全 文 ：第24卷　第4期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004年　10月
Vol.24　No.4　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2004
基金项目:东北林业大学科研基金项目资助
第一作者简介:王军(1966—),男 ,研究员 ,主要从事山葡萄育种及葡萄酒酿造工作。
收稿日期:2004-02-20
RAPD标记在山葡萄种质鉴定中的应用
王　军1　葛玉香1　贺普超2
(1.东北林业大学, 哈尔滨　150040)
(2.西北农林科技大学, 杨凌　712100)
摘　要　采用修改后的CTAB法获得了高质量的基因组 DNA。利用 RAPD标记技术对山葡萄 7份种质
进行鉴定 ,用4个引物(从30个引物中筛选)对试材进行PCR扩增 ,共扩增出30条谱带 ,平均每条引物
产生 7.5条谱带 ,其中21条谱带为多态性谱带 ,占总谱带数的70%。不同引物扩增的谱带数不同 ,范围
在6～ 9条之间。利用4个引物扩增出的多态性谱带可以将7份山葡萄种质区分。
关键词　山葡萄;种质;鉴定;RAPD
Application of RAPD markers to identification of Vitis amurensis germplasm
WANG Jun
1　GE Yu-Xiang1　HE Pu-Chao2
(1.Northeast Forestry University , Harbin　150040)
(2.Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry , Yangling　712100)
Abstract　High quality genomic DNA was obtained by the method of modified CTAB.Seven germplasms Vitis a-
murensis were identified by RAPD , four primers screened from 30 primers could amplify clearly and stably 30
bands , average was 7.5 bands.There in 21 of 30 bands were examined for random amplified polymorphic DNA am-
plification patterns.They occupied 70%.Every primer could amplify different bands , the range of the number of
bands was from 6 to 9.The result indicated that polymorphic band amplified by the 4 primerswas effective in iden-
tification 7 germplasms of Vitis amurensis.
Key words　Vitis amurensis Rupr.;germplasm;identification;RAPD
山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)原产我国东北 、华
北及朝鲜 、前苏联远东地区 ,是葡萄属中最抗寒的一
个种 ,枝蔓可耐-40℃低温 ,根系可耐-16℃～ -14℃
低温。对白粉病 、白腐病 、炭疽病 、黑痘病有较强的抵
抗力 ,没有美洲种的“狐香味”。它是目前国内外葡萄
抗寒育种的主要种质资源 ,同时也是东北地区酿造葡
萄酒的主要原料。近年来 ,收集保存的山葡萄种质资
源已达 240余份 ,具有各种植物学和农艺性状的变异
类型。
随机扩增多态 DNA(Random amplified polymorphic
DNA ,RAPD)具有方法简单 ,不需内切酶 、DNA 探针及
分子杂交和放射自显影等复杂技术 ,耗费少 ,效率高
等优点 ,已成功地应用于葡萄种(品种)的鉴别 、连锁
分子标记的筛选 、葡萄属植物亲缘关系 、连锁遗传图
的构建等研究[ 1～ 5] 。本实验以不同花性 、不同来源的
山葡萄种质为试材 ,研究基因组 DNA的 RAPD ,为山
葡萄种质的鉴定及分子生物学研究奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
实验所用山葡萄种质见表1 ,采自中国农业科
表 1　供试山葡萄种质
Table 1　V.amurensis germplasm in the research
种质名称 Code or name 来源 Source 花性 Flower sex
73064 野生种质Wild 雌能花 Female flower
左山二 Zuoshan No.2 野生种质Wild 雌能花 Female flower
75023 野生种质Wild 雌能花 Female flower
双丰 Shuangfeng 通化 1号×双庆 Tonghua No.1×Shuangqing 两性花 Hermaphrodite
左山一 Zuoshan No.1 野生种质Wild 雌能花 Female flower
73093 野生种质Wild 雌能花 Female flower
1-2 野生种质Wild 雄能花 Male flower
学院特产研究所国家山葡萄种质资源圃。取休眠枝
条 ,解除休眠后水插 ,取幼叶提取基因组 DNA。试验
在北京市农林科学院林业果树研究所进行。
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA提取
CTAB 法[6～ 9] 。取300μL提取缓冲液(含100mmol
·L-1Tris-HCl(pH 8.0),1.4mol·L-1 NaCl ,20mmol·L-1
EDTA ,2%CTAB ,20mmol·L-1Na2S2O5 ,10mL·L-1β-巯
基乙醇(现用现加))于1.5mL的 Eppendorf管中 ,加入
约0.025 ～ 0.05 g去叶脉幼叶 ,研碎至无可见组织块。
混匀 ,60℃温育30 min。加入300μL氯仿—异戊醇(24:
1)混匀 ,13 000 r·min-1离心5 min ,转移上清于干净的
1.5 mL Eppendorf管中 ,加入2/3体积的预冷异丙醇混
匀 , -20℃下静置30min。13 000 r·min-1离心15 min ,
弃上清 ,以70%和预冷无水乙醇洗沉淀两次 ,通风橱
内干燥。将干燥 DNA沉淀溶于50μLTE′缓冲液(10
mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0), 0.1mmol·L-1EDTA(pH8.
0)),过夜。加入1μL RNase(10μg/mL ,Calbiochem.),
37℃恒温1 h ,电泳检查DNA含量。
1.2.2　PCR扩增及电泳检测
反应在 Idaho Technolog Inc.生产的Air Thermo-Cy-
cler1605毛细管 PCR仪上进行。实验采用10μL反应
体系 , 其 中 含 10mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.3),
50mmol·L-1 KCl ,2.5 mmol·L-1 MgCl2 , 0.01 mg/mL明
胶 , 0.2mmol·L-1 dNTPs , 5μg 牛 血 清 白 蛋 白 ,
1UTaqDNA 聚合酶(上海 Sangon), 2 ～ 5 ng模板
DNA ,7.5 ng10碱基随机引物(Operon 公司出品),
每引物重复 3 次。扩增程序:前两个循环 94℃变
性60 s ,37℃退火10 s ,72℃延伸40 s ,退火至延伸间
温度变化斜率为 5;随后 94℃ 5 s , 37℃10 s , 72℃
70 s ,温度变化斜率为 5 ,进行 45个循环 ,最后72℃
延伸5 min 。扩增产物经含有 0.5 μg/mL EB 的
14 g·L-1琼脂糖凝胶电泳分离 ,在紫外透射仪上观
察照像。
2　结果与分析
2.1　山葡萄基因组DNA提取
山葡萄叶片富含酚类物质 、单宁 、多糖和叶绿
素 ,嫩叶上被毛 。因此 ,山葡萄叶片基因组 DNA 提
取比一般农作物要困难。本实验采用修改后的
CTAB法 、高盐低 pH 法 、SDS 法[ 10] 提取 DNA ,并设
法减少酚类物质 、多糖 、色素的干扰。结果表明 ,以
CTAB法去 RNA后不抽提为最好 ,不仅提取步骤简
单 ,而且所得DNA纯度高 、降解少 ,与λDNA(48 kb)
分子量接近 ,颜色为白色(图 1)。DNA样品去 RNA
后 ,经紫外分光光度计检测 ,OD260/OD280值为1.9 ,
产率达59 ng·mg-1鲜重。说明 CTAB法是提取山葡
萄叶片基因组 DNA的一种较好方法 。
2.2　应用 RAPD标记鉴定山葡萄种质
共筛选了 30个10碱基随机引物 ,从中挑选反
应结果稳定 、重复性好的 4个引物(OPA18 、OPA19 、
OPB05 、OPF14)进 行 研 究。 4 个 随 机 引 物
在7个供试材料上都获得了基因组DNA指纹图
图 1　CTAB法(去 RNA 不抽提)提取山葡萄
基因组 DNA电泳图
　1.λDNA(10 ng);2.73064;3.左山二;
4.75023;5.双丰;6.左山一;7.73093;8.1-2
Fig.1　Agarose gel electrophoresis of genomic DNA
from V.amurensis leaves by CTAB method
　1.λDNA(10 ng);2.73064;3.Zuoshan No.2;
4.75023;5.Shuangfeng;6.Zuoshan No.1;7.73093;8.1-2
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图 2　不同引物扩增 7 份山葡萄种质 RAPD 产物电泳图
　M.分子量标准;1.73064;2.左山二;3.75023;4.双丰;5.左山一;6.73093;7.1-2.
Fig.2　RAPD patterns of 7 accessions of V.amurensis by different primers
　M.λDNA/ EcoRⅠ +HindⅢ marker;1.73064;2.Zuoshan No.2;3.75023;4.Shuangfeng;5.Zuoshan No.1;6.73093;7.1-2
表 2　实验所用引物 、引物序列及扩增产生的 DNA 谱带数和谱带的分子量范围
Table 2　List of oligonucleotides utilized for random primering , their sequences , and amplified fragments
引物名称
Primers
序列(5′～ 3′)
Sequences(5′～ 3′)
DNA谱带数　Number of DNA fragments
总谱带数 Total 多态性谱带数 Variable
DNA 谱带的分子量范围(bp)
Fragments size range(bp)
OPA18 AGGTGACCGT 8 5 350～ 1 584
OPA19 CAAACGTCGG 7 5 360～ 2 700
OPB05 TGCGCCCTTC 6 5 700～ 1 900
OPF14 TGCTGCAGGT 9 6 550～ 1 650
表 3　区分供试山葡萄种质的 RAPD 标记＊
Table 3　RAPD markers distinguishing V.amurensis germplasm＊
RAPD标记
RAPD marker
73064
左山二
Zuoshan No.2 75023
双丰
Shuangfeng
左山一
Zuoshan No.1 73093 1-2
OPA18-750 - - - - - - +
OPA18-900 - + - + - + -
OPA18-980 + + - - - - -
OPA18-1584 - - + + + - -
OPA19-360 + + - + - + +
OPA19-1150 - + + - - - +
OPA19-2700 - - - - - - +
OPB05-700 - + + + + + +
OPF14-950 - - - - - - +
OPF14-1050 + + + + + - +
＊:OPA18-750表示谱带的长度(bp);“ +”表示有;“ -”表示无。
＊:OPA18-750 means the length(bp)of DNA fragment;“ +”presence;“ -” absence。
谱 ,其多态性随引物不同有所差异 ,OPB05扩增的
多态性最丰富(图 2)。4个引物共扩增出 30条清
晰的谱带 ,其中21条为多态性谱带 ,占总谱带数的
70%,各谱带的长度在2 700 ～ 360 bp之间(表 2)。
4754期　　　　　　　　　　　　　　　王军等:RAPD标记在山葡萄种质鉴定中的应用
不同引物扩增的带数不同 ,范围在 6 ～ 9条之间 ,平
均每引物扩增7.5条带。同一引物在不同的试材上
具有不同的带型 ,可以利用扩增出的多态性谱带对
种质进行鉴定(表 3)。值得注意的是 , 在 OPA18 、
OPF14和 OPA19的扩增产物中 ,片段OPA18-750 、
OPF14-950和 OPA19-2700只在雄性山葡萄种质
1-2中出现 ,这是否预示着三个位点与山葡萄雄
性性状有连锁关系 ,有待进一步证实。
3　讨论
山葡萄种质鉴定主要从形态学 、细胞学 、同工
酶等方面进行。因植株形态受环境影响大 ,鉴定种
质的准确性较差 。染色体计数只能区分二倍体 、四
倍体和单倍体。同工酶检测的位点少 ,而且受器
官 、环境条件等的影响较大。应用 RAPD标记鉴定
山葡萄种质可有效克服以上缺陷 ,它直接在 DNA
水平上进行检测 ,检测位点较多 ,不受环境条件 、取
材部位等的影响 ,基因组 DNA用量较少 ,质量要求
也不高 ,操作简便 。如果与其他方法配合使用 ,可
将多种类型种质区分开来 。特别是当经典的形态
描述价值有限时 ,DNA分子水平上的信息将提供
有价值的参考 。但是 , DNA 水平上的信息本身不
能满足对种质鉴定的所有要求 ,分子水平的信息必
须同形态 、农艺学 、抗逆性等性状相结合 ,才能对资
源作出客观评价 。
本实验参照Murray ,Aldrich ,Thomson , Staub等
所述的DNA提取方法 ,并适当修改 ,获得了较好的
效果 ,提取的DNA适于进行 RAPD分析。RAPD扩
增所需模板 DNA 量较少 ,故采用微量提取法 。虽
然RAPD 分析对模板 DNA 质量要求不高 ,但高质
量的 DNA是实验结果可靠的保证之一 。在 RAPD
反应过程中 ,蛋白质 、多酚等物质影响 TaqDNA聚
合酶的活性 ,干扰引物与模板的结合。本实验所提
取的 DNA质量较好 ,达到了 RAPD分析的要求 。
参　考　文　献
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3.Striem M J , Ben-Hayyim G , Spiegel-Roy P.Developing molecu-
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476 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24卷