全 文 ：第 25卷　第 2期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005年　4月
Vo .l 25　No. 2　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTAN ICAL RESEARCH April, 　2005
基金项目:宁夏教育厅资助项目(项目编号:JY2002110);宁夏大学科学研究基金项目(项目编号:NS0404)
第一作者简介:吴晓玲(1973— ),女 ,硕士 ,讲师 ,从事植物科学方面的研究和教学工作。
收稿日期:2004 - 11 - 09
植物生长调节剂对银柴胡细胞生长特性的影响
吴晓玲　谢亚军　巫鹏举　邓光存
(宁夏大学生命科学学院 , 银川　750021)
摘　要　利用细胞悬浮培养技术 ,研究不同激素对银柴胡细胞生长特性及过氧化氢酶和硝酸还原
酶活性的影响。结果表明 , 第 4种激素配比的培养液 M4 (MS +6-BA 1. 0 mg L- 1 +2, 4-D
1. 0mg L -1 +NAA 1. 0 mg L - 1)的细胞鲜重 、干重 ,细胞数目均明显高于其他处理;M 4处理可
有效增强银柴胡细胞硝酸还原酶的活性 ,提高氮素利用率;M2(MS +6-BA 1. 0mg L -1 +NAA
0. 5mg L -1)处理有利于增强银柴胡细胞过氧化氢酶活性。
关键词　银柴胡;植物生长调节剂;过氧化氢酶;硝酸还原酶
The effects of plant grow th regu lators on growth characteristics
of starwort root ce ll
WU X iao-Ling　X IE Ya-Jun　WU Peng-Ju　DENG Guang-Cun
(L ife Science Schoo l, Ningx ia Un ive rsity, Yinchuan　750021)
Abstract　The effects of p lant g row th regu lators on grow th characteristics and ac tiv ity o f catalase and ni-
tra te reduc tase o f starwo rt root cellw ere studied, the resu lts show tha t the numbers, the dry w eigh t and
fresh w e ight of ce ll unde r M4 treatmen t (6-BA 1. 0mg L - 1 +2, 4-D 1. 0mg L -1 + NAA
1. 0mg L -1)were the high tes.t The activity o f nitra te reductase and catalase w ere the h ighest under
M4 andM2 treatment(6-BA 1. 0mg L -1 +NAA 0. 5mg L -1) respective ly.
Key words　starw ort roo t;p lant grow th regulato r;cata lase;n itrate reductase
银柴胡 (S tellaria dichotoma L. var. lanceolata
Bge. ),又名披针叶繁缕 ,是石竹科繁缕属多年生
草本植物[ 1] 。其根经干燥后入药称 “银柴胡 ”,具
有清虚热 ,除疳热的作用;用于治疗肝肾阴虚 、骨蒸
潮热 、盗汗 、小儿疳积发热 ,饮食积滞或肠内虫积日
久 、损伤脾胃所致的疳积发热等症 ,主产于宁夏 、甘
肃 、内蒙等地 ,属宁夏 “地道药材 ”,近年来随着对
银柴胡开发的不断深入 ,国内外需求量猛增 ,使得
宁夏 、内蒙 、甘肃等省多处产区遭封禁或毁草开
田 [ 2] ,野生资源遭到严重破坏 ,人们无限挖掘 ,野
生银柴胡资源已濒临灭绝 ,故提高野生银柴胡产量
已迫在眉睫 。而解决资源短缺的问题并非一蹴而
就 ,如今 ,利用组织培养技术可以保护种质资源的
可持续发展 ,减少对诸多资源尤其是像银柴胡类似
的地道药材的过度开发和资源浪费 。
试验通过对银柴胡细胞培养不同植物生长调
节剂配比的选择 ,细胞增重 、增殖及对不同生长调
节剂配比培养基中酶活性的比较 ,着重研究不同生
长调节物质对两种酶—过氧化氢酶和硝酸还原酶
的影响 ,选择银柴胡组培的最佳培养方案 。同时银
柴胡的药用成分甾醇主要在根部 ,但其生长周期较
长 ,而利用细胞培养可有效提高其有效成分的合成
速率 ,缩短生产周期 ,为工厂化生产银柴胡细胞提
取有效成分 ,提供科学依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
银柴胡种子在实验室盆栽播种成苗一个月后 ,
以叶片为外植体接种到 MS培养基中 ,具体配方为
MS +6-BA(1. 0mg L - 1) +NAA(1. 0mg L -1)
+2, 4-D(1. 0mg L -1),于 25 ±1℃,黑暗条件诱
导出疏松的愈伤组织备用 。
1. 2　试验设计
采用四种激素配比的液体培养基对银柴胡进
行液体悬浮培养:
M 1:MS +6-BA (1. 0 mg L- 1 ) +2, 4-D
(0. 5mg L - 1);
M 2:MS + 6-BA ( 1. 0 mg L -1 ) + NAA
(0. 5mg L - 1);
M 3:MS+2, 4-D(0. 5 mg L- 1);
M 4:MS + 6-BA 1. 0 (mg L - 1 ) +NAA
(1. 0mg L - 1)+2, 4-D(1. 0mg L -1)。
培养基为 MS培养基 , 蔗糖 30 g L - 1 , pH =
5. 8,各处理采用相同 50 mL三角瓶加入液体培养
基 25mL;培养条件 25±1℃, 140 r /m in振荡培养 。
1. 3　试验方法
在无菌条件下 ,精确称取色泽鲜嫩 、疏松易碎
的银柴胡愈伤组织 1. 000 ±0. 001 g分别接种于相
应编号的三角瓶中 ,每种处理重复 3瓶。
1. 4　数据统计与处理
1. 4. 1　细胞鲜重与干重测定
各处理每 3 d各取 3份 ,之前先称量干纱布重
量并记录 ,后用已知重量的纱布滤去水分 ,并用滤
纸将纱布残余水分吸数次 ,再称其重量并记录 ,减
去纱布重量即为细胞鲜重 ,然后将盛有愈伤组织的
纱布置于80℃烘干至恒重称其重量为干重 。
1. 4. 2　细胞计数
各处理每 3 d于无菌条件下用血球计数板 ,采
用显微镜直接计数法[ 3] ,测定其细胞数 ,须确保愈
伤组织不会被污染。细胞计数为 1mL培养基中的
总细胞数 ,式为:
培养基中的总细胞数 /mL =A
5
×25×104 ×B
A:细胞计数板五个中方格中的总细胞数;
B:培养液稀释倍数。
1. 4. 3　过氧化氢酶活性测定
各处理细胞培养 15 d后 ,将细胞培养液用纱
布滤去水分 ,后用滤纸吸干数次 ,称鲜重 0. 1 g,采
用高锰酸钾滴定法 [ 4, 5]测定细胞过氧化氢酶活性 。
酶活性以每克组织鲜重分解的 H 2O 2的毫克数表
示即:
酶活(酶分解的 H2O2mg g- 1鲜重)
　　=
(A -B)Vt
V1
W
×1. 7
式中:A:对照 KMnO 4滴定量(mL);B:酶反应
后 KMnO 4滴定量 (mL);Vt:酶液总量(mL);V1:反
应所用酶液量(mL);W:样品鲜重 (mL);1. 7:1mL
0. 1mo l L -1的 KMnO4相当于1. 7mg H2O 2。
1. 4. 4　硝酸还原酶活性测定
将振荡培养的细胞培养液用纱布滤去水分 ,后
用滤纸吸干数次 , 称鲜重 0. 2 g, 采用分光光度
法[ 4, 5]测定细胞硝酸还原酶活力 。酶活性以每小
时每克组织鲜重形成的亚硝态氮的微克数表示即
酶活性 (μg g- 1 h-1)
　　=
查标值(μg)
取样量(mg)×反应液总量 (mg)
样品重 (g)×时间 (h)
式中查标值为查标准对应的亚硝态氮含量 ,通
过绘制标准曲线 ,得回归方程为 y =0. 009 9 +
0. 315x (r=0. 999 419)。
图 1　不同培养基处理对细胞鲜重的影响
F ig. 1　The e ffec ts of differen tm edium s on ce ll fre sh w eight
2　结果与分析
2. 1　不同培养基处理的细胞鲜重与干重比较
由图 1, 2可以看出 ,银柴胡悬浮培养细胞的鲜
重和干重增量在 12 d达到最高值 ,其中 , M4处理
对银柴胡细胞鲜重的增加高于其他三种处理 ,可达
2. 847 g;M 3处理最低 。说明在 M4处理中 ,浓度为
0. 1mg L - 1的 6-BA , 2, 4-D和 NAA能够有效促进
细胞伸长 、分裂和体积扩大 ,进而使细胞质的产生
量增加 ,从而促进细胞增重;M3处理中 ,只含有生
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长素 2, 4-D ,无细胞分裂素 6-BA ,由于生长素单独
使用时只具有诱导细胞分裂的作用 ,无 6-BA就无
法刺激细胞分裂 ,因此 ,M 3处理对银柴胡悬浮细胞
增 重 效 果 最 差;此 外 , M 1 和 M 2 均 含 有
1. 0mg L -1 6-BA ,两者对细胞增重影响不大 ,且
均高于 M 3处理 ,说明细胞分裂素 6-BA与 2, 4-D
或 NAA的配比也能较好的增加银柴胡细胞鲜重与
干重。
2. 2　不同培养基处理细胞数目变化
由图 3可知 ,各处理银柴胡细胞均有不同程度
增殖 ,在培养第 12 d时 ,其细胞数出现一个峰值 ,
之后趋于下降。其中 M 4处理在各个时期均高于
其他 处 理 , 这 说 明 M 4 处 理 中 , 浓 度 均 为
1. 0mg L -1生长素 2, 4-D , NAA有效诱导细胞伸
长 , 1. 0mg L -1细胞分裂素 6-BA有效促进银柴
胡细胞分裂 ,使得细胞增殖很快;第 12 d后各处理
的细胞数均趋于下降 ,说明在银柴胡细胞悬浮培养
12 d后 ,各处理中营养成分不平衡 ,已不能满足细
胞增殖需要 ,须重新转接 ,补充新鲜培养液 。
图 2　不同培养基处理干重变化曲线
F ig. 2　The curve of ce ll dry w eight of diffe rentm edium s
图 4　不同培养基处理对过氧化氢酶活性的影响
F ig. 4　The effec ts of different trea tm en ts on activ ity of ca ta lase
2. 3　不同培养基处理酶活性对比
2. 3. 1　不同培养基处理对过氧化氢酶活性的影响
过氧化氢酶活性与愈伤组织抗衰老有直接关
系 ,消除植物体内代谢产物过氧化氢积累导致的氧
化性破坏。在植物细胞 ,包括愈伤组织细胞代谢过
程中 ,由于代谢产物中含有 H 2O 2 ,而且由于 H2O2
的大量积累会对细胞产生破坏作用 ,进而影响细胞
生长 。过氧化氢酶是广泛存在于动植物体内 ,含血
红素辅基的氧化还原酶 ,可催化共体脱氢 ,同时催
化脱下的氢使 H2O 2还原为 H2O。由图 4可知 ,四
种处理中 M 2处理其过氧化氢酶活性最高 ,清除氧
自由基的能力较强;而含有 2, 4-D的其他三种处理
中过氧化氢酶活性较低 ,可能是由于 2, 4-D加速了
细胞的程序化死亡 ,使细胞早衰 ,产生较多的活性
氧所致。
2. 3. 2　不同培养基处理对硝酸还原酶活性的影响
植物体生长需要氮 ,而硝酸盐是基质或土壤中
氮的主要存在形式。在植物体内 ,氮以铵离子的状
态合成氨基酸 ,进而合成蛋白质和其他含氮化合
图 3　不同培养基处理细胞数目变化曲线
F ig. 3　The curve o f cell numbers o f diffe rent medium
图 5　不同培养基处理硝酸还原酶活性的影响
F ig. 5　The effec ts o f d iffe rent trea tm en ts on
the activ ity o f nitra te reduc tase
1752期 吴晓玲等:植物生长调节剂对银柴胡细胞生长特性的影响
物 ,硝酸还原酶在将硝酸盐转化为铵离子的过程中
起着重要作用[ 6] ,而硝酸还原酶是氮素同化中的
关键酶 ,它对植物的光合作用 、能量代谢均有重要
影响 ,因此 ,硝酸还原酶是作物营养和选种的双指
标 。如图 5所示 ,M4处理中 ,银柴胡细胞硝酸还原
酶活性最强;M1处理其酶活性居中;M 2处理对银
柴胡悬浮细胞硝酸还原酶活性影响最小。因此 ,提
高银柴胡细胞对氮的利用率需以 6-BA , 2, 4-D,
NAA三种激素配比使用较好。
3　讨论
由于组织培养可以研究外植体在不受植物体
其他部分干扰下的生长和分化规律 ,而其中的细胞
培养与固体培养相比 ,细胞培养具有培养材料处理
方便 、容易破碎细胞进行物质提取的优势 。尽管植
物体自身能够生成激素 ,但组织培养由于是取植物
体的某一组织或器官 ,因此需添加人工合成的类似
激素的物质 ,即植物生长调节剂 ,以供给植物生长
需要。在组织培养中 ,生长素能够诱导细胞分裂 ,
促进细胞伸长 ,一般生长素在低浓度时可促进生
长 ,浓度较高则会抑制生长 ,高浓度甚至会使植物
受伤。细胞分裂素主要作用是促进细胞分裂 ,有试
验证实 ,胡萝卜根的韧皮部薄壁细胞放在含有全部
营养物质 、维生素以及其他植物生长物质而没有细
胞分裂素的培养基中 , 细胞很少分裂 , 生长极
少 [ 7] ,此外 ,它还可以使细胞体积加大 ,但细胞分
裂素和生长素不同的是 ,细胞分裂素主要使细胞扩
大 ,这是由于细胞分裂素能增加细胞壁的可塑性 ,
细胞壁松弛 ,使得细胞吸水扩大 [ 8] 。银柴胡细胞
培养中的过氧化氢酶和硝酸还原酶的活性受许多
因素的影响 ,这里主要以尽量减小其他影响因素或
使其处于相同条件下进行研究 ,由于酶活性是以一
定时间内 , 1 mL酶分解底物的量衡量 ,故细胞的增
重与增殖不一定与酶活成正比 ,培养的银柴胡细
胞 ,M 4培养基中植物生长调节剂的配比对细胞增
重 、增殖作用较强 ,但其过氧化氢酶活性较弱 ,可能
是由于生长素对随后的细胞生长产生抑制作用 ,进
而导致细胞程序化死亡;而 M2培养基中的植物生
长调节剂的配比对银柴胡细胞过氧化氢酶活性具
有促进作用 ,能够提高细胞清除氧自由基的能力。
4　结论
(1)在银柴胡细胞培养中 ,M 4(MS +6-BA1. 0
+2, 4-D1. 0+NAA1. 0)处理在各个时期其细胞干
重和鲜重明显高于其他处理;同时硝酸还原酶活性
也高于其他处理 ,有利于细胞对氮的利用;
(2)各处理的细胞数目均呈现上升至下降的
趋势 ,且在细胞悬浮培养第 12 d时达到峰值 , 12 d
以后趋于下降 ,因此在细胞培养接种 12 d后就应
对银柴胡细胞进行继代培养;
(3)M2(MS +6-BA1. 0 +NAA0. 5)处理其过
氧化氢酶活性高于其他处理 ,可有效清除活性氧 。
这是由于 2, 4-D对银柴胡细胞过氧化氢酶活性具
有抑制作用 。
参　考　文　献
1. 王寿希 , 王晓燕 , 左桂芬. 银柴胡的引种栽培. 特种经济
动植物 , 2002, 1:32
2. 杨小军 , 丁永辉.银柴胡资源及其可持续利用的研究. 中
药材 , 2004, 1, 27(1):7 ～ 8
3. 沈萍 , 范秀容 ,李广武.微生物学实验(第 3版).北京:高
等教育出版社 , 2000. 90 ～ 92
4. 李合生. 植物生理生化实验原理和技术.北京:高等教育
出版社 , 2000. 45 ～ 47
5. 邹琦. 植物生理生化实验指导. 北京:中国农业出版社 ,
1995. 27 ～ 29
6. 张慧茹 , 郑蕊 ,杨晓琴.宁夏区内抗旱牧草硝酸还原酶活
力的比较研究. 宁夏大学学报 (自然科学版), 2002, 23
(3):278 ～ 280
7. 曹孜义 , 刘国民. 实用植物组织培养技术教程. 兰州:甘
肃科学技术出版社 , 1996. 52 ～ 54
8. 周云龙. 植物生物学. 北京:高等教育出版社 , 1999. 273
～ 274
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