全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTAN ICAL RESEARCH
第 17卷　第 4期 1997年　 10月
Vol. 17　 No. 4 Oct. , 　 1997
发根土壤杆菌 Ri质粒对黄瓜进行遗传转化的研究
刘伟华 1　姜　静 1　石　锐 1　任如意2
( 1. 哈尔滨师范大学生物系 ,哈尔滨　 150080)　 ( 2. 牡丹江师范学院生物系 ,牡丹江　 157012)
摘　要　以发根土壤杆菌 Ri质粒介导 ,对载体 pBTC- 8上的 T- DNA转化黄瓜
进行了初步研究。采用黄瓜的各种不同外植体片断与土壤杆菌共培养的方法 ,诱导
出具有典型毛状根特性的转化根 ,转化根经诱导培养形成愈伤组织 ,冠瘿碱检测表
明 ,转化根及愈伤组织含有农杆碱和甘露碱。 愈伤组织进一步分化培养再生出完整
植株。 再生植株表现卡那霉素抗性。
关键词　 Ri质粒 ;转化 ;黄瓜
GENETIC TRANSFORMATION OF CUCUMBER BY
AGROBACTERIUM RHIZOGENES WITH RI- PLASMID
Liu Wei- hua
1　 Jiang Jing1　 Shi rui1　 Ren ru- yi2
( 1. Depar tment of bio lo gy Ha rbin No rmal Univ ersity , Harbin 150080)
( 2. Depar tment of bio lo gy Mu Dan Jiang No rmal colleg e, Mudanjiang 157012)
Abstract　 T - DNA, have been cloned in plasmid vecto r pBTC- 8, w ere t ras-
ferred into cucumber by int roducing o f Ri- plasmid. Explants of cucumber w ere
cocul tured wi th Ag robacterium rhizogenes harbo ring the bina ry vector, and the
t ransfomants wi th typical pheno type of hai ry roo ts w ere yielded. The t ransfo rmed
- roo ts w ere moved on a cul ture medium containing Kanamycin to induce the calli
and shoo ts deriva ted f rom the calli. Detection of opine showed that the regene ra t-
ed- shoo ts a re t ransferred by Ri- plasmid. Transgenic plant show up response to
Kanamycin.
Key words　 Ri- plasmid; Transforma tion; Cucumber
1. 前　　言
近几年来 ,植物基因工程技术迅猛发展 ,运用该技术手段进行作物品质改良 ,提高作物
蔡火石生物科学发展基金资助项目。
1996年 10月收稿。
蛋白质和氨基酸的含量 ,培育抗病毒 ,抗逆、抗虫等工程植物已取得很大进展〔2, 3, 4, 7〕。其中以
土壤杆菌 ( Ag robacterium )为介导的植物转化方法已成为一种有效的基因转移手段。 具有
Ti质粒的根癌土壤杆菌 ( A. tumefaciens)转化植物产生冠瘿瘤 ,而具 Ri质粒的发根土壤杆
菌 ( A. rhizog enes)转化植物产生毛状根 ,毛状根具有激素自主型快速生长 ,多分枝、无向地
性 ,合成冠瘿碱等特征。经 Ri质粒转化产生的毛状根容易再生植株 ,因此 Ri质粒做为基因
工程的新载体已显示出它的方便性与可行性。 目前已有许多学者以发根土壤杆菌为介导进
行植物转化的研究〔1, 8, 9, 10, 13〕 , Ri质粒及其转化体的研究越来越受到人们的重视。
黄瓜是葫芦科植物中的一种重要的蔬菜作物 ,生产上常因病害减产而造成很大经济损
失 ,但由于黄瓜等葫芦科作物的组织培养基础较差 ,再生困难 ,因此黄瓜等葫芦科作物的遗
传转化导入抗病的外壳蛋白基因工作 ,在国内报导很少。 本文利用 Ri质粒感染植物诱导产
生毛状根 ,容易再生植株的特点 ,以 Ri质粒为载体 ,介导 T- DNA的 TMV- cp和 CMV -
cp基因转化黄瓜 ,并从毛状根再生植株 ,为黄瓜的抗病毒病育种探索新的途径。
2. 材料和方法
2. 1　实验材料
2. 1. 1　黄瓜品种:龙杂黄 1号 ,龙杂黄 2号 ,龙杂黄 3号由黑龙江省农科院园艺所提
供。
2. 1. 2　菌株: E. coliMM 294( pBTC- 8)由中科院微生物所提供 (其质粒的 T- DNA
上有 TMV和 CMV - cp基因 ) , E. coli HB101 ( pRK2013)由本研究室提供 ,发根土壤杆菌
R1000( p Ai4b)由日本筑波大学遗传实验中心惠赠。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　转化子的获得
以 pBTC- 8为供体菌 , p RK2013为诱动菌 , R1000为受体菌进行三亲交配 ,将 pBTC-
8质粒转移到发根土壤杆菌中。 取三种菌各自进行液体活化培养过夜 ,然后再混合交配培
养 ,经 10mM硫酸镁稀释后涂平板进行选择培养 ,选择培养基含卡那霉素 ,链霉素及壮观霉
素。挑选转化小菌落保存并对转化子菌液提取质粒 DNA,经琼脂糖电泳检测进一步确证为
转化子。
2. 2. 2　黄瓜无菌苗的获得
黄瓜种子用 95%乙醇浸泡 5min,再用 10%的安替福民浸泡 20～ 25min,无菌水冲洗 3
～ 4次 ,置于 1 /2M S或 2%蔗糖培养基上于培养室培养。
2. 2. 3　外植体接种
用手术刀片将黄瓜无菌苗的子叶、真叶切成 5mm× 5mm的方块 ,浸入过夜培养的转化
子菌液 5～ 10min进行共培养。黄瓜无菌苗的下胚轴切成 1. 5cm长的小段 ,在切口处涂抹过
夜培养的转化子菌液 ,置于诱导培养基上 25℃ , 2500lux , 16h /d光周期培养。
2. 2. 4　冠瘿碱 ( opine)检测
将待测样品研磨成浆 , 1000rpm离心取上清液在滤纸上点样或直接将样品挤压于滤纸
上 ,经纸电泳、显色、晾干即可观察〔11, 12〕。
3. 结果与分析
3. 1　毛状根的诱导
4374期　　　　　　　刘伟华等: 发根土壤杆菌 Ri质粒对黄瓜进行遗传转化的研究
将黄瓜无菌苗的子叶、真叶切块与发根土壤杆菌菌液共培养 ,下胚轴切段涂抹菌悬液 ,
在 MSO培养基上培养 10～ 15d左右 ,产生大量的根。 如表 1。
表 1 黄瓜外植体切块诱导出根的情况
Tab. 1 Induaing of roots from cucumber explant section
外植体
Explan t
感染菌液与对照
Bacterial cul tu re and con trol
接种外植体数
number of explan ts
长根外植体数
Explan ts w ith root s
百分比
%
子叶
Cotyledon
转化子
Trans forming bacterium
40 19 47. 5%
R1000
R1000 bacterium
20 11 55. 0%
YEB
YEB cul tu re s olu tion
15 5 33. 3%
下胚轴
Hypocotyl
转化子
Trans forming bacterium
30 14 46. 7%
R1000
R1000 bacterium
19 11 57. 9%
YEB
YEB cul tu re s olu tion
11 5 45. 5%
真叶
Euhylles
转化子
Trans forming bacterium
32 17 53. 1%
R1000
R1000 bacterium
22 13 59. 1%
YEB
YEB cul tu re s olu tion
15 7 46. 7%
将得到的不定根剪下 1cm大小 ,放在不含激素的 MS培养基中 ,多数感染菌液产生的
转化根生长快 ,成分枝状 (图版Ⅰ — 1, 2)。 而对照的末转化根则不生长。
3. 2　卡那霉素抗性检测
对三亲交配转化子菌液感染的外植体切块得到的毛状根进行卡那霉素抗性筛选 ,大约
有 29. 3～ 36%的毛状根具有卡那霉素抗性。在含卡那霉素 100mg /L的 M S无激素培养基
上可正常生长而对照根则不生长 , 2周后死亡 ,如表 2。
对具有卡那霉素抗性的毛状根进行冠瘿碱的检测 ,随机测试了 40个样品 ,结果有 54%
的毛状根中检测到农杆碱和甘露碱。说明所获得的抗性转化根是两种 T- DNA同时整合到
植物基因组中。
3. 3　愈伤组织的诱导和植株再生
黄瓜的抗性毛状根分别培养在诱导培养基 MS+ NAA /BA( 5mg /L, 2. 5mg /L)上置培
养室中培养 , 10～ 15d左右根开始膨大 ,形成愈伤组织 (图版Ⅰ 　 3, 4)经继代培养 ,愈伤组织
分化出根。此外 ,黄瓜外植体切块与菌液共培养后 ,如果直接放在愈伤组织诱导培养基上培
养 ,经 15～ 20d在切口处也可出现愈伤组织 ,黄瓜转化根得到的愈伤组织和外植体与转化子
菌液共培养直接产生的愈伤组织检测到了农杆碱和甘露碱 ,而对照则无冠瘿碱存在。
经诱导培养产生的愈伤组织转到 MS+ NAA /BA( 0. 1～ 1mg /L )培养基上培养再生出
完整植株 , (图版Ⅰ 　 5)再生植株检测到了冠瘿碱的存在 (图版Ⅰ , 6) ,并表现卡那霉素抗性 ,
因此 ,初步证明携带外源基因的 T- DNA已转移到黄瓜中。
438 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　 17卷
表 2 黄瓜毛状根卡那霉素抗性检测
Tab. 2 Analysis of kanamycin- resistance of hairy roots
外植体
Explan t
感染菌液与对照
Bacterial cul tu re and con trol
接种毛状根
num ber of hairy roots
抗性毛状根数
Kmr Hairy roots
百分比
%
子叶
Cotyledon
转化子
Trans forming bacterium
60 19 31. 7%
R1000
R1000 bacterium
6 0 0. 0%
YEB
YEB cul tu re s olu tion
4 0 0. 0%
下胚轴
Hypocotyl
转化子
Trans forming bacterium
39 14 35. 9%
R1000
R1000 bacterium
7 0 0. 0%
YEB
YEB cul tu re s olu tion
3 0 0. 0%
真叶
Euhylles
转化子
Trans forming bacterium
58 17 29. 3%
R1000
R1000 bacterium
5 0 0. 0%
YEB
YEB cul tu re s olu tion
4 0 0. 0%
4. 讨　　论
4. 1　影响发根土壤杆菌转化黄瓜的因素总结如下:
①用于感染的转化子菌液要在含抗菌素的 YEB平板上活化 48h再进行过夜培养方可
用于转化 ,如果菌液不经活化或培养时间过长则会降低转化频率。 ② 感染时外植体与菌液
接触的时间不宜过长或过短 ,对黄瓜来讲 5～ 8min为宜 ,时间过长外植体将出现褐化或损
伤 ,时间过短转化不完全 ,也会降低转化频率。③ 外植体与菌液接触后 ,要将菌液吸干 ,为了
保证充分转化以及抗性表达 ,需放在无抗菌素的培养基上培养 36～ 48h再进行除菌。④ 在
含植物激素的培养基上预培养的外植体细胞对土壤杆菌介导的转化比较敏感 ,因此在接菌
共培养之前进行预培养会提高转化频率。在本实验中发现 ,黄瓜的预培养时间为 2～ 3d,而
且预培养中单独使用 2. 4- D效果较好。
4. 2　黄瓜的遗传转化研究报道不多 ,国内徐华强等 ( 1991)〔5〕利用电击法将氯霉素乙酰
转移酶基因导入黄瓜原生质体并实现瞬间表达。郭亚华等 ( 1993)〔 6〕利用花粉管通道技术 ,将
抗霜霉病的黄瓜供体 DNA导入“长春密刺”受体黄瓜中并获得突变体。国外 Sarmento G. G
等 ( 1992)〔 14〕以根癌土壤杆菌 Ti质粒介导将卡那霉素抗性基因导入黄瓜。 本实验经过初步
研究 ,以发根土壤杆菌 Ri质粒介导 ,用含 TMV- cp和 CMV- cp基因的 T- DNA转化子
菌液感染黄瓜不同外植体 ,经过一定的诱导和分化培养再生出完整植株 ,再生植株表现卡那
霉素抗性 ,并检测到有冠瘿碱的合成 ,本实验为研究黄瓜的遗传转化和抗病毒育种探索了一
条新的途径。
4394期　　　　　　　刘伟华等: 发根土壤杆菌 Ri质粒对黄瓜进行遗传转化的研究
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图　　版　　说　　明
1. 子叶诱导产生的毛状根 ; 2. 毛状根快速生长 ; 3. 4. 诱导培养产生的愈伤组织 ; 5. 再生的小植株 ; 6. 冠瘿碱检测 ; a. 标
准样 , b. 对照 , c. 毛状根 , d. 再生植株。
Explanation of Figures
1. Hairy roots ind uced f rom co tyledon; 2. Fast g row th of hairy root s; 3. 4. Callus fo rm ed on inducing medium; 5. Re-
g enerate plant; 6. Analysis of opin e; a. standard , b. con t rol , c. hairy roots , d. regen erate plant.
440 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　 17卷