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Studies on the culture of Porphyridium aerugineum 755

铜绿紫球藻(Porphyridium aerugineum)755培养的研究



全 文 :第 24 卷 第 3 期             植   物   研   究 2004 年 7 月
Vol.24 No.3            BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July  2004
第一作者简介:李战(1979—),女 ,硕士研究生 ,主要从事微藻生物技术与藻类分子生物学研究。
*通讯作者
收稿日期:2003-12-10
铜绿紫球藻(Porphyridium aerugineum )755培养的研究
李 战1 , 2 冯奇俊1 童 昱1 王全喜1*
(1.上海师范大学生命与环境科学学院 , 上海 200234)
(2.上海市卢湾高级中学 , 上海 200023)
摘 要 紫球藻是一种具有潜在应用价值的经济微藻 ,它的生长速率受各种环境因子的影响。本
文研究了不同光强 、光周期 、盐度 、NaHCO3 浓度 、葡萄糖浓度 、培养方式等因子对铜绿紫球藻
(Porphy ridium aerugineum)755生长的影响 ,并确定其最佳的培养条件 。此外还分析了该藻的
吸收光谱 ,为其培养提供参考数据 。
关键词 铜绿紫球藻;培养;光强;光周期;盐度;吸收光谱
Studies on the culture of Porphyridium aerugineum 755
LI Zhan1 ,2 FENG Qi-Jun1 TONG Yu1 WANG Quan-Xi1*
(1.College of Life and Environment Sciences , Shanghai No rmal University , Shanghai 200234)
(2.Luwan Senio r High School , Shanghai 200023)
Abstract Porphyridium is a valuable algae w hich is a potential source of several high valued poly-
mers like poly saccharides , polyunsaturated fat ty acids and pigments.Many environment factors ef fect
the g row th of Porphyridium aerugineum .The ef fects of lig ht intensi ty , photoperiod , salinity ,
shaken and static cultures , NaHCO3 and glucose on g row th of Porphyridium aerugineum were stud-
ied.The abso rption spect ra of the algae w as also analy sed.All these studies are proposed to find those
optimization of cul ture condit ions of Porphy ridium aerugineum .
Key words Porphyridium aerugineum ;cultures;light intensity;photoperiod;salini ty;absorption
spectra
紫球藻(Porphyridium Nageli , 1849)因为能
够合成各种重要的生物活性物质 ,已引起国内外的
广泛关注。它分泌的细胞外硫酸多糖不仅有着独
特的胶体性质而且还能有效的抑制各种病毒[ 1] ,
在医药等领域有着广阔的应用前景。不饱和脂肪
酸二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(AA)都是人
体必需的脂肪酸 , EPA 能有效阻止血小板凝聚和
降低胆固醇 ,AA 是前列腺素的前体[ 2] 。藻胆蛋白
在荧光技术上也有着广泛的应用。所以紫球藻有
着很高的应用价值和巨大的市场潜力 ,它已逐渐成
为研究开发的热点。
紫球 藻属 是单 细 胞红 藻 , 系 于 红藻 门
(Rhodophyta),红毛菜亚纲(Bangioideae),紫球藻目
(Bangiales),紫球藻科(Porphyridiaccae)[ 3] 。细胞圆形
或卵形 ,直径5 ~ 24 μm 。一般认为紫球藻细胞是不
运动的细胞 ,但也有人认为紫球藻细胞是运动的 ,只
是运动速率较慢为0.66 [mu] ms-1 [ 4] 。在自然界中
紫球藻的分布范围广泛 ,从淡水 、咸水 、海洋甚至潮
湿土壤表面 、温室花盆上都可以分离出来[ 2] 。
紫球藻的培养条件 、培养工艺是其应用的基
础。紫球藻的生长及其各种活性物质的产量受各
种环境因子的影响。国内已有几家研究单位对紫
球藻的培养进行探索 ,取得了一定的进展 ,但主要
还处于实验室研究阶段[ 5 , 6] 。铜绿紫球藻在国内
还未见报道 ,国外对紫球藻的研究已进入光生物反
应器的批量生产[ 7 ,8] 。本文研究铜绿紫球藻(Por-
phyridium aerugineum)755 在实验室培养条件
下 ,光强 、光周期 、盐度 、有机物质等对其生长的影
响及吸收光谱的特征 ,以优化其培养条件 ,为大量
培养紫球藻奠定基础 。深入了解铜绿紫球藻的生
长环境条件 ,对提高紫球藻的产量 ,改善紫球藻的
品质有一定的意义。
1 材料与方法
1.1 藻种
本试验的藻种铜绿紫球藻(Porphyridium
aerugineum)755购于中科院水生所 。由本实验室
传代保种 ,每两个星期转接到新鲜培养基中 ,保持
藻种的活力。
1.2 藻种的纯化
采用平板稀释涂布法 ,取对数期的藻种在固体
培养基上涂布经稀释的藻液 ,用封口膜封口 ,倒置
于玻璃培养架上 ,连续光照。光照强度为 1 500 ~
2 000 lx ,温度为 25℃。培养 10 ~ 12 天左右 ,取颜
色均匀的大块藻落再次转接到固体培养基中 ,这样
多次重复 ,直到镜检无杂菌为止。选取均一的藻落
在无菌条件下转移至 10 mL 的大试管中 ,在液体
培养基中进行预培养 ,以备试验用藻种 。
1.3 培养基
试验用培养基为本实验室改良的 KOCH 培养
基 ,固体培养基为加入 1.5%的琼脂 。海水取自上
海市奉贤海区 ,用0.45 μm的微孔滤膜抽滤 、灭菌。
1.4 培养条件
使用 150 mL 的三角烧瓶 ,培养基为 70 mL ,
取对数期的藻种 ,接种量为培养液的 20%,三角烧
瓶用透气的封瓶膜封口 。所用仪器均经过高温灭
菌 ,操作过程在超净台上无菌操作 。
培养 室温 度为 25℃, 培养 架的温 度为
25±2℃,飞利浦日光灯管提供光源 ,用照度计测量
光强为 2 500 lx ,本试验所用光强范围为 1 500 ~
3 500 lx ,光周期为 12 L:12 D ,静置培养每天固定
时间摇瓶 4次 ,振荡培养的频率为 90 次/min 。所
有实验均设有两个平行对照组 。
1.5 测定方法
1.5.1 生长速率的测定
从每实验瓶中取培养的藻液 3 mL ,取前用磁
力搅拌器或者振荡使藻液均匀。放置于 1 cm宽的
比色皿中 ,用 754 紫外分光光度计在 760 nm 处测
定OD值 ,用 OD760表示[ 7 ,8] 。细胞数则用血球计
数板计数 。做细胞数与吸光度的回归曲线 。
1.5.2 藻生长率及细胞分裂时间的测定
μ=LN X 2-LN X 1/ T 2-T 1 , g=LN2/μ
X1为藻的初始浓度 ,X2 为实验结束时藻的浓度 , T 1 ,
T2为时间(d), μ为生长率 ,g 为细胞分裂时间。
1.5.3 光谱测定
光照度计的测定值(lx)与光合有效量子的辐
射强 度 (μEm-2·S-1)的 关 系 为:1 000 lx =
15.76μEm-2·S-1 。取对数期的藻种 , 用 754-UV
分光光度计在 400 ~ 800 nm 之间每隔 10 nm 进行
波长扫描 ,绘制吸收曲线 。
2 结果与分析
2.1 光强对铜绿紫球藻的影响
光能作为光合作用的能量底物 ,直接影响藻细
胞的生长 。为考察细胞生长与光强之间的关系 ,本
试验研究了不同光强对铜绿紫球藻生长的影响 。
实验设计 5个光强梯度 ,在 1 500 ~ 3 500 lx 之间 ,
每隔 500 lx 为一梯度。在自制的光照培养架上静
置培养。
实验结果如图 ,由图 1生长曲线可以看出 ,前
5天不同光强对藻生长没有明显的差别 ,从第 5天
开始不同光强的影响趋于明显。以第 9天为例 ,其
生长速度与生物量的大小为 2 500 lx >2 000 lx >
3 000 lx>1 500 lx >3 500 lx ,光强超过 3 000 lx 藻
的生长出现抑制作用。由图 2 生长率可以得出相
同的结论 ,2 500 lx 生长率是 3 500 lx 的 1.64倍 ,
是 1 500 lx 的 1.38倍 。可见适当的增加光强有利
于增强藻体的光合作用能力 ,促进藻细胞生长。所
以铜绿紫球藻的适宜光强为 2 000 ~ 2 500 lx ,最适
宜光强为 2 500 lx 。2 500 lx 可能是光饱和点 ,超
图 1 光强对铜绿紫球藻生长的影响
Fig.1 Effect of light intensity on the g row th of
Porphy ridium aerugineum
318       植  物  研  究                  24 卷
图 2 铜绿紫球藻 9 天的生长率
Fig.2 Specific g rowth rate of Porphyridium aerugineum
over 9 day s g row th period
过 2 500 lx 出现光抑制现象 ,生长速度降低 。本实
验细胞计数与 OD760的值成正比 。
培养过程中紫球藻培养基的 pH 值随着藻的生
长而逐渐升高 ,以 2 500 lx 光强为例如图 3 ,培养 15
天的 pH值为7.9 ,第 19天达到最大为 8.2。这主要
是由于藻类生长对培养基中 CO2的消耗 ,所以适当
的增加培养基中CO2 含量将更有助于藻的生长。
紫球藻为光能自养型生物 ,在黑暗处几乎不生
长 ,适当的提高光强不仅能提高细胞的光合作用
率 ,还能促进紫球藻的生长。有实验证明在一定范
围内光强的增加能够加快细胞的分裂速度 ,光强从
538 lx增加到 4 300 lx 时生长速率增加 400%,细
胞的体积和细胞质颗粒形成也随之增加[ 5] 。这与
我们的实验结果不完全一致 ,可能是不同藻种之间
存在着一定的差异。在实验过程中通过镜检发现
光强增加 ,细胞体积也会增加 ,前 3天细胞颗粒较
小 ,随着培养时间的延长细胞颗粒也随着增大 。
2.2 光周期对铜绿紫球藻的影响
光周期是影响光合作用的另一个重要的因子 ,
光照时间的长短直接影响藻体生长及产量 。本研
究设计了 5组不同的光周期 ,通过延长光照时间来
研究对生长的影响 。测定方法采用血球计数与
OD760做参照 , 其关系见表1 , 可以看出细胞数与
图 4 光周期对铜绿紫球藻生长的影响
Fig.4 Effect of Photoperiod on the g rowth of
Porphyridium aerugineum
图 3 2 500 Lx 培养基 pH 的变化
Fig.3 Change o f pH of culture medium at 2 500 lx
表 1 不同光周期下铜绿紫球藻 OD 值与细胞数
的回归方程和相关系数
Table 1 Reg ression equation of different pho toperid
on OD760 and cells and correlation coefficient
光周期
Photoperid
回归方程
Regression equation
相关系数
Correlation coeff icient
12:12 y=2 x -0.028 6 R2=0.953
14:10 y=x -0.031 4 R2=0.974
16:8 y=2x-0.074 2 R2=0.903
18:6 y=x -0.081 5 R2=0.974
24:0 y=x +0.012 5 R2=0.915
注:y :细胞数×107 个/mL , x :OD 760值
OD760值的结果基本一致 ,其生长曲线也成正比 。
实验结果如下图 ,不同光周期对铜绿紫球藻的
影响不是很明显 ,适当的延长光照时间有利于藻体
的生长。图 4可以看出随着培养时间的延长 ,从第
9天开始不同光照时间对生长的影响趋于明显 。
以第 13 天为例 ,其增长速度依次为 14 h>16 h>
12 h>18 h>24 h 。图 5为 11天的生长率 ,由图可
见 14 h光照时间的生长率最大 ,分别为 24 h的 1.
29倍 , 16 h的 1.13倍 。铜绿紫球藻的最适宜光周
期为 14 L:10 D。适当延长光照时间可以提高生
长效率 ,主要因为光合作用直接产生碳水化合物 ,
延长光照直接增加了紫球藻的产量。
紫球藻一般光周期为 12 L:12 D ,适当的延长
光照时间 ,有利于紫球藻的生长 ,同时也有利于细
图 5 铜绿紫球藻 11 天的生长率
F ig.5 Specific g row th rate o f Porphyridium aerugineum
over 11 days grow th period
3193 期            李战等:铜绿紫球藻(Porphy ridium aerugineum)755 培养的研究
图 6 不同盐度对铜绿紫球藻生长的影响(OD760)
Fig.6 Effect o f salinity on the grow th of
Porphy ridium aerugineum (OD760)
胞外多糖的产生。光照时间过长 ,生长率反而下
降 ,这是因为胞外多糖的分泌使细胞更易于聚集 、
附壁 ,从而使细胞生长所需的营养物质和光照强度
下降。多糖的产生可能是细胞的一种自身保护作
用。
2.3 盐度对铜绿紫球藻的影响
一般认为紫球藻的抗盐性较强 ,培养液盐度在
3.5%~ 4.6%对生长无影响 ,而且能抑制蓝藻等杂
菌的生长 。本试验设计三个盐度梯度:1%、2%、
3%。实验结果如图 6 、7。盐度对铜绿紫球藻的影
响比较明显 ,以第 13天为例 ,其生长速度依次为
1%>2%>3%。由图 7可得 1%盐度的生长率为
2%的 1.124 倍 ,为 3%的 1.33倍 。可见 1%的盐
度更适合铜绿紫球藻的生长。该实验 OD760值的
生长曲线与细胞计数的结果成正比 。
一般认为紫球藻盐度适应范围较宽 ,这与我们
的实验结果一致 ,铜绿紫球藻在 3种盐度中均生长
良好 。不同种之间的最适盐度可能有差别 。盐度
不应是限制其分布的环境因子。在高盐度下紫球
藻的抗菌能力也随着增强 。有实验表明盐度对其
生物活性物质 EPA和 AA的产量有影响[ 2] 。
2.4 NaHCO3对铜绿紫球藻的影响
在 KOCH 培养基中 ,溶解的 CO2 是唯一的碳
图 8 NaHCO3 对铜绿紫球藻生长的影响
Fig.8 Effect of NaHCO 3 concentra tion on the grow th
of Porphyridium aerugineum
图 7 铜绿紫球藻 15 天的生长率
ig.7 Specific g row th rate o f Porphyridium aerugineum
over 15 days grow th period
源。有人认为紫球藻对有机碳的利用率较低 ,但对
HCO3-和 CO2 的利用率很高 。所以本实验设计 7
种浓度的 NaHCO3:分别为 0 , 100 , 200 , 400 , 800 ,
1 200 , 1 600 mg/ L。实验结果如图8 、9。由图 8生
长曲线可以看出在一定范围内 NaHCO3 对铜绿紫
球藻的影响比较显著 。从第 3 天开始不同浓度
NaHCO3的影响逐渐明显 ,以第 9天为例其生长速
度依次为 400>200>100>0>800>1200>1600
mg/L 。随着 NaHCO3 浓度的增加 ,藻体的生长速
度也随着增长。400 mg/L 时生长速度达到最大 。
当NaHCO3 浓度继续增加时 , 藻的生长速度随之
减慢 。实验的第 6天开始 800 , 1 200 ,1 600 mg/L
的藻液颜色变淡 ,镜检有部分藻细胞死亡。第 8天
该3组培养液变白 。图 9 生长率可得 400 mg/L
是对照组 0 的 1.489倍 ,是 800 mg/L 的 1.7倍 。
可见添加 400 mg/L 的 NaHCO3 为最佳浓度 。
NaHCO3的浓度过高 ,会增加培养基的 pH 值 ,对
藻的生长也起抑制作用 。该实验的 OD 值的生长
曲线与细胞计数的结果基本一致。对生长第 7 天
结果作方差分析见表 2 , 结果表明 P 值为
0.013 907 ,小于0.05 。说明不同 NaHCO3 的浓度
对第 7天生长结果的影响均显著(P<0.05)。
王长海等培养紫球藻(Porphyridium cruentum)
图 9 铜绿紫球藻 9 天的生长率
F ig.9 Specific g row th rate o f Porphyridium aerugineum
over 9 days g rowth period
320       植  物  研  究                  24 卷
表 2 铜绿紫球藻第 7 天生长结果方差分析
Table 2 Variance analysis for the g rowth results of Porphyridium aerugineum on the 7 th day
差异源 SS df MS F P-value F crit
组间 0.060 851 6 0.010 142 6.383 431 0.013 907 3.865 978
组内 0.011 122 7 0.001 589
总计 0.071 973 13
图 10 葡萄糖对铜绿紫球藻生长的影响
Fig.10 Effect of glucose on the grow th of
Porphyridium aerugineum
图 12 静置与振荡培养对铜绿紫球藻生长的影响
Fig12 Grow th of Porphyridium aerugineum in shaken and
static cultures over 9 day s grow th period.
时 ,在培养基中添加了不同的营养盐 ,结果发现 ,
NaHCO3对紫球藻的影响较大 ,能够提高紫球藻的
生长速率和生物量[ 5] 。实验结果表明:铜绿紫球
藻可以吸收利用 NaHCO3 作为光合作用的碳源 ,
以补充培养基中 CO2 的不足 ,促进藻类的生长繁
殖 ,同样避免了通气补充 CO2 带来的污染问题。
2.5 葡萄糖浓度对铜绿紫球藻的影响
葡萄糖为常用的有机碳源 ,能促进多种藻类的
生长。本实验设计 5个浓度梯度 0 ,1%, 2%, 3%,
4%。由表 3可以看出细胞计数与 OD760的结果基
本一致。
图 10生长曲线可得添加葡萄糖对铜绿紫球藻
有促进作用。第 9天生长速度依次为 1%>2%>
3%>4%>0。图 11 可见 1%、2%、3%、4%之间
的促进作用差异不明显 ,最适浓度为 1%。葡萄糖
的浓度过高容易在培养基中滋生细菌。对于碳源
的需求量不同藻种要求不同 ,同一藻种在不同培养
条件下和不同生长阶段的需求量也不同 。王明兹
等用紫球藻(Porphyridium cruentum)做实验的结
图 11 铜绿紫球藻 13 天的生长率
Fig.11 Specific grow th rate of Porphyridium aerugineum
over 13 days grow th period
图 13 铜绿紫球藻 9 天的生长率
Fig.13 Specific grow th rate of Porphyridium aerugineum
over 9 days g rowth period
表 3 葡萄糖浓度对铜绿紫球藻 OD760值与细
胞数的回归方程
Table 3 Regression equation of different glucose on
OD760 and cells and cor relation coefficient
浓度(%)
Concent ration
回归方程
Regression equation
相关系数
Correlation coeff icient
0 y =4 x-0.083 3 R2=0.914 3
1 y =0.9 x+0.120 4 R2=0.940 9
2 y =x+0.096 2 R2=0.894 1
3 y =0.9 x+0.082 8 R2=0.904 5
4 y =x+0.193 5 R2=0.904 2
注:y :细胞数×106 个/mL;x :OD 760值
果为添加 2%的效果最佳[ 6] 。
2.6 不同培养方式对铜绿紫球藻的影响
本实验研究了静置与振荡两种培养方式对铜
绿紫球藻生长的影响 ,实验结果如图。图 12为两
种培养方式下生长曲线的对照 ,可以看出振荡培养
的生长速度明显高于静置培养 ,图 13为 9天生长
率对比 ,振荡培养是静置培养的 1.323倍。在静置
培养过程中从第 3天始细胞大量的出现相互粘连
和附壁现象 ,振荡培养过程中只有少部分细胞出现
3213 期            李战等:铜绿紫球藻(Porphy ridium aerugineum)755 培养的研究
这种现象 ,没有大量的附壁和相互粘连的现象 。该
实验OD760值的生长曲线与细胞计数的结果成正比 。
细胞的相互粘连与附壁主要是因为在培养过
程中细胞分泌大量的细胞外多糖。细胞连在一起
影响了细胞对培养基中营养物质的吸收 ,细胞附于
瓶壁使透光度下降 ,从而降低了细胞的生长速度 。
振荡培养有利于打破多糖的束缚 ,使藻体的营养更
加均衡 。从混合培养的角度看振荡培养有助于促
进气液传递 、液固传递的作用[ 9] ,防止藻细胞沉降 ,
有利于将藻体产生的大量氧气从培养液中排出 ,维
持培养基中较低的溶解氧浓度 ,利于培养基中营养
成分被充分吸收 。 Ing rid 用(Porphyridium pur-
pureum)做振荡与静置培养的对照 ,其振荡培养的
效果要明显好于静置培养[ 10] ,与我们的实验结果
一致 。振荡培养属于自然通气的小规模培养 ,其摇
床的频率 、瓶塞的通气性等因素也会对铜绿紫球藻
的生长产生影响 ,这些因素还有待于进一步研究。
2.7 铜绿紫球藻的吸收光谱
图14为铜绿紫球藻在对数生长期时 400 ~ 800
nm之间的整细胞吸收光谱。如图所示有 6个吸收
峰 ,410 , 450 , 560 ,630 , 680 ,760 nm。其中最高吸收
峰为410 nm 。410 、450 和 630 nm为叶绿素的吸收
峰 ,560 、680和 760 nm为藻胆蛋白的吸收峰。温少
红等做紫球藻(Porphyridium cruentum)活体吸收光谱
有6 个峰 , 430 、678 nm 为叶绿素 a 的吸收峰 ,497 ,
548 ,563 nm为藻红蛋白吸收峰 ,629 nm为藻蓝蛋白吸
收峰[ 11] 。王长海等做紫球藻(Porphyridium cruen-
tum)的吸收光谱有 3个吸收峰:412 , 550 ~ 560 , 690
nm
[ 12] 。本实验结果与以上两人实验结果基本一致 。
图 14 铜绿紫球藻的吸收光谱
Fig.14 Abso rption spectra of Porphyridium aerugineum
藻类的吸收光谱曲线具有明显相似性 ,吸收峰
与藻种色素种类组成及含量有关 ,一 般在 670 ~
680 nm 之间的吸收峰是细胞内色素吸收峰。但因
各种藻类色素含量和种类的不同而有所差异 。不
同特征的吸收峰也是鉴定藻种的依据 ,本次实验除
吸收峰位置在仪器误差范围内略有变动外 ,以上光
谱扫描结果在 2次实验中均一致 。
3 结 论
目前国内对铜绿紫球藻的研究还未见报道 ,我
们的实验结果表明铜绿紫球藻和其他紫球藻种相
比在培养条件和细胞特征上既有相似性又有其独
特性 。其最适条件为:
铜绿紫球藻的最适光强为 2 500 lx;最适光周
期为 14 L:10 D;最适宜盐度为 1%;培养基中添加
400 mg/L NaHCO3 最适宜;最适宜葡萄糖浓度为
1%;振荡培养要优于静置培养。
参 考 文 献
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