全 文 ：第 21 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　7 月
Vol.21　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2001
高效毛细管电泳法测定甘草中甘草酸的含量
祖元刚1　李海英1＊　裴　毅2
(1.东北林业大学森林植物生态学开放研究实验室 ,哈尔滨 150040)
(2.哈尔滨市医药公司 , 哈尔滨 150026)
摘　要 　采用高效毛细管电泳法成功地分离测定了甘草中甘草酸的含量 ,在 pH =5.8 的
50mmol/L 磷酸缓冲液 ,检测波长 252nm ,分离电压 25KV ,进样压力 20 mm 汞柱 ,温度 30℃的检
测条件下 ,标准溶液在0.0448mg/ml ～ 0.224mg/ml范围内与峰面积成良好的线性关系 ,回归方程
为:Y=4.16×106x -8.94×104 ,相关系数 r=0.9939 ,具有较高的灵敏度和准确度 。该法操作简
便 、迅速 、可靠 、测试费用低。
关键词　高效毛细管电泳;甘草;甘草酸
ANALYSIS THE GLYCYRRIHIZN ACID CONTENT IN GLYCYRRHIZA
URALENSIS.BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS
ZU Yuan-gang1　LI Hai-ying 1　PEI Yi2
(1.Open Research Laboratory of Forest plant Eco logy , Northeast Forestry Univ ersity , Harbin 150040)
(2.Harbin Medicines Commerce General Co., Harbin 150026)
Abstract　This w as the first time that High Performance Capillary Electropho resis w as used to deter-
mine the g ly cyrrihizin acid content in the plant Glycyrrhiza Uralensis.Ficsh.The capillary used w as
75μm i.d.and 62cm in leng th.UV detection w as set at 252nm.The calibration curve show ed good
linearity.The recovery of gly cy rrihizin acid ranged from 96%～ 99%.This method is simple , rapid
and reliable.
Key words　high performance capillary elect rophoresis;Glycyrrhiza uralensis.glycy rrihizn Acid;
　　甘草是豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis
Fisch)的干燥根及根茎 。我国古代医学家喻其为
“国老” 。它具有补脾益气 、清热解毒 、去痰止咳之功
效 ,其有效成分是甘草酸 ,传统的测定方法采用薄层
扫描法及高效液相色谱法[ 1] 。毛细管电泳是近些
年发展起来的一项生化成份分离分析技术 ,具有灵
敏度高 、准确度高 、简便 、快速等特点。但是 ,目前有
关毛细管电泳技术的实际应用报道不多 。本文用高
效毛细管法成功地分离分析了甘草中甘草酸的含
量 ,在电泳缓冲液 、浓度 、标准曲线制作 、被测样品的
确定 、样品测定结果的精确性和稳定性等方面做了
筛选实验 ,获得了理想的实验结果。
1　材料与方法
1.1　仪器:美国 PE公司 270A-HT 型高效毛细管
电泳仪 ,UV 检测器 ,毛细管为 62cm ×75μm(id)未
处理的石英毛细管 ,检测波长为 252nm ,分离电压
25KV ,进样压力为 20 mm 汞柱 ,温度为 30℃。每次
第一作者简介:祖元刚(1954-),男 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事植物分子生态 、分子生物学 ,资源生态学研究。
现在黑龙江大学生物工程系(黑龙江省哈尔滨市 , 150080)工作。
收稿日期:2001-3-16
电泳前用超纯水及缓冲液分别冲洗毛细管 2分钟 。
1.2　缓冲液:pH=5.8磷酸缓冲液 ,pH =5.8硼酸
一硼酸盐缓冲液 ,用 0.45μm 微孔滤膜过滤 。
1.3　标准品配制:精确称取甘草酸标准品 11.2 mg
,加入 50%乙醇溶解后于 50ml容量瓶中定容至刻
度 ,精确量取 2 、4 、6 、8 、10 ml于 10 ml容量瓶中 ,加
入 50%乙醇定容至刻度备分析用 。
1.4 　样品处理:将 60℃烘干的甘草粉末过 60 目
筛 ,精确称取 1.0423g 、1.0124g 、1.1234g 、0.9923g 、
1.1032g ,加入 80%乙醇 80ml ,索氏回流提取 4小时
过滤 , 以 80%乙醇定容于 100m l容量瓶中备分析
用。
2　结果与讨论
2.1　缓冲液的种类及浓度对分离测定的影响
2.1.1　缓冲液的种类对分离测定的影响
本试验采用了一些有关文献[ 2]报道的 pH =5.
8 ,50 mmol/L 硼酸一硼酸盐为电泳缓冲液 ,结果表
明其灵敏度低 ,分辨率差 ,而用 pH=5.8 , 50 mmol/
L 磷酸盐缓冲液对甘草酸的标准样品进行测定得到
了很好的分离效果 ,如图 1所示。
图 1　甘草酸铵标准品高效毛细管电泳图谱
Fig.1 Electrophoretogram of standard o f g lycyrrhizin acid by
capillary electrophoresis
2.1.2　缓冲液浓度对分离效果的影响
本试验配制了浓度为 50 mmol/L 、60 mmol/L
及70 mmol/ L pH 值为 5.8 的三种磷酸盐缓冲液 ,
分别对甘草酸的标准样品进行测定 ,结果表明 ,随着
磷酸缓冲液浓度由 50 mmol/L 、60 mmol/L 、70
mmol/L 逐 渐 增加 , 峰 面 积分 别 为 1883052 、
1475456 、775650 呈现下降趋势 , 出峰时间为 6.
77min 、6.92min 、5.90min也呈现下降趋势。根据理
论塔板的计算公式:
N=5.54(tR/WYZ)2
其中 , N为理论塔板数 , tR 保留时间 ,WYZ是半峰宽 ,
将不同磷酸盐浓度下的保留时间和半峰宽代入上
式 ,得到相应的理论塔板数 ,如表 1所示 。
从表 1可以看到 ,随着磷酸缓冲液浓度的增大 ,
对甘草酸的分离效率(理论塔板数)增大 。而在磷酸
缓冲液浓度为 50 mmol/L 时 ,峰面积最大 ,此时检
测灵敏度最大 ,根据本试验要求 ,浓度 50 mmol/L
的磷酸缓冲液为电泳的最佳浓度 ,虽然此条件下的
分离效率并非最佳。
毛细管电泳过程在缓冲液中进行 ,缓冲液的选
择直接影响粒子的迁移和最后的分离。缓冲液浓度
是一个很重要的指标 ,它的作用比较复杂 ,有利有
弊 ,增加浓度 ,使离子强度增加 ,因此明显地改变缓
冲液的容量 ,可以减少溶质和管壁之间 、被分离的粒
子和粒子之间的相互作用 ,从而改善分离 ,增加柱
效 ,在本试验也可看到 ,随着磷酸缓冲液浓度的增
加 ,理论塔板数也随之增加。
表 1　磷酸缓冲液浓度的改变对有关参数的影响
Table 1　Some ata with different concentration
of phosphate buffer
磷酸缓冲液浓度(mmol/ L)(Concentration of phosphate
Buffer) 50 60 70
半 峰 宽 WYZ (Half peak
width) 1.08 0.76 0.54
保留 时 间 TR (Migration
time) 6.77 6.92 5.90峰面积 mm2 ×10-4(Peak
Area) 1883052 1475456 775650
塔板数(The number of The-
o retical plates) 217 359 661
图 2　甘草酸铵标准品标准曲线
Fig.2 Calibration of glycyrrhizin acid
在大多数情况下 ,随着缓冲液浓度的增加 ,电
渗流速降低 ,溶质在毛细管内的迁移速率下降 ,因此
迁移时间延长。而对于使用较大的柱子 ,也可能有
偏离上述一般规律的情况发生 , 如有些研究表
明[ 3 ,4] ,在 75μm 的毛细管内改变缓冲液的浓度 ,发
现迁移时间先增加后减少 ,这种减少主要是由于焦
耳热增加使粘度降低造成的 ,在本试验中 ,毛细管柱
也是 75μm ,随着缓冲液浓度的增加保留时间先增
加 ,而后降低 ,从而进一步证实了上述研究得到的规
4253 期　　　　　　　　　　　　　　祖元刚等:高效毛细管电泳法测定甘草中甘草酸的含量
律。
2.2　标准曲线的制作:5种不同浓度的标准品 ,每
种重复测定三次 ,取峰面积平均值 ,测得峰面积为
129528 、243501 、479944 、628420 、869912 ,以峰面积
积分值为纵坐标 ,甘草酸铵含量为横坐标 ,由计算机
处理得回归方程为:Y=4.16×106X-8.94×104 ,
相关系数 r=0.9939 ,标准曲线见图 2 ,试验表明 ,标
准溶液在 0.0448mg/ml ～ 0.224mg/ml范围内与峰
面积呈良好的线性关系。
　　2.3　重现性:在优化的条件下 ,取甘草酸标准
样品溶液 ,重复进样 5次 ,每测定一次后 ,用超纯水
和缓冲溶液清洗毛细管 2min ,分别测定其峰面积和
保留时间 ,分别计算其相对标准偏差 ,得到峰面积的
相对标准偏差为 1.37%,保留时间的相对标准偏差
为 3.56%,见表 3。试验表明 ,用毛细管电泳法测定
甘草中的甘草酸含量 ,误差小 、重现性好 。
　　表 2 保留时间 、峰面积的重现性(RSD%)(n=5)
　　Table 2 The reproducibility of migration time , peak area(RSD , %)(n-5)
次数 No.(T imes NO.) 1 2 3 4 5 相对标准偏差(RSD , %)
峰面积(mm2×10-4)(Peak A rea) 1450443 1475456 1421705 1445623 1461735 1.37%
保 留 时 间(min)( Mig ration
T ime)
6.77 6.53 6.15 6.34 6.49 3.56%
　　2.4　精确性及稳定性:取标准甘草酸样品 ,每
天重复测定 5次 ,连续测定 4天 ,得到峰面积的日内
与日间变异系数分别为 1.96%和 1.38%,均小于
5%,见表 4。可见在优化条件下 ,用毛细管电泳法
测定甘草酸含量 ,可以得到精确而稳定 的实验结
果。
　　表 3 精确度试验
Table 3 Precision of the method
日内(n=5)(within Day) 日间(n=4)(Between Days)
峰面积(mm2×10-4)(Peak A rea) 变异系数/ %(Variation coeffiient) 峰面积(mm
2×10-4)(Peak Area) 变异系数/ %(Variation Cofficient)
1476592
1435693
1498776
1461797
1429835
1.96%
1456986
1431796
1479832
1465593
1.38%
图 3　甘草样品的 HPCE谱图
Fig.3 Electrophoretogram of Sample of Glycyrrhiza Uralensis.Fish
2.5　样品峰的确认:在优化的毛细管电泳条件下 ,
测定从甘草中提取的甘草酸的样品含量 ,试验测得
甘草酸的样品电泳图谱有 4个峰 ,如图 3所示 ,在甘
草酸的样品中加入标准品 ,看到第 2号峰的峰高及
峰面积增加 ,说明第 2号峰代表甘草酸的吸收峰 ,重
复测定 3次 ,取平均值 ,结果如表 5。
本试验发现甘草酸样品的保留时间变短了 ,这
主要是因为从甘草中提取的甘草酸的样品组成复
杂 ,盐份含量较高 ,影响了甘草酸在缓冲液中的保留
行为 ,有关盐分含量影响分离效果的研究 ,已经有不
少文献作过报道。
2.6　加样回收率测定:精确称取甘草粉末 6份 ,前
3份加入 3mg 甘草酸标准品 ,后 3份加入 1.5mg 甘
草酸标准品 ,按样品测定方法操作 ,每一样品测定 3
次 ,取平均值 ,用回收率公式进行计算 ,结果如表 6 ,
从表中可看到 ,本试验获得了理想的实验数据 ,具有
较好的准确度 。
426 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
表 4 甘草酸样品含量测定结果
Table 4 The result of the content of glycyrrhizin acid of sample
　　样品号 No.　　(Sample NO.) 1 2 3 4 5
样品重/g(Weight of Sample) 1.0423 1.0124 1.1234 0.9923 1.1032
峰面积平均值(mm2×10-4)(Average of peak area) 48855582 49327691 57328273 50011935 56176387
含量/ %(Content) 1.1276 1.1721 1.2273 1.2124 1.2247
平均含量/ %(Average Content) 1.1928
　　表 5　 加样回收率测定结果
Table 5 Recovery of the method
样品号 No.(Sample NO.) 1 2 3 4 5 6
样品重量/g(Sample Weight) 0.3006 0.3017 0.3045 0.1510 1.1527 0.1514
样品中甘草酸含量/mg(Glycy rrhizin acid content in samples) 3.58 3.60 3.63 1.80 1.82 1.81
甘草酸加入量/mg(The wight of additional G lycyr rhizin acid) 3 3 3 1.5 1.5 1.5
混合后测得量/mg
The G lycyrrhi in acid content in mix tresamples 6.47 6.58 6.57 3.25 3.20 3.25
回收率/ %(Recovery) 96.3 99.3 98 96.7 98.7 96
平均回收率/ %(Average Recovery) 97.5
变异系数/ %(Variation coefficient) 1.396
3　结论
本试验用 270A-HT 型高效毛细管电泳仪对
从甘草中提取的甘草酸的测定进行了软件及电泳条
件的优化 ,并对其重现性 、精密度 、准确度进行了测
定 ,可以看到 ,用此方法测定甘草酸 ,具有速度快;重
复性 、分辨率 、准确度好;样品及缓冲液用量少;自动
化程度高等优点 ,具有广泛的应用前途 。
参　考　文　献
1.石力夫 ,全山丛.薄层扫描法测定甘草制剂中甘草酸含量
的研究.中草药 , 1993 , 24(6):296～ 297。
2.董善士 ,祝昱.复方甘草酸单铵注射液中黑色沉淀物的剖
析 , 中国药科大学学报 , 1992 , 23(5):280～ 282。
3.林柄承.毛细管电泳导论.北京:科学出版社 , 1996
4.汪正范 ,林柄承.现代科学仪器 , 1995 , 46(3):10～ 14。
4273 期　　　　　　　　　　　　　　祖元刚等:高效毛细管电泳法测定甘草中甘草酸的含量