全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 18 卷　第 1 期 1998 年　1月
Vol.18　No.1 Jan., 　1998
小麦 D2 型光敏性细胞质雄性不育系在不同
光照条件下可溶性蛋白的比较分析
姜　静1　刘伟华2　石　锐2　张月学2　李集临2
(1.东北林业大学 ,哈尔滨 150040)　　(2.哈尔滨师范大学 , 哈尔滨 150080)
摘　要　小麦 D2型细胞质与特定的核结合 ,对长光照(≥15小时)反应敏感 ,表现为
雄蕊雌化 ,花粉败育 。本实验通过扫描电镜观察了雌化的雄蕊横切面 ,发现有类似
于胚珠的结构 ,但没有胚珠组织 ,也没有花药壁和花粉粒的结构 。同时应用单向
SDS-PAGE 技术 ,对(C)-N26(D2型细胞质)小麦和 N26(B 型细胞质 ,核基因组相
同)小麦的细胞质可溶性蛋白 、叶绿体可溶性蛋白 、线粒体可溶性蛋白多肽进行了比
较分析 ,结果表明:在短光照条件下(≤14.5 小时)(C)-N26小麦和长光照条件的
N26小麦细胞质可溶性蛋白 、线粒体可溶性蛋白和叶绿体可溶性蛋白多肽的 SDS-
PAGE图谱无差异。而(C)-N26小麦在长光照和短光照条件下 SDS-PAGE图谱
存在明显的差异 。这种差异总趋势是长光照条件下蛋白多肽减少。故推测小麦 D2
型光敏性细胞质雄性不育 ,在长光照条件下 ,雄蕊雌化与不育表型的表达可能与核
基因 、线粒体基因和叶绿体基因的表达阻遏调控有关。
关键词　小麦;D2 型细胞质;雄性不育;可溶性蛋白;SDS-PAGE
COMPARATIVE ANALYSIS OF SOLUBLE PROTAINS
IN D2 TYPE PCMS LINES OF WHEAT ON
DIFFERENT PHOTOPERIODIC CONDITIONS
Jiang Jing1　Liu Wei-hua2　Shi Rui2　Zhang Yue Xue2　Li Ji-lin2
(1.Nor theast Forestry University , Harbin 150040)
(2.Harbin Normal University ,Harbin 150080)
Abstract　The combination of D2 ty pe cy toplasm and certain nucleus can cause wheat
to be sensitive to long -day condi tion(≥15 hours)w ith the expression of pistillody of
stamens and pollen abortion.Observation of tranverse sections using the scanning
收稿日期:1997-6-10
elet ron microscope revealed that pistillate stamens contained ovule -like structures but
had no ovule tissue、 tapetal cells and pollen grains.Comparison w as made using unidi-
rectional SDS -PAGE technique among soluble pro teins of chloroplast 、 mitochondria
and cytoplasm derived f rom wheat (c)-N26(D2ty pe cytoplasm)and wheat N26(B
type cytoplasm , the same nucleric genome).The SDS-PAGE maps of soluble pro teins
of chlorplast 、mitochondria and cytoplasm derived from (c)-N26 under a short-day
condition(≤14.5hours)showed no dif ference to that of N26 under a long-day condi-
tion.But there were distinct dif ferences betw een SDS -PAGE maps of (c)-N26 cul-
tured on the long-day condition and sho rt-day condition respectively .The trends is
the reduction of proteins.So i t can be infered f rom the facts above that on the long -
day condit ion pistillody of stamens in D
2
PCMS line is probably relation to repression of
genes expression in nuclei 、chloroplast and mitochondria.
Key words　wheat;D2 type cytoplasm;Malesterili ty;Soluble proteins;SDS-PAGE
Sasakuma和 0htsuka(1979)〔10〕报道具有粗厚山羊草(Aegi lops crassa), 牡山羊草
(Aegi lops juvenalis)和瓦维洛夫山羊草(Aegi lops vav ilovii)细胞质的农林 26(Norin26)小麦
(Tsunew aki命名为 D2型细胞质 1980)〔12〕在日本北海道种植时 ,表现完全雄性不育 ,这种不
育导致雄蕊雌化 。Murai(1993)〔7〕实验也证明了具有 Ae.crassa 细胞质的 Norin26小麦在长
日照条件下(≥15小时)表现几乎全部雄性不育 ,但在短日照条件下(≤14.5小时)则表现雄
性可育 ,并且温度对育性的降低没有明显的影响 ,因此把这种类型的雄性不育又叫作“光敏
性细胞质雄性不育”(Pho toperiodsensi tive Cytoplasmic Male Sterility PCMS)。D2 型光敏性细
胞质雄性不育与 G型 、Sv型不同 ,G型 、Sv 型细胞质雄性不育表现在花粉粒于单核期败育 ,
许多学者认为〔1 , 8 , 11〕 ,不育机制与线粒体 DNA有关。而 D2型 PCM S表现为雄蕊雌化 ,无花
粉粒 。目前有不少学者已对 D2 型 PCM S小麦与它的同核保持系小麦的线粒体基因组和核
基因组进行了比较研究〔5 , 6〕 ,而 D2型 PCMS 小麦在不同光照周期条件下为何基因表达有差
异 ,对这一问题尚未见报道。本实验是以 D2 型 PCMS 小麦及相应的同核保持系为材料 ,在
不同光照周期条件下 ,对不同发育时期 ,不同器官的叶绿体蛋白多肽 ,线粒体蛋白多肽和细
胞质可溶性蛋白多肽进行 SDS-PAGE 比较分析 ,目的是探讨蛋白多肽组成的差异 ,进而研
究 PCM S的机理 。
1.材料和方法
1.1　材料:
Norin26(N26)小麦(B型细胞质),(C)-N26小麦(D2型细胞质)引自日本京都大学 K.
Tsunewaki教授的遗传学研究室。
1.2　用于 SDS-PAGE材料的取样:
上述小麦于 9月上旬分别种于温室的花盆中 ,并将(C)-N26小麦分两种光照条件栽
培 ,一组每天光照时间为 15小时以上 ,(用碘钨灯延长光照时间),另一组每天光照为 14.5
小时以下(自然光)。分别取分蘖期叶片 、展开的旗叶和幼穗 ,称重后水洗 ,置-20℃冰箱中
保存备用 。
691 期　　姜静等:小麦 D2 型光敏性细胞质雄性不育系在不同光照条件下可溶性蛋白的比较分析
1.3　扫描电镜观察材料制备:
当N26和(C)-N26小麦在旗叶叶鞘即将张开时剥取麦穗 ,用 Carnoy 液固定 , 24小时
后 ,转入 70%酒精中置-4℃冰箱中保存备用。
1.4　蛋白质样品的制备:
按刘鸿先的分级分离法〔2〕 ,先把叶绿体 、线粒体和细胞质三部分分离开 ,再分别提取它
们的蛋白质。所有操作尽量在较低温度下进行。
1.5　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
电泳之前用 0.1%Tri tonX-100(体积比为 样品:Tri tonX-100=3:1)破坏线粒体膜和
叶绿体膜。各样品分别取 20μl再加入 20μl的 2倍样品缓冲液 ,充分混合 , 95℃加热 3分钟
迅速冷却后点样 。采用垂直板 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,浓缩胶 T =3%,C=4%,分离胶
T =10%,C=2%。电流为 20mA ,电泳时间为 3小时左右 ,电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部
后停止电泳。进行蛋白多肽的染色与脱色。蛋白多肽的分子量用与样品共电泳的标准蛋白
质确定之〔3〕 ,所用标准蛋白质的分子量为 1.75KD 、3KD 、4.5KD 、6.7KD 、9.4KD 。
1.6　扫描电镜的观察
在解剖镜下剥取已固定好的材料 , N26小麦的正常花药(处在减数分裂时期)和(C)-
N26小麦雌化的雄蕊 ,横切之后进行脱水处理 ,再转入中间液(醋酸异戊酯)30 分钟 ,然后进
行 2小时的CO2 临界点干燥 ,导电处理(金属镀膜法),最后扫描电镜观察 、照像 。
2.结果与分析
2.1　短光照条件下(C)-N26小麦与 N26小麦的细胞质可溶性蛋白 、线粒体蛋白 、叶绿体
蛋白多肽图谱的比较分析
实验结果表明 ,两种供试材料的分蘖期叶片 、旗叶叶片和幼穗中的细胞质可溶性蛋白 、
线粒体可溶性蛋白和叶绿体可溶性蛋白多肽的 SDS-PAGE图谱无差异。
2.2　(C)-N26小麦在长光照和短光照条件下分蘖期叶片的细胞质可溶性蛋白 、线粒体蛋
白和叶绿体蛋白多肽图谱比较分析
在两种光照条件下该时期叶片的线粒体可溶性蛋白和叶绿体可溶性蛋白多肽的 SDS-
PAGE图谱无差异 ,而细胞质可溶性蛋白多肽的SDS-PAGE 图谱有差异 ,表现在 6KD处长
光照比短光照少了一条带 ,在长光照条件下有多条弱带(图版 1 a 、b)。这一结果说明 ,可能
在细胞核基因组内存在对光敏感的基因 ,在长光照条件下该基因表达受阻 。
2.3　(C)-N26小麦在长光照和短光照条件下 ,旗叶叶片的细胞质可溶性蛋白 、线粒体蛋白
和叶绿体蛋白多肽图谱比较分析
(C)-N26小麦 ,在长光照和短光照条件下 ,旗叶叶片的细胞质可溶性蛋白 、线粒体可溶
性蛋白和叶绿体可溶性蛋白多肽的 SDS-PAGE图谱没有看到差异。
2.4　(C)-N26小麦在长光照和短光照条件下幼穗的细胞质可溶性蛋白 、线粒体蛋白和叶
绿体蛋白多肽图谱比较分析
该时期的细胞质可溶性蛋白多肽的 SDS -PAGE图谱表明 ,长光照比短光照少一条 3.
8KD多肽(图版 1 d 、e),线粒体可溶性蛋白多肽 SDS-PAGE图谱表明 ,长光照在 2KD处少
一条带(图版 2 a、b),并有 2条明显的弱带(4KD和 1.5KD),叶绿体可溶性蛋白多肽 SDS-
PAGE图谱表明 ,长光照比短光照少一条 7.5KD多肽(图版 2 d 、e)。结果说明 ,长光照抑制
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了一些蛋白多肽的表达。
2.5　扫描电镜的观察
具有Ae.C rassa细胞质的农林 26 小麦 ,在长光照条件下(≥15小时),雄蕊表现雌化。
分别对雌化的雄蕊(图版 4)、正常的雄蕊的横切面进行扫描电镜观察 ,(图版 3),雌化的雄蕊
在偏下方横切面观察到有类似于胚珠状结构 ,但是 ,没有胚珠组织 ,只是一个空洞 ,同时也没
有看到花药壁的结构和花粉粒 。
3.讨　　论
3.1　D2型细胞质基因与核基因相互作用 ,形成光敏性细胞质雄性不育的探讨
Murai认为光敏性细胞质雄性不育的产生 ,是由于 D2 型细胞质和农林26核在大于等于
15小时的光照条件下 ,内部作用的结果〔7〕。本实验结果表明 ,光敏性细胞质雄性不育除与
核基因 、细胞质基因有关外 ,外界条件也是一个很重要的因素 ,是三者之间相互作用的结果 ,
这里核基因起主导作用。
D2型光敏性细胞质雄性不育 ,有别于其它类型的不育 ,在长光照条件下主要表现为雄
蕊雌化 ,这种雄蕊雌化性状的表达 ,可能和特异性蛋白表达有关 。根据实验结果推测 ,在核
基因组 、线粒体基因组和叶绿体基因组中有抑制雄蕊雌化的基因 ,在短光照条件下(≤14.5
小时),核基因组中抑制雄蕊雌化的基因去阻遏状态 ,同时它的转录 、翻译产物作用于线粒体
和叶绿体 ,使之产生与雄蕊正常表达相关的蛋白 、酶类等物质 ,从而雄蕊发育正常 。但是 ,在
长光照条件下(≥15小时),总的趋势是蛋白多肽减少 。核基因组中抑制雄蕊雌化的基因 ,
表现为阻遏状态 。从实验结果上看 ,长光照条件下分蘖期的叶片细胞质可溶性蛋白 SDS-
PAGE图谱缺少 6KD多肽 ,这 6KD多肽可能调控着幼穗分化过程中线粒体基因和叶绿体基
因的表达 。因此 ,我们认为 D2 型光敏性细胞质雄性不育特性的形成 ,可能与基因表达阻遏
调控有关 。
3.2　应用光敏性细胞质雄性不育 ,开拓小麦杂种优势的新途径
光敏性细胞质雄性不育在水稻中已发现〔9〕 ,它主要由一个隐性基因控制 ,有这个基因的
影响在长光照条件下才表现〔13〕 。利用这一现象在我国两系法杂交水稻的研究已获得较大
进展 ,初步实现了两系配套。
D
2型细胞质可作为小麦光敏性细胞质雄性不育的重要遗传资源〔4〕 ,光敏性细胞质雄性
不育系可以在我国南方短日照条件下(≤14.5小时)自交繁殖 ,利用我国北方自然长光照条
件 ,选用配合力强 ,有恢复能力的优良品种小麦与光敏性细胞质雄性不育系小麦杂交 ,筛选
强优势组合。有可能为两系法小麦杂种优势利用开辟一条新途径。
参　　考　　文　　献
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711 期　　姜静等:小麦 D2 型光敏性细胞质雄性不育系在不同光照条件下可溶性蛋白的比较分析
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图　　版　　说　　明
图版Ⅰ 　细胞质可溶性蛋白多肽 SDS-PAGE图谱.a.(C)-N26长光照分蘖期叶片;b.(C)-N26短光照分蘖期叶片;
c.N26长光照分蘖期叶片;d.(C)-N26长光照幼穗;e.(C)-N26短光照幼穗;f.N26长光照幼穗
图版Ⅱ　线粒体和叶绿体可溶性蛋白多肽 SDS-PAGE图谱.a.(C)-N26长光照幼穗线粒体蛋白多肽;b.(C)-N26短
光照幼穗线粒体蛋白多肽;c.N26长光照幼穗线粒体蛋白多肽;d.(C)-N26长光照幼穗叶绿体蛋白多肽;e.(C)-N26
短光照幼穗叶绿体蛋白多肽;f.N26长光照幼穗叶绿体蛋白多肽
图版Ⅲ　正常雄蕊横切 ,放大 350倍
图版Ⅳ　雌化雄蕊横切 ,放大 250倍
Explanation of plates
Plate Ⅰ 　SDS-PAGE profiles of the soluble proteins of cytoplasm.a.leaves of(c)-N26 at tillering stage under long-day
condit ion;b.leaves of(c)-N26 at ti llering stage under short-day condit ion;c.leaves of N26 at tillering stage under long-
day condition;d.young heads of(c)-N26 under long-day condition;e.young heads of(c)-N26 under short-day condi-
t ion;f.young heads of N26 under long-day condition
Plate Ⅱ　SDS-PAGE profiles of the soluble proteins of mitochondria and chlorplast.a.mitochondria f rom young heads of(c)
-N26 under long-day condit ion;b.mitochondria from young heads of(c)-N26 under short-day condition;c.mitochondria
f rom young heads of N26 under long-day condition;d.chlorplast f rom young heads of(c)-N26 under long-day condit ion;
e.chlorplast from young heads of(c)-N26 under short-day condi tion;f.chlorplast f rom young heads of N26 under long-day
condit ion
Plate Ⅲ　the cross seetion of normal stamen , ×350
Plate Ⅳ　the cross seetion of feminizat ion stamen , ×250
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