全 文 ：第 21 卷　第 2 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001年　4 月
Vol.21　No.2　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Apr., 　2001
用显微分离和超敏感银染电泳方法研究
百合减数第一分裂周期蛋白质变化
彭永康1　于　玲2　霍　昕3　于建春3　张自立3
(1.天津师范大学生物系 , 300074)(2.西北师范大学生物系 , 兰州市 730046)
(3.南开大学生物系 , 天津市 300071)
摘　要　利用“显微操作人工分离单细胞” 、“微量蛋白 SDS-PAGE”和“超敏感银染”技术对百合
花粉母细胞减数第一分裂周期蛋白质组成与变化作了比较研究 。100个百合减数分裂单细胞可
检测到 25条以上的蛋白质谱带。前期与中期蛋白质谱带数与谱型基本相似 , 并且未呈现明显变
化。后期和末期谱型相同 , 但与前期和中期相比出现明显变化 , 185KD谱带在后期和末期中出
现 ,28KD 、27KD 、26KD 、24KD 、23KD 、22KD 、18KD 、16KD 8 条谱带消失和 H4 变浅 , H3 完全消
失。可以认为 , 本工作建立的实验方法和所得初步结果对开展高等植物减数分裂周期调控生化
机理研究有一定参考价值 。
关键词　显微分离;超敏感银染;组蛋白;减数第一分裂;百合
STUDIES ON PROTEIN CHANGESOF POLLEN MONTHER
CELLS DURINGMEIOSIS BY MICRO-ISOLATION AND
ULTRASENSITIVE SILVER STAIN TECHNIQUES IN LILIUM DAVILL DUCH
PENG Yong-kang1　YU Ling2　HUO Xin3　YU Jian-chun3 ZHANG Zi-li3
(1.Depar tment o f Biology , TianJin Nomal University , 300074)
(2.Depar tment o f Biology , North West No rmal University , 730046)
(3.Depar tment o f Biology , NanKai University , TianJin , 300071)
Abstract　In this paper , the comparative analysis of pro tein composition and change in pollen mon-
ther cells have been studied during meiosis I cycle by using “Micro-Isolation” 、“Micro-Protein SDS
-PAGE”and “Ultrasensitive Silver Stain”techniques.The results indicated that more than 25 pro-
tein bands could be detected in 100 meio tic cells which w ere isolated by micromanipulation.Protein
composi tion has no t change at prophase I and metaphase I.But 8 bands w hich have molecular weight
28KD 、27KD 、26KD 、26KD 、24KD 、23KD 、22KD 、16KD 、, respectively , were disappeared and 185KD
protein band w as appeared at anaphase I and telophase I.
Experiment techniques were set up in this study are very useful for studying protein changes dur-
ing meiosis and experiment results w ere obtained in this study are also very valuable for study ing bio-
chemical mechanism of meio tic cycle and cycle regulation in higher plants.
Keywords　Micro-Isolation;Ultrasensitive Silver Stain;Histone .Meiosis I;Lilium davidi ll Duch
第一作者简介:彭永康(1950-),男 ,教授 ,博士 ,细胞与分子生物学。
国家教委跨世纪优秀人才基金(1996～ 1998)和天津市教委专项基金(98206C)资助项目
收稿日期:1998-6-14
真核细胞有丝分裂周期中 , 细胞不同状态之间的转
换主要受周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依赖性激酶
(CDK)两种蛋白家族的调控[ 1] , 对 Cyclin 和 CDK
的深入研究为细胞在有丝分裂周期染色质集缩 、染
色体组装机制的理解提供了基础资料。近 10年来 ,
对两类周期蛋白的研究取得了很大的进展[ 2～ 5] , 但
这些研究都是在细胞有丝分裂内进行的 , 并且大都
研究由间期向 M 期的转变[ 6 ～ 8] , 迄今为止 , 有关减
数分裂不同时期蛋白质组成及变化研究很少有人报
道 , 其原因可能生殖细胞不能象体细胞那样进行细
胞培养和减数分裂同步化诱导 , 因此不能得到大量
分裂一致的不同时期减数分裂细胞群。真核生物减
数分裂周期是否也有类似有丝分裂周期中专门控制
细胞不同分裂状态之间转换的特异蛋白 ?减数分裂
不同时期蛋白质的组成及呈现出什么样的变化 ?这
些变化与细胞周期又有什么样的关系 ?这些问题的
深入探讨对于了解减数分裂周期调控机理有重要意
义 , 为此 , 我们以百合为材料 , 通过”显微操作人工
分离单细胞” 、”微量蛋白 SDS-PAGE”和”超敏感
银染技术” , 对减数第一分裂周期(包括前期 I 、中期
I 、后期 I和末期 I)细胞内蛋白质的组成与变化做了
初步研究 , 以期为这方面的研究提供一种有用的方
法并积累一些基础性资料 。
　图 1 用于分离单细胞的自制显微操作器和分离用玻璃针
Fig1.The micromanipulator and glass micro-needle w hich
used for iso lating single cell
1　材料与方法
1.1　显微操作人工分离减数第一分裂不同时期单
细胞:以兰州百合(Lil ium dividil l Duch)新鲜花
药为材料 , 取新鲜花药 , 置干净载玻片上 , 刀片切
开花药 , 加 100μl无离子水冲洗花药 , 轻轻挤压花
药 , 使花粉囊从花药中挤出 , 吸去无离子水 , 再次
加 100μl无离子水冲洗 , 滤纸吸干 , 加 10μl无离子
水后用解剖针轻轻将花粉囊挑开 , 使花粉母细胞从
花粉囊中游离 , 用微量注射器吸取 2μl样品液置另
一干净载玻片上 , 盖片 , 轻压。将制好的不同减数
分裂期细胞玻片置液氮或冰盒内冰冻揭片 , 然后将
带有材料的盖片置自制的玻璃显微操作器(图 1)
上。显微操作器装置按 Edstrom[ 9]等介绍的方法设
计 , 材料面朝下 , 然后将显微操作器固定在显微镜
载物台上 , 将自制的玻璃针(直径约为 1μm)插入注
射针内 , 注射针插在注射器内 , 并固定在另一台显
微镜推进器上 , 轻轻调节推进器螺旋 , 人工小心分
离减数分裂不同时期各 100个细胞 。
1.2 　微量蛋白 SDS -PAGE 分析:主要参照
Laemmli[ 10]等介绍的方法 , 采用垂直板超薄凝胶电
泳 , 凝胶厚度 0.5mm 。将用人工方法分离的 100个
同一分裂期的细胞置分离缓冲液(1.5mmol/L Tris
-HCl 、80mmol/L KCl 、0mmol/L NaCl 、2mmol/L
EDTA 、0.5Mmmol/ L 精胺 、0.1%Triton -X100 、
15mmol/ L β-巯基乙醇 , pH7.5)中 , 加等体积蛋白
质样品变性缓冲液(3%SDS 、10%甘油 、5%β -巯基
乙醇 、60mmol/LTris-HCl 、0.05%溴酚兰 , pH6.
8)。在 100 ～ 120V下稳压电泳约 7.5h 。
1.3　超敏感银染:参照 Oakley[ 11]等的方法 ,
将电泳后凝胶分别用三氯乙酸固定 、戊二醛处理 ,
氨银染和甲醛-柠檬酸显色法进行 。
2　结果与讨论
2.1　百合减数分裂细胞的显微分离:用本文描述
的方法 , 我们能在较短的时间内
(30min)分离出 50个同一分裂期细胞 。图 2是
单细胞分离过程 , 2b 右边箭头所示为我们自制的
玻璃针 , 直径为 1μm 。我们的实验表明 , 用显微操
作人工分离方法可以分离出任一减数分裂期的细
胞。与常规的体细胞生化方法分离相比较 , 我们的
显微分离过程避免了有机与生化试剂的使用 , 因
此 ,避免和减少了细胞在分离过程中可能造成的蛋
白质的某些失活和量上的损失 , 因此 , 这一分离方
法使研究减数分裂不同时期细胞内蛋白质组成与动
态变化所得结果更为精确 。
2.2　百合花粉母细胞减数第一分裂周期细胞内蛋
白质组成与变化:百合花粉母细胞减数第一分裂周
期细胞内可以比较清楚观察到的蛋白质谱带数达
25条以上 ,并具有较广泛的分子量范围。
与标准蛋白相比较 , 其分子量约处于 10KD ～
200KD的范围。为了分析上的方便 , 我们将根据蛋
白质的分子量范围分成高分子量蛋白质(100KD以
上)、中分子量蛋白质(50KD ～ 100KD)和低分子量
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蛋白质(50KD以下)及组蛋白 4 种类型 。现将百合
花粉母细胞减数第一分裂各时期蛋白质的组成和变
化分述如下:
图 2.百合减数第一分裂前期细胞的显微分离
Fig 2.Micro -isola tion of meiosis prophase I cells of
L ilium div idill Duch.
a.分离前 , 示 5 个减数分裂前期 I 细胞;
a.Before isolating cells , showing 5cells at meiosis
prophase I
b.分离中 , 右边箭头示分离用玻璃针
b.In the iso lating cells , right arrow showed the glass
micro-needle.
c.分离后 , 示 4 个百合减数分裂前期 I 细胞 , 右边
箭头所示为以被分离的细胞位置
c.After isolating cells , showing 4 cells a t meiosis
prophase I , right arrow show ed the position w hich
was isolated cell
图 3.百合减数分裂周期蛋白质的 SDS-PAGE 比较
s.Standard pro tein a.Prophase I b.Metaphase I c.
Anaphase I
Fig.3.Pro teins comparison of meiosis cells in Lilium
dividill Duch by SDS-PAGE
前期 I:在高分子量蛋白质区内 ,有三条蛋白质
谱带可以隐约观察到 , 其分子量分别为 175KD 、
120KD 和 116KD;中分子量区分别为 75KD 、
65KD 、55KD 、50KD;低分子量区有较多的蛋白质
谱带存在 , 着色较为明显的有 43KD 、40KD 、35KD 、
33KD 、31KD 、28KD 、27KD 、26KD 、24KD 、 23KD 、
22KD 、18KD 、16KD 13条谱带。组蛋白区有 4条谱
带组成 , 其中 H3 着色很浅 , 而 H2a谱带在着色性和
宽度上均比较明显 , 含量丰富。
中期 I:与前期相比 , 中期蛋白质组成在谱型
和谱带数上基本无明显差异 , 但 35KD 、33KD 、
31KD和 28KD 4条谱带其着色性比前期有所加深。
后期与末期:后期和末期是花粉母细胞减数第
一分裂周期中蛋白质出现明显变化得时期 , 分别具
有蛋白质谱带数增加和缺失现象 , 两个时期所呈现
出的变化相同 , 如高分子量区出现一条新的 185KD
谱带 , 中分子量区谱带数基本稳定 , 但低分子量
区 , 多条谱带缺失 , 如 28KD 、27KD 、26KD 、24KD 、
23KD 、22KD 、18KD 、16KD 谱带含量明显减少 , 表
现为着色性变浅;组蛋白区 , H4 着色变浅 , 趋于消
失 , H 3明显消失;但含量丰富的 H2a依然显示出着
色深 、含量丰富等特性。图 3所示为上述研究结果 ,
其中 c代表后期和末期 , 因为这两个时期蛋白质谱
型和变化结果相同。
2.3　高等植物减数分裂周期蛋白质的组成与变化:
研究高等植物减数分裂周期蛋白质组成与变化对了
解减数分裂期间染色质集缩与去集缩 、前期 、中期染
色体结构维系 、核膜崩解与重建等周期现象有重要
意义 , 但这方面的研究由于取材难度大 , 除了对精
细胞 、生殖细胞[ 12～ 15]等的蛋白质组成有过研究以
外 , 对减数分裂周期蛋白质研究相对滞后 。本文建
立的“显微操作人工分离单细胞” 、“微量蛋白质电
泳”和“超敏感银染”技术为开展这方面的研究提供
了可能 。我们的实验结果表明 , 百合减数第一分裂
四个时期蛋白质呈现出较有规律的变化 , 这种变化
的一个明显特点是蛋白质谱带的减少 , 如减数分裂
中期进入后期至末期时低分子量区至少有 7条谱带
消失;组蛋白区 H4 变浅 , H3 完全消失。为了证实
这一结果的可靠性 , 我们又对所得结果进行了重
复 , 表明结果是可靠的 。组蛋白是核小体的组成成
分。组蛋白的磷酸化被认为与细胞分裂的启动 、染
色质集缩与凝集状态的维持有一定关系[ 16] 。减数
分裂期间经历核膜崩解与重建 、染色体数目减半 、染
色体缩短变粗 、胞质分裂等 , 这些在细胞减数分裂
周期发生的事件是否与本工作揭示的 8条在前期和
3152 期　　　　　　　　　　　　　　彭永康等:用显微分离和超敏感银染电泳方法研究百合减数第一分裂周期蛋白质变化
中期稳定出现的蛋白质在进入后期后消失 、组蛋白
H4 含量减少 、H3 消失现象有某种联系目前还不清
楚 , 但本工作所建立的实验方法及所得出的初步实
验结果对于开展高等植物减数分裂周期调控生物化
学机理研究可能是有价值的。
参　考　文　献
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