全 文 ：第 25卷　第1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005 年　1 月
Vol.25　No.1　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2005
基金项目:国家 973计划资助项目(G1999016000)
第一作者简介:刘桂丰(1960—),男 ,教授 ,主要从事分子遗传及林木育种方面的研究工作。
收稿日期:2004-07-27
干旱胁迫下刚毛柽柳消减文库的构建及分析
刘桂丰1 , 2　侯英杰2 　王玉成2 　褚延广2
(1.北京林业大学生物科学与技术学院 , 北京　100083)
(2.东北林业大学林学院 , 哈尔滨　150040)
摘　要　以干旱胁迫下的刚毛柽柳根部组织 cDNA为 tester ,正常生长的刚毛柽柳根部组织 cDNA
为 driver ,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了干旱胁迫下刚毛柽柳根部组织的消减文库 。文库
克隆的重组率为95%,插入片段大部分集中在 250 ～ 600 bp之间。通过对文库阳性克隆的随机测
序 ,获得了如Mn-SOD 、myb相关蛋白 、锌指蛋白等 17 种与干旱胁迫相关的基因 ,它们涉及了植物
的渗透调节 、信号传递 、转录调控 、活性氧清除等方面。所得 EST序列已被GenBank收录 。实验为
抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下柽柳根部基因的表达奠定了基础。
关键词　干旱胁迫;刚毛柽柳;抑制性消减杂交;表达序列标签
Construction and analysis of Tamarix hispida suppression subtractive
hybridization library under drought stress
LIU Gui-Feng1 ,2　HOU Ying-Jie2　WANG Yu-Cheng2　CHU Yan-Guang2
(1.School of Biological Sciences and Biotechnology , Beijing Forestry University , Beijing　100083)
(2.Forest College Northeast Forestry University , Harbin　150040)
Abstract　Using cDNA from Tamarix hispida roots treated with drought stress as tester and cDNA from
Tamarix hispida roots in normal growth as driver , suppression subtractive hybridization(SSH)was employed
to construct cDNA subtracted library.In the library , the rate of recombination was 95%, the size of inserts
was 250 ～ 600 bp.17 drought stress-associated genes were obtained by DNA sequencing the positive clones
picked randomly , such as Mn-SOD myb-related protein zinc finger protein , etc.These genes included osmotic
regulator signal component regulatory protein and antioxidant enzyme.GenBank had accepted all the se-
quences.The research had established a basis for cloning stress-resistance genes and further studying genes
expression in Tamarix hispida roots under drought stress.
Key words　drought stress;Tamarix hispida;suppression subtractive hybridization;expressed sequence
tags
柽柳属植物广泛分布于我国西北干旱地区 ,具
抗旱 、耐盐碱 、耐水湿 、耐沙埋及耐贫瘠的特性 ,在
干旱 、半干旱地区始终保持着优势种和建群种的地
位[ 1] 。它不仅是水土保持树种和盐碱地重要的绿
化造林树种 ,同时还是优良的防风固沙植物。单就
柽柳的固沙效果和固沙量来说 ,柽柳属植物是我国
荒漠 、半荒漠地区最好的固沙灌木。在水分胁迫
下 ,柽柳通过水势 、相对含水量 、持水力 、蒸腾速度
等系列水分生理的调节来抵抗胁迫。根据柽柳属
植物的叶解剖特点 ,结合在我国分布的生态环境 ,
将柽柳分为3大类型[ 2] ,其中刚毛柽柳属于中度耐
旱的种类 ,它持水力强 ,相对含水量下降幅度小 ,干
旱处理后仍能保持71.66%的相对含水量[ 3] 。许多
学者对柽柳的抗旱机理进行了研究 ,如王霞等研究
了脯氨酸 、可溶性糖含量的变化及 K+ 、Na+离子的
积累规律[ 4] ;王燕凌等测定了塔里木河下游两个断
面不同水位下生长的柽柳组织中渗透性物质 、
SOD 、POD和膜脂过氧化的变化 ,认为地下水位下
降导致的水分胁迫使柽柳体内可溶性糖 、脯氨酸 、
MDA含量及 SOD 、POD活性均提高 ,并研究了它们
的变化规律[ 5] 。但目前 ,对柽柳的抗旱研究都集中
于对几项生理指标的测试 ,而在分子水平上的研究
尚未见报道。在长期的历史进程中 ,柽柳形成了一
系列适应干旱环境的优良特性 ,积累了大量的抗逆
基因。通过基因工程克隆柽柳抗旱相关基因并转
移到其它植物中 ,必将在改善生态系统 、改造生态
环境的同时 ,获得显著的经济效益 。
消减杂交是克隆差异表达基因的经典方法 ,最
初采用羟基磷灰石柱层析或磁珠法分离差异杂交
单体[ 6] 。抑制性消减杂交技术(suppression subtrac-
tive hybridization , SSH)是 Diatchenko 等人[ 7]于 1996
年依据消减杂交和抑制 RCR发展的一种分离差异
基因的新方法 ,它克服了以往任何一种消减方法的
技术限制 ,除利用了消减杂交原理外 ,还引入了抑
制性 PCR技术[ 8] ,在消减杂交过程中使丰度不同
的 cDNA拷贝数趋于平衡 ,灵敏度增高 ,保证了较
低丰度的差异表达基因也得到有效的克隆 。而且
采用了两次消减杂交及两次 PCR ,极大地降低了假
阳性率 ,因而在分离差异表达基因研究中得到广泛
运用[ 9] 。
本实验利用抑制性消减杂交技术克隆出刚毛
柽柳根部多个抗旱相关基因 ,为系统研究其抗旱机
理和获得全长抗旱基因奠定了基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
将实验室的盆栽刚毛柽柳分为两份 ,一份正常
(土壤含水量为最大持水量的 80%)生长 ,作为对
照;一份进行干旱(土壤含水量为最大持水量的
25%)胁迫 ,60 h 后取材 。快速剪取处理及对照柽
柳的根系 ,蒸馏水洗净后装入塑料袋中 ,迅速置于
-70℃保存备用。
1.2　主要生化试剂
SMART RACE cDNA Synthesis Kit(Clontech 公
司);限制性内切酶 Afa Ⅰ及 Taq酶(宝生物工程(大
连)有限公司);DNA 回收试剂盒(上海华舜工程有
限公司);克隆载体 pGEM-T Vector System (Promega
公司);MegaBACE1000测序仪(Amersham Biosciences
公司);引物由上海博亚生物技术公司合成 。
Adapter 1 、Adapter 2R、P1 、NP1 、NP2 序列见
Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit UserMan-
ual。
1.3　抑制消减杂交
1.3.1　SDS法提取总 RNA及其消化
向1.5 mL 离心管中加入0.5 mL的 SDS 提取
液 , β-巯基乙醇0.1 mL ,氯仿0.4 mL ,Tris-酚0.4 mL;
液氮研磨刚毛柽柳根部组织后加入离心管中 ,剧烈
震荡20 min , 12 000 r/min离心5 min;移上清于另一
新离心管中 , 向其中加入氯仿 0.4 mL , Tris-酚
0.4 mL ,剧烈震荡 10 min , 12 000 r/min离心 5 min;
取上清 加入 0.6 mL 氯 仿 , 剧烈震 荡 5 min ,
12 000 r/min离心5 min;向上清中加入0.4倍体积无
水乙醇和0.6倍体积的 LiCl , 混匀 , 冰浴10 min ,
12 000 r/min离心 10 min沉淀 RNA;用 75%的乙醇
洗涤沉淀后溶于 DEPC 水中。将提取的总 RNA 用
DNase I处理消化 DNA ,0.8%非变性琼脂糖凝胶电
泳检测总 RNA及消化后总 RNA的质量。
1.3.2　RNA反转录及 PCR扩增
取干旱处理和对照材料总 RNA 各1 μg , 用
SMART RACE cDNA Synthesis Kit分别反转录为 cD-
NA ,并将反转录产物稀释至100 μL。然后以试剂盒
中 5 CDS和Smart II Oligo为 PCR引物进行扩增 ,反
应体系为:10×PCR Buffer 2 μL , dNTP 200μmol/L ,
ExTaq 1 U ,5 CDS和 Smart II Oligo 各1μmol/L ,反转
录产物1 μL;反应总体积为20 μL。PCR条件为:
94 ℃预变性 1 min;94 ℃30 s ,66 ℃ 30 s , 72 ℃3
min , 30个循环;72℃保温 7 min。将 PCR产物进
行电泳 ,发现扩增产物呈弥散状态 ,长度在0.3 ～
3.0 kb之间 ,说明 cDNA反转录质量较好 ,并已经成
功扩增。
1.3.3　抑制消减杂交
取处理柽柳和对照柽柳 cDNA PCR 产物各
1μg ,分别用内切酶 Afa Ⅰ切割 , 37℃温育 2 h 后将
酶切产物进行纯化 、沉淀 ,溶于5.5μL超纯水中 ,各
取0.5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测 。以干旱处理
的样品作 tester ,对照样品作 driver。取 tester 1 μL加
入5 μL水稀释 ,分别取2μL稀释液与 Adaptor 1 和
Adaptor 2R连接 ,连接体积为10μL , 16℃连接48 h ,
70 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25 卷
图 1　刚毛柽柳总 RNA电泳图
泳道 1～ 3均为刚毛柽柳总 RNA
Fig.1　Totle RNA electrophoresis of Tamarix hispida
Lane 1～ 3:Tot le RNA of Tamarix hispida
以保证连接效率 。
第一轮杂交 ,取 Adaptor 1和Adaptor 2R连接液
各1.5 μL于两个 PCR管中 ,分别加入 driver cDNA
1.5 μL ,4×Hybridization Buffer 1μL混合 ,加入10 μL
石蜡油 ,98℃变性2 min ,68℃杂交 8 h。
第二轮杂交 ,将 1 μL driver cDNA 加入2 μL超
纯水和 1μL 4×Hybridization Buffer ,98℃变性2 min
后 ,取1μL与 Adaptor 1和 Adaptor 2R杂交液混合 ,
68℃杂交 16 h ,然后 ,向杂交液中加入200 μL的 Di-
lution Buffer ,68℃保持 10 min ,将杂交液稀释 15倍
作为 PCR模板 。
第一轮 PCR , 反应体系为:10 ×PCR Buffer
2 μL ,dNTP 200 μmol/L , ExTaq 1 U ,引物 P1 1μL ,模
板(第二轮杂交液)2μL;反应体积为20μL ,PCR条件
为:75℃10 min , 94℃预变性 1 min , 94℃20 s ,66℃
30 s ,72℃90 s ,27个循环 ,72℃保温7min。
第二轮PCR ,将第一次PCR产物稀释15倍后 ,
取1 μL作为模板 ,利用引物 NP1 、NP2 进行第二次
即巢氏PCR扩增 ,反应体系基本同上 ,反应体积为
20 μL ,PCR条件为:94℃预变性 1 min ,94 ℃20 s ,
68℃30 s ,72 ℃90 s ,18个循环 ,72℃保温7 min。
1.4　cDNA消减文库的构建及克隆长度的鉴定
用DNA回收试剂盒纯化上述 PCR产物 ,然后
将其连接到 pGEM-T Vector System 载体中 ,4℃水浴
过夜 ,连接产物转化到 E.coli JM107 菌株中 ,在含
有X-gal 、IPTG和Amp 的 LB固体培养基上 37℃过
夜培养 ,然后根据蓝白斑检测文库克隆的重组率 。
随机挑取白色克隆 ,提取质粒 DNA后进行 PCR扩
增 ,通过琼脂糖凝胶电泳检测其插入片段长度 。
1.5　DNA测序与同源性比较
用96孔深孔板在 37℃、220 r/min的条件下过
图 2　第一次及第二次 PCR产物电泳图
泳道 1～ 4为第一次 PCR产物 , 5 , 6为第二次 PCR产物
泳道 M为分子量Marker DL2000
ig.2　The electrophoresis of the first and thesecond PCR products
　Lane1～ 4:The first PCR products;
Lane5 , 6:The second PCR products;M:DL2000 marker
夜培养重组菌落 ,采用标准碱裂解法提取质粒;然
后按 Amersham Biosciences 公司的 ET Terminator 方
法对测序质粒进行 PCR扩增;对 PCR产物进行纯
化后溶于10μL Loading Solution 中 。利用本实验室
MegaBACE1000测序仪对 DNA样品进行测序 ,选取
100 bp以上的序列向GenBank提交 ,并将所得序列
用 BLASTX对NCBI 的 Nr 蛋白质数据库进行同源
性检索。
2　结果与分析
2.1　RNA定性分析
0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 ,可见总 RNA为明
显的 28S和 18S条带 ,条带亮度比值约为 2:1 ,表明
所提取的 RNA 未出现降解 ,可以满足下一步实验
的要求(图1)。
2.2　两轮 PCR的结果分析
PCR扩增后电泳结果(图 2)显示 ,第一次 PCR
扩增后的电泳带很弱(泳道1 、2 、3 、4),第二次 PCR扩
增后可看到电泳带明显(泳道 5、7上样量为5μL ,
图 3　重组质粒的 PCR检测
泳道 1～ 4、5 , 6为重组质粒 ,泳道M 为分子量Marker DL2000
Fig.3　PCR examination of reconstructed plasmids
Lane1～ 4 , 5 , 6:The reconstructed plasmids;M:DL2000 marker
711期　　　　　　　　　　　　　刘桂丰等:干旱胁迫下刚毛柽柳消减文库的构建及分析
泳道 6 、8上样量为2 μL),片段大部分集中在0.2 kb
～ 1 kb之间。
2.3　SSH 文库的质量分析
蓝白斑检测显示文库的重组率为 95%,随机
选取 8个阳性克隆 ,提取质粒后进行 PCR检测 ,电
泳结果表明 8 个克隆中有一个无插入片段(泳道
4), 其它均有片段插入 , 片段长度在0.25 kb ～
0.6 kb间(图 3)。
2.4　cDNA测序与同源性分析结果
将所得 EST 序列进行 BLASTX同源检索 ,分析
结果如下表:
表 1　刚毛柽柳根部组织抗旱相关基因
Table 1　Drought stress-related genes of Tamarix hispida roots
登录号GenBank
Accession No.
BLASTX 比对结果
Result of BLASTX
来源物种
Organism
EST 数量
Number of ESTs
CN121136 Manganese superoxide dismutase Antrodia camphorat 8
CN121103 Ubiquitin conjugating enzyme Metarhizium anisopliae 2
CN121116 Similar to GABAB-related G-protein coupled receptor Gallus gallus 2
CN121135 Rron-sulfur cluster-binding protein , putative uncultured bacterium 463 2
CN121164 Phospholipase C-like protein Mus musculus 1
CN121095 Zinc finger protein Schizosaccharomyces pombe 1
CN121099 Probable sodium:sulfate symporter Pseudomonas aeruginosa PA01 1
CN121101 Putative alternative oxidase Dendrobium grex Madame Thong-In 1
CN121126 Unspecific monooxygenase Nicotiana tabacum 1
CN121161 Transcription factor PACC Gibberealla fujikuroi 1
CN121192 Transferrin-receptor2 Homo sapiens 1
CN121147 ABC-type sugar transport system , ATPase component Burkholderia fungorum 1
CN121127 Cytochrome P450 monooxygenase Zea mays 1
CN121199
Transcriptional factor B3 family protein / auxin-responsive
factor , putative (ARF1) Arabidopsis thaliana 1
CN121191 Ribosomal-protein-alanine acetyltransferase Mycobacterium tuberculosis CDC1551 1
CN121217 Myb-related protein 5 Oryza sativa 1
CN121219 Putative fructose-2 , 6-bisphosphatase Si lene latifolia 1
Tatol 27
3　讨论
在mRNA水平研究差异表达基因的实验中 ,关
键步骤之一是总 RNA 提取和 mRNA的分离 ,但是
从柽柳根部获得足够的 mRNA比较困难 。因此 ,先
用少量 RNA合成 cDNA ,然后对 cDNA进行 PCR扩
增 ,这样就可以用少量 RNA建立消减杂交文库 。
本实验获得 17种与抗旱相关的基因片段 ,它
们包括编码信号传递和转录调控蛋白的基因如锌
指蛋白(zinc finger protein)、myb 相关蛋白(myb-re-
lated protein);与细胞排毒及抗氧化防御相关的基
因如Mn-SOD(manganese superoxide dismutase)、泛肽
交联酶(ubiquitin conjugating enzyme);生长调节相关
基因如交替氧化酶(putative alternative oxidase)等 。
真核生物转录因子是近十几年来发现的一类
在真核基因转录时起调节作用的蛋白质 ,能参与基
因应答外界环境因素所诱导的转录[ 10] 。研究表
明 ,多种转录因子能接受胁迫信号 ,抑制或激活某
些基因的表达 ,而这些基因的产物能使植物免受胁
迫的伤害[ 11] ,例如锌指蛋白和 myb相关蛋白均受
干旱胁迫的诱导 ,并对抗旱基因的表达进行调控 。
其中 ,myb相关蛋白为依赖于 ABA 途径的重要抗
逆调控基因 ,它们能与植物的顺式作用元件结合并
启动耐旱靶基因的表达 。同时 ,myb蛋白在植物二
次代谢 、细胞的形态建成和细胞周期中起到调控作
用[ 12] 。
干旱条件使植物产生水胁迫 ,导致细胞内活性
氧类物质大量增加 ,对细胞膜和核酸造成伤害。因
此 ,通过抗氧化酶类的作用去除活性氧等有害物
质 ,增加膜结构的稳定性 ,是提高植物抗旱能力的
关键 。在整个氧化防御系统中 ,SOD是第一个参与
清除活性氧反应的酶类 ,是所有植物在氧化胁迫中
72 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25 卷
起重要作用的抗氧化酶 ,在抗氧化酶类中处于核心
地位。它能够催化两个超氧自由基发生歧化反应
形成 O2 和 H2O2 ,起到清除活性氧 ,阻抑膜脂过氧
化的作用[ 13] ,使细胞免受毒害[ 14] 。据报道 ,干旱
胁迫下 SOD的酶活性与植物抗氧化胁迫能力呈正
相关。本实验获得了多个Mn-SOD基因片段 ,说明
在干旱胁迫下 ,刚毛柽柳根部组织 Mn-SOD大量表
达 ,清除活性氧 。泛肽交联酶普遍存在于真核生物
体内 ,是降解蛋白质的主要酶类[ 15] 。在逆境胁迫
条件下 , 它可迅速降解那些无法修复的受损蛋
白[ 16] ,维持细胞正常的代谢循环 ,增强植物对逆境
的适应能力。
逆境胁迫使植物生长受抑 ,具有有效的生长调
节代谢系统则是植物提高抗逆能力的重要手段 。
交替氧化酶是植物抗氰呼吸的末端氧化酶 ,而抗氰
途径(或交替途径)是植物线粒体具有的一种电子
传递途径 ,它的运行能受各种环境胁迫(包括水分
胁迫 、盐胁迫 、低温 、病原菌侵染等)的诱导。研究
表明 ,交替氧化酶能和偶联蛋白(uncouping protein ,
UCP)协同作用以控制植物体内能量的平衡 ,同时
使植物在逆境条件下增加氧吸收和促进物质的合
成[ 17] ,从而增强植物的抗逆能力。
本实验利用抑制性消减杂交技术 ,研究了刚毛
柽柳根部耐旱基因的表达情况。实验结果充分说
明 ,在干旱胁迫下 ,刚毛柽柳根部组织通过信号传
导 、基因表达调控 、活性氧清除等途径增强抗旱能
力。本工作为进一步系统研究柽柳属植物抗旱分
子机理奠定了基础。
参　考　文　献
1.张道远 , 尹林克 ,潘伯荣.柽柳属植物抗旱性能研究极其
应用潜力评价.中国沙漠 , 2003 , 23(3):52 ～ 256
2.翟诗虹 , 王常贵 ,高信曾.柽柳属植物抱茎叶形态结构的
比较观察.植物学报 , 1983 , 25(6):519 ～ 525
3.王霞 , 侯平 ,尹林克 , 等.水分胁迫对柽柳组织含水量和
膜透性的影响.干旱区研究 , 1999 , 16(2):12 ～ 15
4.王霞 , 侯平 ,尹林克 , 等.水分胁迫对柽柳植物可溶性物
质的影响.干旱区研究 , 1999 , 16(2):6 ～ 11
5.王燕凌 , 刘君 , 郭永平.不同水分状况对胡杨 、柽柳组织
中几个与抗逆能力有关的生理指标的影响.新疆农业
大学学报 , 2003 , 26(3):47～ 50
6.Schram P , Shipman R, Stulz P , et al.cDNA subtraction library
construction using a magnet assisted subtraction technique
(MAST).Trends Genet , 1993 , 9(3):70 ～ 71
7.Diatchenko L , Lau Y F C , Campbll A P , et al.Suppression sub-
tractive hybridization:A method for generating differentially reg-
ulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.Proc Natl
Acad Sci USA , 1996 , 93:6025～ 6030
8.Siebert P D , Chenchik A , Kellogg D E , et al.An improved PCR
method for walking in uncloned genomic DNA.Nucleic Acids
Res , 1995 , 23(6):1087～ 1088
9.Diatchenko L , Lukyanov S , Lau Y F , et al.Suppression subtrac-
tive hybridization:a versatile method for identifying differentially
expressed genes.Methods Enzymol , 1999 , 303:349 ～ 380
10.李晶 , 朱延明 , 李杰.转录因子 DREB1A 基因的克隆与
植物表达载体的构建.植物研究 , 2004 , 24(2):211～ 214
11.Kazuo S , Kazuko Y S , Motoaki S.Regulatory network of gene
expression in the drought and cold stress responses.Curr Opin
Plant Biol , 2003 , 6:410 ～ 417
12.万小荣 , 李玲.植物的 MYB 蛋白.植物生理学通讯 ,
2002 , 38(2):165～ 170
13.Alscher R G , Donahue J L , Cramer C L.Reactive oxygen
species and antioxidant:relationship in green cells.Physiol
Plant , 1997 , 100:224～ 233
14.Ruth G A , Neval E , Lenwood S H.Role of surperoxide dismu-
tases(SODs)in controlling oxidative stress in plants.Journal of
Experimental Botany , 2002 , 53:1331 ～ 1341
15.Aaron C , Alan L S.The ubiquitin-proteasome pathway:the
complexity and myriad function of protein death.Proc Natl Acad
Sci USA , 1998 , 95:2727 ～ 2730
16.Feussner K , Feussner I , Leopold I.Isolation of a cDNA coding
for an ubiquitin-conjugating enzyme UBC1 of tomato-the first
stress-induced UBC of higher plants.FEBS Lett , 1997 , 409(2):
211 ～ 215
17.Parsonshl , Yip Y H , Vanl Erberghe G C.Increased respiratory
restriction during phosphate-limited growth in transgenic tobac-
co cells lacking alternative oxidase.Plant Physiol , 1999 , 121:
1309 ～ 1320
731期　　　　　　　　　　　　　刘桂丰等:干旱胁迫下刚毛柽柳消减文库的构建及分析