全 文 ：第 20 卷　第 2 期　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2000 年　4 月
Vol.20　No.2　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH April , 　2000
黑麦 1R染色体的显微分离 、体外扩增及扩增产物的鉴定①
魏继承②　石　锐　郭长虹　郭东林　马旭俊　王同昌③
(哈尔滨师范大学生物系　150080)
摘　要　借助 Leitz显微操作器 ,在国产倒置显微镜下(400×)用玻璃针对处于有丝
分裂中期的黑麦根尖细胞中的 1R染色体成功地进行了分离。分离出来的 1R染色
体转入 0.5 ml的 Eppendorf管中 ,用蛋白酶 K处理 ,把 DNA释放出来;经 Sau3A 酶
切 ,再与人工合成的 Sau3A 连接头连接;以连接头的一条链的核苷酸顺序片段为引
物对 DNA酶切片段进行了 PCR扩增 。琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物的长度大约
为300 ～ 1000 bp。以生物素分别标记的黑麦总体 DNA和小麦 rDNA为探针进行斑
点杂交 ,结果表明 PCR扩增产物确实来源于黑麦的 1R染色体 DNA 。这个方法为
构建黑麦 1R染色体亚基因组文库和筛选 1R染色体特异性探针奠定了基础 。
关键词　黑麦;1R染色体;显微分离;PCR扩增;rDNA探针
MICRODISSECTION AND AMPLIFICATION
IN VITRO OF CHROMOSOME 1R IN RYE
(Secale cereale L.)AND DETERMINATION
OF THE AMPLIFIED PRODUCTS
WEI Ji-cheng　SHI Rui　GUO Chang -hong
GUO Dong-lin　MA Xu-jun　WANG Tong-chang
(Harbin Normal Univ ersity , Harbin　150040)
Abstract　The chromosome 1R of rye w as microdissected and isolated under reverse-
microscope w ith a manipulator f rom the cells of root tip at mito tic metaphase.Single
chromosome 1R was then transferred into 0.5 m l centrifuge tube.After the t reatment
with Protease K , the DNA of chromosome 1R was digested w ith restriction enzyme
Sau3A , then the Sau3A linker -adaptor w as lig ated to the ends of the DNA frag-
ments , which w as subsequently amplified by means of linker -adapter polymerase
①②③ E-mail:tcw ang@263.net收稿日期:1998-9-21
现工作单位:黑龙江省烟草研究所 ,牡丹江市　157000)本工作受国家自然科学基金 、省基金及哈师大蔡火石青年科学基金的支持
chain reaction(LA-PCR)with one of chains of the linker-adapter as primer.By dot
blo tting with biotinlatyled rDNA of w heat and genome DNA of rye as probes , it w as
confi rmed that the amplified products by LA-PCR are derived from the DNA of chro-
mosome 1R in rye.This wo rk would facilitated to const ruct the sub-genomic DNA li-
brary of chromosome 1R and to screen the specific probes of chromosome 1R in rye.
Key words　rye;chromosome 1R;microdissection;LA-PCR;rDNA
八十年代初 ,由于细胞遗传学研究的飞速发展 ,高等植物一些物种与性状有关的基因已
被定位于染色体或染色体的特定区域 ,其中包括农作物的许多重要的抗病性基因 。随着分
子遗传学和基因操作技术的长足进步 ,分离与克隆这些基因已成为遗传学工作者的主要任
务。从植物的整个基因组入手 ,如筛选特定染色体的 DNA 文库 、用消减法克隆 DNA 、染色
体滑步或跳跃法分离基因等 ,因为技术程序相当冗长繁杂 ,难于广泛应用。而运用细胞遗传
学的显微操作技术从染色体标本上直接分离特定染色体甚至染色体特定片段 ,再通过分子
生物学方法将其 DNA 克隆 ,无疑是一条捷径 。在这一思路引导下 ,1981年德国“欧洲分子
生物学实验室”以果蝇为材料 ,首次切割多线染色体片段获得成功 ,从而建立了染色体显微
分离 、微切割与微克隆技术[ 1] 。这项技术后来被广泛应用于动物及人的基因组研究。但由
于植物细胞存在细胞壁 ,染色体制片较动物难度大 ,染色体显微切割和分离技术研究开展较
晚 ,目前主要在特定染色体或染色体臂分离水平上进行一些探索性工作[ 2～ 11] 。
本文以黑麦的 1R染色体为研究目标 ,利用显微操作将其分离出来 ,并利用 LA-PCR
技术对其 DNA进行扩增 ,旨在为本实验室即将开展的微克隆及染色体特异性探针池的构
建提供研究资料 。
1　材料和方法
1.1　实验材料
“胜利”黑麦种子为本实验室保存;小麦 rDNA为本系李瑞军教授惠赠 。
1.2　染色体标本制备
按常规的冷冻法准备黑麦的有丝分裂材料 ,以酒精/冰醋酸(3:1)固定 10分钟后 ,换
70%酒精于 4℃保存备用。制片时除去酒精 ,以酶缓冲液漂洗两遍 。在适量的酶液中 37℃
酶解 3小时 ,切取根尖分生组织 ,在 45%醋酸中压片 ,液氮冷冻揭盖片。将气干的载片于 0.
02%亚甲基蓝中染色 10分钟后重新气干备用 。
①2×酶液:
2 g 纤维素酶(Yakult Honsha),20 g 果胶酶(Serva),用 1×酶缓冲液 100 m l溶解 , -
20℃保存 ,用时再与等体积的 1×酶缓冲液混合成为工作液。
②10×酶缓冲液:
柠檬酸 40 mM ,柠檬酸钠 60 mM ,用时稀释 10倍 。
1.3　染色体的显微分离
在 Lei tz拉针仪辅助下把玻璃针拉成急尖 ,使尖端的直径在 1μm 左右 。玻璃针使用前
在254 nm 紫外光下处理 30 分钟。染色体显微分离是用 Leitz显微操作器在国产`梧光
XSB-1A型倒置显微镜下进行的:先在低倍物镜(10×)下将玻璃针移至视野中央 ,移动玻
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片 ,找到适于分离的中期分裂相 ,调至视野中央后换上高倍物镜(25×),降下玻璃针并对准
目标染色体 ,加一滴无菌水。以玻璃针轻轻触动染色体 ,待染色体整体即将从载片脱落出来
时 ,吸去无菌水 。把带有目标染色体的针尖移出并折断于盛有 20μl蛋白酶 K (5 ng/μl ,
Promega , 用 T4 连接酶缓冲液配制)的 Eppendo rf 管中。12 , 000 rpm 离心 15秒 , -20℃保
存备用。
1.4　Sau3A接头的制备
Sau3A接头是由 23个碱基和 19个碱基的两条寡核苷酸片段组成:
23-mer:5′GATCCTGAGCTCGAATTCCACCC3′
19-mer:5′GGGTCGAATTCGAGCTCAG3′
详细制备方法参见文献[ 8] 。
1.5　单染色体 DNA的释放及加接头
染色体脱蛋白:显微分离的单染色体在蛋白酶 K 溶液中 37℃消化 3小时 ,再于 70℃处
理 20分钟以灭活蛋白酶 K 。
酶切:加入 2μl限制酶 Sau3A [ 0.01 U/μl(Promega),用 T4 连接酶缓冲液配制] ,37℃
保温 4小时 ,70℃处理 20分钟 。
加接头:加入 2μl 的 Sau3A接头(5ng/μl)、0.5μl 的 T 4 DNA 连接酶(3U/μl , Promega),
16℃连接 16小时 ,70℃处理 20分钟。
1.6　PCR扩增:
反应体系:加接头后的单染色体 DNA片段溶液 24.5μl、10×Taq酶缓冲液 10.0μl 、25
mM MgCl2 6.0μl 、10 mM dN TP 2.0μl 、19-mer 引物 0.8μl 、Taq酶 1U (BioS tar),体积
100.0μl ,以 40μl石蜡油覆盖 ,离心后在 M J-150型热循环仪上进行扩增反应。反应程序
为95℃预变性 5分钟 ,35个循环中95℃变性15秒 ,64.5℃退火 45秒 ,72℃延伸 90秒 ,最后
延伸为 72℃5分钟。扩增步骤设立无染色体的阴性对照 ,同时还对分离出来的非 1R染色
体进行了扩增。
对扩增产物进行的二次扩增反应条件与第一次扩增相同。
1.7　斑点杂交检测
常规方法提取黑麦总体 DNA ,用光敏生物素法标记黑麦总体 DNA 和小麦 rDNA ,对已
得到的 1R及非 1R染色体的 DNA扩增产物进行二次扩增后 ,在硝酸纤维素滤膜上进行斑
点杂交 ,具体操作按光敏生物素试剂盒进行(原平皓公司)。
2　试验结果
2.1　染色体的显微分离
以玻璃针法分离染色体 ,成功地获取了若干条 1R染色体 ,以单染色体形式保存于 Ep-
pendo rf管中。作为对照 ,也分离了几条非 1R染色体。图版 1为挑取时操作状态的玻璃针
及载片 ,图版 2 ～ 4为挑取 1R染色体的全过程 。
2.2　染色体 DNA 的体外扩增
以不同梯度总体 DNA进行 LA-PCR模拟扩增表明可以对微量 DNA 进行有效的扩
增 ,图版 5中所示从左起第 4 、5和 6泳道分别为 0.2pg 、2pg 和 20pg 总 DNA 为模板的扩增
结果 。其中 0.2pg 的总 DNA 扩增效果比 2和 20pg 总 DNA 要好 。1R单染色体 DNA经第
1972 期　　　　　　魏继承等:黑麦 1R染色体的显微分离 、体外扩增及扩增产物的鉴定
一轮 LA-PCR扩增后 ,电泳检测显示出明显的连续扩增带型 ,如图版 5中所示的第 3 泳
道 ,DNA长度为 300-1000 bp ,另外设立了不加任何 DNA 的阴性对照 ,如图版 5-1所示第
2泳道 ,没有发现扩增产物。图版 6所示的扩增产物为单染色体二次增产物电泳 ,4 、5 、6泳
道为 1R染色体的扩增产物 ,6 ～ 13泳道为其它染色体扩增产物。从图可见不仅 1R染色体
与非 1R染色体扩增产物有差异 ,而且各条 1R染色体扩增结果也不一致。
2.3　斑点杂交检测
图版 7所示 ,以黑麦总体 DNA为探针 ,在右侧的 1R染色体二次扩增产物及左侧的非
1R染色体的扩增产物点样处都显示了杂交信号 ,信号在强度上比较接近 。图版 8是以小麦
rDNA为探针与 1R单染色体及非 1R染色体的二次扩增产物杂交情况 ,右侧 1R单染色体
的扩增产物显示了明显的杂交信号 ,而左侧的非 1R染色体的扩增产物没有信号 。
3　讨　论
有关植物染色体的显微分离的工作已经引起人们的注意 ,中科院遗传所[ 3 ,5 , 6] 、中国农
科院和南开大学[ 7 ,2]已经开展了这方面工作 ,虽然农科院已经利用激光切割方法进行染色
体分离 ,但国内已报导的工作主要还是借助显微操作仪的玻璃针法分离染色体 ,因为这种方
法简单有效 ,对设备的要求不太苛刻 ,工作相对容易开展。
对分离的染色体 DNA 扩增方法主要有三种:简并引物(随机)扩增法(degenerate
oligonucleotide primed PCR , DOP-PCR)[ 12 , 13] ,单一引物法[ 7]和载体介导法[ 14]或人工接头
法[ 15 , 16] ,其中效率最高和速度最快的是前两种方法 ,但也容易受 DNA污染物干扰。我们在
实验中也尝试了利用简并引物-6MW[ 17] ,由于在用基因组 DNA模拟的过程中始终没有排
除阴性对照中的扩增信号 ,所以最终选择了加接头 LA-PCR ,这是一个比较稳妥的扩增方
法。以不同梯度总体DNA进行 LA-PCR模拟的结果表明本实验所采用的反应体系对 0.2
pg级摸板的扩增效果最好 ,原因可能是反应体系中的内切酶 Sau3A 、T4 连接酶的量对这一
量级的 DNA 作用最为充分。正常黑麦单倍体核基因组 DNA 量为 9.5 pg ,即每条染色体
DNA平均大约为 1.35 pg ,说明 DNA在整个实验操作过程中的损失还是相当大的。
分离染色体的 DNA扩增产物的鉴定过程十分重要 。目前的工作多用原材料的基因组
DNA作探针进行 Southern杂交法鉴定 ,也有用原位杂交法鉴定的 。由于 Southern杂交只
能验证扩增产物与原基因组的同源性 ,不能进一步确定分离出的是那一条染色体 ,有很大局
限性 。而利用 FISH 等原位杂交手段可以在一定程度上确定扩增片段与目的染色体的同源
性 ,但操作复杂 ,且对复杂的植物基因组来说难度较大 。这是因为不同染色体间有相当数量
的高度同源性的重复顺序 ,影响鉴定的准确性。因此 ,在本实验中除以黑麦总体 DNA 作为
探针对分离的 1R染色体 DNA扩增产物进行分子杂交鉴定外 ,还利用了小麦的 rDNA作为
探针进行分子杂交验证。黑麦染色体组中 ,1R是唯一有 rDNA分布的染色体[ 8] ,而且 rD-
NA在各种麦类作物中具有极高的同源性 ,这样就可以进一步确认本实验所得的扩增片段
来源于黑麦的 1R染色体 。
黑麦是最早用于改良小麦的小麦近缘种 ,其 1R染色体具有重要抗性基因 ,如抗叶锈
病 、抗秆锈病 、抗白粉病 、抗小麦条纹花叶病毒基因等。过去我们实验室一直在利用附加及
易位方法进行 1R基因的转育工作 ,如果能得到这些基因的分子标记或克隆这些基因 ,将对
我们的工作有重大的促进作用 。虽然目前 1R染色体的 RFLP 连锁图谱已然建立[ 13] ,但只
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有 16个分子标记 ,其中 12个标记位点集中在着丝粒附近 ,并不能适应实际工作的要求。而
1R染色体的显微分离及其 DNA的扩增是单染色体亚基因组文库构建的前提 ,除对寻找 1R
的分子标记并建立高密度 RFLP 图谱有重要意义外 ,也为利用 FISH 等手段从原位杂交角
度分析黑麦 1R染色体的附加及易位工作奠定了基础。
图　　版　　说　　明
1.操作状态的玻璃针及载片;2 ～ 4、挑取 1R染色体的全过程;5.以不同梯度总体 DNA 进行 LA-PCR模
拟扩增效果;6.所示的扩增产物为单染色体二次扩增产物电泳;7.以黑麦总体 DNA 为探针与 1R 单染色
体及非 1R染色体的二次扩增产物杂交情况杂交结果;8.以小麦 rDNA探针与 1R 单染色体及非 1R染色
体的二次扩增产物杂交情况。
Explanation of the plates
1.Micro-operato r and slide.2～ 4.whole process of M icrodissection.5.Electrophoresis of LA-PCR products
w ith gradint to tal DNA as template.6.Electrophoresis of LA-PC R products of dissected chromosome DNA.7.
Hybridization with rye genome DNA probe.8.Hybridization with biotinlatyled rDNA
参　　考　　文　　献
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