 ,但仍存在着分化
频率低 、体细胞胚畸形及外植体材料受季节限制
等问题 。
基金项目 : 山东省自然科学基金资助项目 ( 9Y 7 1D 6 07 5) 。
第一作者简介 :林荣双 ( 19 68 一 ) ,女 ,讲师 , 主要从事植物组织培养方面研究 。
收稿日期 二2X() 2 一 06 一 28
23卷
D z T属于杂环芳香脉 , 其化学名称为 N 一 苯基
N
’ 一 唾二哇 一 5 一 脉 (简化名 hT id auz or n , 中文译
作唾重氮苯基脉 ) , 最初是由 S c h e ir gn 等作为一
种棉花落叶剂使用而发展起来 。 1982 年 M ok 等
发现当培养基中加人低浓度的 T D z 时 , 明显促进
金甲豆 (hP as co lus lu an t us )愈伤组织的生长 ,具有
比玉米素 ( zT )更强的作用 。 此后在许多植物中
证实了 T D z 的高活性细胞激动素作用 e[] 。 国内
也已有关于苯基脉的细胞分裂素活性的研究工作
及报道 [,] , 花生组培及基因工程研究也少有报
道 ,但不定芽和体细胞胚诱导过程中多使用 2 , 4
一 D 、 zr 和 B A 等激素 t吕一 ’ 0] , 采用 T Dz 诱导花生
分化未见报道 。
本文利用 T DZ 诱导花生实生苗的幼叶 , 获得
高频不定芽和体细胞胚发生 ,并对其发生发育过
程中的组织细胞学特征进行了研究 ,为花生离体
分化的机理研究提供信息 。
材料和方法
1
.
1 花生幼叶的组织培养
实 验 品 种 为 鲁 花 九 号 花 生 ( A ar hc is
勺甲叩。 e a L . ) 。
花生种子灭菌方法参见肖显华等 ( 19 97 )[ 川 。
将灭菌的种子置暗处 25 土 3℃萌发 4 d 后 ,剥去子
叶 ,把胚上的幼叶切下来 ,接种于 M S 基本培养基
附加 T D z 0 . Z m岁 L 和 N A A 0 . 4 m岁 L 进行诱导
胚养 。 ZOd 后 ,转移到不加任何激素的 M S。培养
基上进行继代培养 。 1 月后把丛生芽分离 , 较大
的苗转人 M S + BI A 0 . 4 m岁 L + 2% 蔗糖 ,诱导生
根 。 培养条件为 1h6 光照 / h8 黑暗 ,光强 1 50 -
2 《XX) h ,温度 25 土 3℃ 。
1
.
2 石蜡切片制样
材料开始培养后 , 分期分批取样 。 用 FA A 固
定液固定 3 6h , 70 % 乙醇冲洗 , 常规石蜡切片 ,切
片厚度 7 一 8 卜m 。 埃氏苏木精染色 , 中性树胶封
固 。 o ly m p us B H 一 2 光学显微镜下观察 、 照相 。
2 结果与讨论
2
.
1 不定芽和体细胞胚的诱导和分化
花生幼叶接种于 M S 诱导培养基 , 叶片增厚 ,
叶色渐渐转绿 。 s d 后 , 叶面变形弯曲 , 切 口处膨
大 。 s d 左右 , 叶片切 口上在叶脉附近产生白色毛
状 、褐色疏松和浅黄色疏松和三种不同的愈伤组
织 ,其中前两种愈伤组织虽能增殖 ,但难以分化 ;
长有黄色疏松愈伤组织的叶片继续培养 7 一 s d
后 ,愈伤组织中有绿色致密突起出现 (图版 I : 1 ) 。
20 d 后 ,把幼叶转移到 M S。培养基 , 继续培养 2 0 d
左右 ,叶片切 口表面形成丛生芽 (图版 I : 2 ) 。 在
解剖镜下进行观察 , 可见这些芽绝大多数为不定
芽 ,与母体紧密相连 ,难以分离 ;少数为体细胞胚 ,
具有根芽两极 (图版 I : 5 ) , 并可进一步发育成小
植株 ( 图版 I : 3 ) 。 将丛生芽分离 , 转到含 BI A 的
培养基中即生根形成小植株 ( 图版 I : 4 ) 。
据报道 , 对某些植物 , T DZ 既能诱导胚状体 ,
也能产生不定芽的分化 0[] 。 本研究表明花生幼
叶在 0 . Z m以 L T DZ 和 N AA O , 4 m留 L 的诱导下 ,
既能产生不定芽 ,也能形成体细胞胚 ,但二者的发
生频率相差很大 , 不定芽的发生率几乎达 10 %
(详见另文发表 ) ,而体细胞胚的发生率很低 。 这
说明不定芽和体细胞胚发生对激素等的要求不
同 ,二者的发生机制也可能有所不同。 诱导花生
体细胞胚高频发生的条件仍需进一步探讨 。
2
.
2 不定芽和体细胞胚发生发育的组织细胞学
过程
组织学切片观察表明 , 花生的不定芽和体细
胞胚均发生于愈伤组织表层 , 为外起源方式 。 萌
发 4 d 的实生苗幼叶在诱导培养基作用下 ,首先脱
分化形成愈伤组织 , 愈伤组织表层的细胞 比内部
细胞更易接近诱导因子 , 因而优先分化 。 分化时
愈伤组织的表层细胞首先启动 ( 图版 I : 6 ) ,进行
垂周分裂 , 形成体积小 , 近似方形的细胞 ,细胞质
变浓 ,细胞核变大 ,呈圆形 ,位于细胞中央 , 核仁明
显 ,说明细胞处于代谢旺盛期 , 正进行这大量的
R N A 合成 ;接着细胞进行平周和垂周分裂 , 数目
增多 (图版 I : 8 ) ,形成突起 ( 图版 I : 7 , 9 ) , 后者进
一步发育形成不定芽 (图版 I : 1 0 ) 。 在切片中也
发现处于不同发育时期的体细胞胚 , 它们起源于
愈伤组织表层的单个胚性原始细胞 。 在愈伤组织
表层 , 可观察到胚状体原始细胞 ,体积小 , 细胞核
大 ,几乎占据整个细胞 ,核仁大而明显 , 细胞壁及
细胞核染色深 , 胞质浓厚 , 与周围细胞分界明显
(图版 I : 17 ) 。 胚性原始细胞分裂形成二细胞原
胚 (图版 I : 1 1 ) 。 在切片上还可发现三细胞原胚
(图版 I : 13 )和五细胞原胚 (图版 I : 1 4 ) 。 继续培
养可见多细胞原胚 (图版 I : 12 , 巧 )及突出于愈伤
组织表面的各个时期的体细胞胚 , 即球形胚 、 心形
胚和鱼雷胚 (图版 I : 18 , 19 , 16 ) 。 这种单细胞起
源的胚多具明显的胚柄 (图版 I : 12 , 15 , 18 , 19 ) ,
2期 林荣双等 : T D Z诱导花生幼叶的不定芽和体细胞胚发生的组织学观察 17 1
胚柄伸人母体组织中 , 为胚体发育提供营养 ;胚体
位于愈伤组织表面 ,与母体组织连结极为松散 ,很
易与周围愈伤组织分离脱落 (图版 I : 1 2 , 15 ) 。
本研究表明 , 在 TDZ 诱导下 , 花生不定芽和
体细胞胚的起源方式不同 。 不定芽起源于愈伤组
织表层 , 为多细胞起源 ;而体细胞胚为典型的单细
胞起源方式 ,起源 于单个胚性原始细胞 。 这一点
与 2 , 4 一 D 诱导的花生体细胞胚不同 〔” 」。 花生
幼叶在 2 , 4 一 D 的诱导下 ,不经过愈伤组织阶段 ,
由其表皮及表皮下的数层细胞分裂直接形成胚性
细胞团 , 进而发育成胚状体 ,为直接发生 、 多细胞
起源 。 本实验中 ,在 TDZ 和 N A A 的诱导作用下 ,
花生幼叶先形成愈伤组织 , 进而由愈伤组织中的
单个胚性原始细胞分裂发育形成各个时期的体细
胞胚 ,属间接发生 、单细胞起源 。 一种植物的体细
胞胚可经 2 种发生途径和 2 种起源方式形成 ,在
其它植物中也有报道仁” 一 ” 〕。 推测花生体细胞胚
的这种不同的发生途径和起源方式可能与 T DZ
和 2 , 4 一 D 的作用机理不同有关 。 2 , 4 一 D 诱导
的体细胞胚发生频率高 , 但大多畸形 , 不易成
苗仁’ Z;I DT z 诱导体细胞胚的频率较低 , 但发育正
常 ,可在 M S。培养基萌发直接形成小植株 。 利用
T D z 诱导花生高频体细胞胚发生的条件尚有待进
一步研究 。
参 考 文 献
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图 版 说 明
E x lP a n a it o n Of fl a et
图版 I : 1 . 叶片切口上长有绿色致密突起 ( x 4 ) ;2 . 叶片
切口表面形成丛生芽 ( x Z ) ; 3 . 由胚状体发育来的小植
株 ( x 3 ) ;4 . 由不定芽发育而来的小植株 ; 5 . 子叶胚 ( 、
4 ) ;6
. 愈伤组织的表层细胞启动 ( x 134 ) ; 7 , 9 . 愈伤组织
表面的突起 ( x 27 ) , ( x 67 ) ; 8 . 愈伤组织表面的多层细
胞启动 ( x 67 ) ; 10 . 不定芽 (箭头示叶 原基 ) ( x s ) ;
11
,
13
. 二细胞和三细胞原胚 ( x 670 ) ; 12 , 巧 . 带胚柄的
多细胞原胚 ( x 1 34 ) ; 14 . 五细胞原胚 ( x 13 4 ) ; 16 . 鱼雷
胚 (箭头所示 ) ( x 67 ) ; 17 . 愈伤组织表层的单个胚性原始
细胞 ( x 670 ) ; 18 . 球形胚 ( x 67 ) ; 19 . 心形胚 ( x 67 )
lP a et l
:
1
.
G二 e n p or tur s io n s on t ha e u t s u far e e of l e d e t ( x
4 )
: 2
.
M ul t i vle b
u
d
s o n the
c u t s u而 e e of le an e t ( x Z ) ;
3
.
eR 罗 n e ar t e d lP an ile t for m e mb 卿 id ( x 3 ) ; 4 . eR 罗 n e ar t e d
p lan ile t fr
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ad
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u d
.
; 5
.
C o ty led
o n s t a g e e m b口 o id
( x 4 ) ; 6
.
I n i t ia t io n of th e e p i de mr
a
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s of t h e e边 u s ( x
1 34 )
: 7
,
9
.
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s in it i
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n
g for m th
e e p id e mr al of t h
e
e扭 u s ( x 2 7 ) , ( x 6 7 ) ; 8 . eS ve alr l a ye sr of e e l ls i n it iat i n g
o n ht e s u fr a ce of tha
c习lu s ( x 67 ) ; 10 . Avd en it it ous bdu
(~
w i
n d i e at e s le af Pir m o dr i a ) ( x s ) ; 1 1
,
13
.
T w
o 一 e e l
a n d ther e 一 e e l p ,
m b巧 0 5 ( x 670 ) ; 14 . Fiv e 一 e e l poer m
-
b叮。 ( x 134 ) ; 12 , 15 , M d it e e l ul a r proe m b口 0 5 w i th s u s伴 n -
s o r
(
x
134 ) ; 1 6
.
T
O甲de o 一 s h a pe d e m b ry o ( a ~ )
.
(
x
6 7 ) ;
1 7
.
S i n gl e
e m b卿罗icn e e l o n hte e p ide 而 al lave r of e al lus
(
x 670 )
; 1 8
.
Gl
o bul ar e m b口。 ( x 67 ) ; 19 . H e a rt 一 s h a p记
e m b斗。 ( x 67 )
林荣双等 : T DZ诱导花生幼叶的不定芽和体细胞胚发生的组织学观察 图版 I
LI N R即 g一 S h u a n g e t解 : H io t o lo g ie al s r u d y o n a d v e n t i t i(, , 1 5 1、 、」 ( 1 61 rl : 、 t i` , r l :、 , 101 、 .、 , , ,。 , , ,、 。 , , ; }, ,了* ,罗 , , `、 、 i、 〔 , f `, 。 。 , .: , t〔 · I r `, 去巧 方,尹 0 9 ` , a
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