全 文 ：第 22卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002 年　7月
Vol.22　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2002
三倍体毛白杨组织脱分化培养与植株体再生
李　毅1　何明珠1　马海芸2
(1.甘肃农业大学林学院 , 兰州　730007)
(2.榆中县林业技术中心 , 兰州　730010)
摘　要　采用毛白杨三倍体幼叶作为外植体进行组织培养 ,以 MS 为基本培养基获得了再生植
株。从NAA和 IAA与 6-BA 间进行的 18 个正交试验中 ,选择出适宜脱分化培养基 MS +6-BA
0.5mg L+NAA0.1mg L , 对三倍体毛白杨愈伤组织诱导率为 87.6%。5种生长素与 6-BA 配比的
再分化培养基中 ,1 2MS +IAA0.1mg L+6-BA0.1mg L对不定芽的分化诱导率可达到68.5%;MS+
6-BA0.5mg L+NAA0.01mg L的培养基可使单芽直接增殖出 7.4个芽。在MS+ IBA 1.0mg L的生
根培养基上 ,试管苗的生根率可达 85.7%。
关键词　毛白杨;三倍体;愈伤组织;分化;生根
INDUCTION ,DIFFERENTIATION AND PLANT REGENERATION OF
TRIPLOID CALLI OF POPULUS TOMENTOSA
LI Yi
1　HE Ming-zhu1　MA Hai-yun2
(1.Forestry College , Gansu Agricultural University , Lanzhou 730007)
(2.Yuzhong Forestry Technology centre , Lanzhou 730010)
Abstract　Regenerating plants were produced from immature leaves of the triploid of Populus tomentosa by
tissue culture on MS basic medium with different plant hormone.The result showed that callus induction fre-
quency reached to 87.6 percent on MS+6-BA 0.5mg L+NAA0.1mg L;differentiation frequency reached
to 68.5 percent on 1 2MS + IAA0.1mg L +6-BA0.1.It can be generated from one to 7.4 axillary shoots
on MS+6-BA0.5mg L+NAA0.01mg L.Rooting frequency of the shoots got to 85.7 percent onMS+IBA
1.0mg L
Key words　Populus tomentosa;triploid;callus;differentiation;regeneration
　　毛白杨(Populus tomentosa)三倍体是北京林业大
学采用毛新杨与染色体加倍的毛白杨花粉回交所育
成 , 具有生长速度快 ,轮伐期短 ,蓄积量大和抗叶锈
病 、褐斑病强等优良性状[ 1] 。该品种可采用嫁接 、根
繁 、扦插等繁殖方法进行育苗 ,但这些方法普遍存在
繁殖速度慢 ,成活率低的缺点 。利用组织培养可以
加快苗木的繁殖速度 ,短期获得大量苗木。本文对
毛白杨三倍体愈伤组织的诱导与分化 、腋芽增殖 、生
根培养等方面进行了细致研究 ,探索并取得了主要
技术参数 。
1　材料与方法
1.1　外植体获取与愈伤组织诱导
1999年 12月自甘肃农业大学林学院苗圃内剪
本研究为国家科技攻关(2001BA901A39)和甘肃省教委资助(9780570)项目。
第一作者简介:李毅(1963-),男 ,副教授 ,主要从事林木遗传育种研究。
收稿日期:2001-03-06
取三倍体毛白杨 B301 、B304两个无性系一年生带芽
茎段 ,每段保留 2个侧芽 ,用洗衣粉液漂洗后 ,再用
75%酒精浸泡 10秒 、0.1%升汞溶液浸泡 10分钟 ,
无菌蒸馏水冲洗 3 ～ 4次 ,置于无激素 MS培养基培
养。8天后 ,叶片展开 ,将其切成0.5 cm×0.5 cm大
小 ,接种到激素配比不同的 MS 脱分化培养基中诱
导愈伤组织。NAA 和 IAA 浓度各设置 0.1 、0.5 、
1.0mg L三个水平 ,6-BA设置 0.05 、0.1 、0.5 mg L 三
个水平 ,进行正交试验 。蔗糖浓度 20g L ,琼脂浓度
为0.4%,培养室温度 25±2℃,日光照 14小时 ,光
强1 500 ～ 2 000 lx 。
1.2　愈伤组织再分化培养与单芽快速繁殖
以MS 为基本培养基 ,附加不同种类生长素及
其与 6-BA 配比:NAA 0.5mg L 6-BA0.1mg L ,NAA
0.1 mg L 6-BA 0.1mg L , IAA 0.5 mg L 6-BA
0.1mg L , IAA 0.1mg L 6-BA 0.1mg L和 1 2MS+IAA
0.1mg L 6-BA 0.1mg L ,接种三倍体毛白杨愈伤组
织 ,分化产生丛生苗 。
以带芽茎段为材料 ,进行腋芽直接快速增殖方
法试验 。设置 MS +6-BA 0.1 mg L ,MS +6-BA0.5
mg L , MS+6-BA0.1 mg L+NAA0.01 mg L ,MS+6-
BA0.5mg L +NAA0.01 mg L等四种激素配比培养
基。
上述培养中 ,每处理 3次重复 ,蔗糖 、琼脂浓度
与培养条件同 1.1。
1.3　根分化培养
以生长 20 ～ 30天的三倍体毛白杨试管苗为继
代材料 ,剪取带一个叶片 、长度 3 ～ 4cm 茎段 ,转接到
生根培养基中 。IBA和 NAA两种生长素各设置 0.5
、1.0和 1.5mg L 三水平 ,进行生根对比试验。每处
理 3次重复 ,蔗糖 、琼脂浓度与培养条件同1.1。
2　结果与分析
2.1　愈伤组织的诱导
外源激素 6-BA与生长素配比对三倍体毛白杨
愈伤组织诱导率有较大的影响(表 1 、表 2)。生长素
种类及其与 6-BA搭配浓度对愈伤组织的产生很关
键 ,NAA 的诱导效果比 IAA 的好 ,愈伤组织诱导率
高 ,且小团块愈伤组织(直径 2mm)少:0.5mg L 6-BA
与NAA各种配比的诱导率在 69.2%～ 87.6%之间 ,
其中 ,以 0.5 mg L 6-BA 0.1 mg L NAA 最高 , 为
87.6%;同时 ,愈伤组织生长迅速 ,大团块愈伤组织
(直径>2mm)居多 ,占到了总诱导愈伤组织的 68.
4%。虽然 0.1mg L 6-BA 0.5 mg L IAA 配比的愈伤
组织诱导率达到了 81.9%,但其直径 2mm 的团块却
占 55.7%。
表 1　6-BA NAA 对三倍体毛白杨愈伤组织诱导率的影响
Table 1　Influence of different combination of 6-BA and NAA on callus induction
6-BA NAA
(mg L)
0.05 0.1 0.5
0.1 0.5 1 0.1 0.5 1 0.1 0.5 1
诱导率( x±SD) 46.2 43.1 39.3 58.3 65.6 61.3 87.6 71.4 69.2
D >2mm 34.4 34.6 28.8 49.5 54.4 64.3 73.8 69.9 61.5
D≤2mm 65.6 65.4 71.2 50.5 45.6 35.7 26.2 30.1 38.5
表 2　6-BA IAA对三倍体毛白杨愈伤组织诱导率的影响
Table 2　Influence of different combination of 6-BA and IAA on callus induction
6-BA NAA
(mg L)
0.05 0.1 0.5
0.1 0.5 1 0.1 0.5 1 0.1 0.5 1
诱导率( x±SD) 50.6 55.3 46.3 58.7 81.9 70.1 69.3 58.7 49.2
D >2mm 27.7 30.5 38.3 54.8 44.3 39.4 60.7 51.0 65.6
D≤2mm 72.3 69.5 61.7 45.2 55.7 60.6 39.3 49.0 34.4
2.2　愈伤组织再分化和不定芽形成
将长势良好的愈伤组织转入低细胞分裂素培养
基中 ,进行不定芽分化培养 。5 种处理中 , IAA 6-BA
配比的诱导效果要好于NAA 6-BA ,且诱导率和诱导
丛生芽产生的时间有随生长素浓度下降而降低的趋
势。对于含有NAA的培养基 ,培养的愈伤组织直接
诱导出不定根 ,而芽诱导率很低 ,组织较容易褐变;
IAA可提高丛生芽的诱导 ,但不定芽有玻璃化现象 。
2893期　　　　　　　　　　　　李　毅等:三倍体毛白杨组织脱分化培养与植株体再生
大量元素减半的 MS 培养基可有效地降低玻璃化试
管苗的形成。因此 , 1 2MS+IAA0.1mg L+6-BA0.1
mg L是较适宜的三倍体毛白杨愈伤组织再分化和不
定芽形成的诱导培养基。
表 3　不同培养基对三倍体毛白杨不定芽分化诱导影响
Table 3　Influence of different medium on differentiation induction
培养基
Medium
诱导时间(d)
Induction time
诱导率(%)
Frequency of callus formation
愈伤组织状况
Callus state
MS+NAA0.5 +6-BA0.1 26.9 11.6 愈伤组织增长快 ,产生大量不定根 ,组织易褐变
MS+NAA0.1 +6-BA0.1 26.7 30.4 生长缓慢 ,有不定根产生 ,易褐变
MS+IAA0.5 +6-BA0.1 25.3 26.7 生长较快,不定芽有玻璃化现象
MS+IAA0.1 +6-BA0.1 20.4 63.1 生长良好,不定芽有玻璃化现象
1 2MS+IAA0.1+ 6-BA0.1 19.2 68.5 生长良好 ,产生的不定芽长 2～ 3cm ,有褐变现象
2.3　腋芽试管快速增殖
从带芽茎段上剪取无菌腋芽 ,经过 30天培养 ,
其增殖结果因激素配比不同而异。细胞分裂素与生
长素搭配对腋芽增殖效果高于其单独使用 ,不含生
长素的培养基中 ,腋芽增殖少 ,且生长缓慢;较高的
6-BA浓度可有效提高腋芽增殖数 ,见表 4。
2.4　生根诱导
诱导生根是木本植物组织培养繁殖的关键环节
之一。在六种培养基中 ,以 IBA 对三倍体毛白杨试
管苗生根诱导效果较好(表 5)。虽然 MS +NAA
1.5mg L和MS+IBA 1.5mg L 培养基诱导生根率都
较高 ,但由于剂量太大 ,小苗基部形成了大量愈伤组
织 ,造成试管苗生长缓慢并影响其日后的移栽成活
率。从试管苗根发生的数量与根形成的质量综合考
虑 ,MS+IBA1.0mg L培养基应为适宜生根培养基。
表 4　不同激素配比对三倍体毛白杨腋芽增殖的影响
Table 4　Influence of different combination of 6-BA
and NAA on axillary shoots induction
培养基
Medium
腋芽增殖数目(个)
Axi llary shoots(single)
生长与发育
Developing state
MS+6-BA0.1 3.2 生长缓慢,分化率低
MS+6-BA0.5 3.7 腋芽生长缓慢 ,分化率低
MS+6-BA0.1+NAA0.01 5.1 生长良好,无丛生芽
MS+6-BA0.5 +NAA0.01 7.4 生长良好,无丛生芽
表 5　不同激素对三倍体毛白杨试管苗生根的影响
Table 5　Influence of different combination of NAA and IBA on rooting
培养基
Medium
生根率(%)
Rooting frequency
生根数目(条)
Number of roots(single)
根形态
Roots form
MS+NAA0.5 51.2 1.6 根粗而长 ,无毛根 ,基部无愈伤组织
MS+NAA1.0 75.5 2.8 毛根较少 ,基部无愈伤组织
MS+NAA1.5 84.9 5.7 根细而短 ,基部产生大量愈伤组织
MS+IBA 0.5 63.1 2.5 根较粗,毛根较少 ,基部无愈伤组织
MS+IBA 1.0 85.7 3.6 根发育好 ,毛根多 ,基部无愈伤组织
MS+IBA 1.5 87.6 5.2 根细而短 ,基部产生大量愈伤组织
3　结论
3.1　激素配比与愈伤组织的诱导
杨树组织培养研究表明 ,植物生长调节剂中的
细胞分裂素与生长素是诱导外植体脱分化的主要因
素 ,其种类和浓度的配比对愈伤组织的诱导关系重
大[ 3, 4] 。本试验进行的 6-BA 与 NAA 、 IAA配比研究
表明 ,0.5 mg L 6-BA与 0.1mg L NAA激素配比对三
倍体毛白杨愈伤组织诱导率最高为87.6%。
3.2　愈伤组织再分化成苗与腋芽直接增殖
不同种类的植物生长素及其与细胞分裂素的配
比在愈伤组织再分化和胚状体发生中作用不同[ 2, 4] 。
290 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　22 卷
本试验中 IAA的诱导作用要高于NAA的作用 ,以 1
2MS +IAA0.1mg L +6-BA0.1mg L培养基对不定芽
的分化诱导最佳 。
一般认为 ,由愈伤组织培养作为商品化苗木生
产或保持原亲本特性比器官培养明显的困难在于:
(1)激活的外植体经愈伤组织分化不定芽和根需较
长时间;(2)愈伤组织长时间培养过程中 ,幼芽分化
遗传畸变及生根响应中的变异性导致随后的生长响
应或形态学上的优良性状变异[ 7 ,8] 。为此 ,本试验还
进行了腋芽直接增殖的培养研究 ,筛选出适宜的培
养基MS+6-BA0.5mg L+NAA0.01mg L。
3.3　试管苗的根形成
植物激素中 , 生长素对其根形成具有重要作
用[ 2] 。在一定范围内 ,试管苗生根率与生长素在培
养基中的含量成正比 ,但过量时 ,则会出现愈伤组织
团块的大量形成而输导组织不畅 ,影响苗木的生长
和移栽的成活率 。因此 ,选择MS+IBA1.0mg L培养
基为毛白杨三倍体适宜生根培养基 。
3.4　愈伤组织继代培养中材料褐化与试管苗玻璃
化问题
愈伤组织继代中的褐化与试管苗玻璃化问题 ,
始终是困扰林木组培的难题[ 2 ,6 , 12] 。培养的材料 ,培
养条件 ,如湿度 、光照 、无机盐成分 、蔗糖浓度等均会
影响到褐化[ 8, 9] 。本试验中发现 ,诱导不定芽的过程
中 ,愈伤组织在 50 ～ 60天开始出现褐化现象 ,对于
不定芽的诱导产生抑制作用。有关有效延长愈伤组
织继代周期的方法 ,作者另有专门论述。有关玻璃
化产生的原因也较多 , 其克服方法也有专门论
述[ 12] ,本研究中通过降低培养基中营养元素的含
量 ,有效地降低了玻璃试管苗的发生率。
参　考　文　献
1.朱之悌 ,林惠斌 , 康向阳.毛白杨异源三倍体 B301 等无性
系选育的研究.林业科学 , 1995 , 31(6), 499～ 505
2.陈正华.木本植物组织培养及其应用.北京:高等教育出
版社 , 1986
3.林静芳 ,董茂山 , 黄钦才.响叶杨和大齿杨的组织培养.植
物生理学通讯 , 1983 ,(2):37
4.张立功 ,张永华 , 王凤勤 ,等.杨树体细胞胚状体的诱导发
生.林业科学 , 1981 , 17(4):426～ 427
5.袁巧平 ,董茂山 , 黄钦才 ,等.毛白杨无性系组胚芽分化效
应与离体选育研究.林业科学研究 , 1900 , 3 (6)608～ 612
6.钟士传 ,黄帮华 , 孙会兵 ,等.控制毛白杨新无性系试管苗
玻璃化的研究.山东林业科技 , 2000 ,(2):17～ 19
7.袁巧平 ,林静芳 , 董茂山 , 等.培养基 pH 值与白杨派树种
不定芽分化关系研究.中国林科院林研所 , 1980
8.Andrew J , Schmidt , James M Lee.Media and environmental ef-
fects on phonolics production from tobacco cell culture.Bio-
techem and Bioengineering , 1989 , 33:1 437～ 1 444
9.S R Bhat , K P S Chandel.A novel technique to overcome brown-
ing in tissue culture.Plant Cell Reports , 1991 , 10:358～ 361
10.李毅 ,邸利 , 洪涛 ,等.箭胡毛杨愈伤组织诱导 、保存与再
分化.西北植物学报 , 2002.3
11.郝贵霞 ,朱祯 , 朱之悌.毛白杨叶片组培再生芽玻璃化问
题的探讨.北京林业大学学报 , 1999 , 21(1)68～ 71
2913期　　　　　　　　　　　　李　毅等:三倍体毛白杨组织脱分化培养与植株体再生