全 文 ：第 24卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　10月
Vol.24　No.4　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2004
基金项目:国家自然科学基金(项目编号 30170076)
第一作者简介:侯义龙(1963—),男 ,博士 ,教授 ,从事植物生物技术研究工作 ,中国科学院沈阳应用生态研究所博士后。
＊　通讯作者
收稿日期:2004-01-07
中国东北 15种藓类植物 RAPD分析及其分类学意义
侯义龙1 , 2　曹　同3＊
(1.大连大学生命科学工作室 , 大连　116622)
(2.大连大学生物工程学院 , 大连　116622)
(3.上海师范大学生命与环境科学学院 , 上海　200234)
摘　要　本研究选用 15种东北藓类植物 ,其中塔藓 、赤茎藓 、垂枝藓 、拟垂枝藓 、羽平藓 、木藓 、万
年藓等为北半球广泛分布的大型藓类 ,而褶叶藓 、粗枝藓 、球蒴金发藓等则是东亚特有种 。在野外
调查和采集的基础上 ,进行 RAPD分析 ,旨在从 DNA水平上对它们的亲缘关系和分类问题加以研
究 ,为它们的分类问题和亲缘关系提供分子证据。结果:从分子水平上进一步验证了 15种东北藓
类植物形态分类的正确性 。不同种类分别聚在金发藓目(Polytrichinales),变齿藓目(Isobryales)和
灰藓目(Hypnobryales)中 ,与现采用分类系统一致 。东北特产属褶叶藓属(Okamuraea)和粗枝藓属
(Gollania)与垂枝藓科(Hyitidiaceae)植物关系较近 ,而赤茎藓(Pleurozium)与绢藓(Entodon)有一定
亲缘关系 。因此 ,将赤茎藓置于塔藓科(Hylocomiaceae)是合适的 。
关键词　中国东北;藓类植物;RAPD;分类学;亲缘关系
RAPD analysis of 15 mosses species from Northeast China
and its taxonomic implication
HOU Yi-Long1 ,2　CAO Tong3＊
(1.Laboratory of Life Science, Dalian University , Dalian　116622)
(2.Bioengineering College , Dalian University , Dalian　116622)
(3.College of Life and Environmental Science , Shanghai Normal University , Shanghai　200234)
Abstract　The random amplified polymorphic DNA(RAPD)was used to analyse the phylogenetic relationship
among fifteen mosses species from Northeast China in which Hylocomium Splendens , Pleurozium schreberi ,
Rhytidium rugosum , Rhytidiadelphus squarosus , Neckera pennata , Thamnobryum alopecurum and Climaci-
um dendroides distribute extensively in northern semiglobe , and Okamuraea brachydictyon , Gollania varians
and Polytrichum sphaerothcium are representative species endemic to East Asia.The results showed that the
RAPD results support the classification of these mosses based on morphology.All the 15mosses species were
clustered in Polytrichinales , Isobryales and Hypnobryales.Okamuraea and Gollania have a closer phyloge-
netic relationship with Hyitidiaceae.Pleurozium has a closer phylogenetic relationship with Entodon , so it is
suitable for Pleurozium to be placed in Hylocomiaceae.
Key words　Northeast China;mosses;RAPD analysis;taxonomy;phylogenetic relationship
东北地区是我国乃至世界温带地区藓类植物
多样性较为丰富的地区之一 ,物种丰富[ 1] 。高谦[ 2]
报道东北地区有藓类 45科 ,153属 ,433种 ,43亚种
和变种 , 13个变型 ,Redfearn Jr 等[ 3] 记录东北地区
的藓类植物有 48科 ,189属 ,共 636个种 ,其中辽宁
省413种 ,吉林省500种 ,黑龙江 381种 。对该地区
苔藓植物开展了较深入的分类区系和生态学研
究[ 2 ,4 ,5] ,近年来也有细胞学和同工酶方面的研
究[ 6] ,但 DNA水平上的专门研究还未见报道 。基
因水平上的研究更能真实地反映东北藓类植物区
系的特征 。
自二十世纪 90年代以来 , RAPD分析己被证明
为植物遗传多样性研究和系统学研究的一个有用
而简单的工具[ 7 , 8] 。它有成本低 、分析速度快 、仅
需极微量的 DNA即能获得丰富的多态性特征等优
点[ 9] ,己被广泛应用于植物的分类 、遗传和进化关
系等方面的研究[ 10 ～ 17] 。
本研究选用我国东北 15种藓类植物 ,其中塔
藓 、赤茎藓 、垂枝藓 、拟垂枝藓 、羽平藓 、木藓 、万年
藓等为北半球广泛分布的大型藓类 ,而褶叶藓 、粗
枝藓 、球蒴金发藓等则是东亚特有种。在野外调查
和采集的基础上 ,进行 RAPD分析 ,旨在从 DNA 水
平上对它们的亲缘关系和分类问题加以研究 ,为它
们的分类问题和亲缘关系提供分子证据 ,研究结果
具有一定的典型意义。
1　材料与方法
1.1　试验材料
本实验在中国科学院沈阳应用生态研究所植
物室 、大连大学生物工程学院和大连大学素质教育
基地生命科学工作室完成。
15种东北藓类植物的来源见表 1。
RAPD 扩增所用试剂和仪器:dNTPs , λDNA/
EcoRI+Hand Ⅲ Marker ,随机引物 ,Taq酶购自北京
鼎国生物技术发展中心(GIBCO BRL 产品)。其余
试剂均为国产分析纯。
PCR仪为美国 Bio-Rad公司产品 iCycler。
表 1　试验材料来源
Table 1　The origin of experimental materials
序号
No.
物种名称
Species
引证标本编号
No.of specimen
采集时间
Time of collection
采集地
Origin
1 羽平藓(Neckera pennata) 020025 2002.7.12 长白山自然保护区
2 木藓(Thamnobryum alopecurum) 020065 2002.7.17 长白山自然保护区
3 扁枝藓(Homalia trichomanoides) 020015 2002.7.12 长白山自然保护区
4 万年藓(Climacium dendroides) 020041 2002.7.15 长白山自然保护区
5 小白齿藓(Leucodon pendulus) 020023 2002.7.12 长白山自然保护区
6 扭叶小金发藓(Pogonatum contortum) 020069 2002.7.17 长白山自然保护区
7 球蒴金发藓(Polytrichum sphaerothecium) 020003 2002.7.12 长白山自然保护区
8 拟垂枝藓(Rhytidiadelphus squarosus) 020010 2002.7.12 长白山自然保护区
9 垂枝藓(Rhytidium rugosum) 020005 2002.7.12 长白山自然保护区
10 粗枝藓(Gollania varians) 020055 2002.7.15 长白山自然保护区
11 褶叶藓(Okamuraea brachydictyon) 020067 2002.7.17 长白山自然保护区
12 赤茎藓(Pleurozium schreberi) 020045 2002.7.15 长白山自然保护区
13 狭叶绢藓(Entodon angustifolium) 020088 2002.7.17 长白山自然保护区
14 星塔藓(Hylocomiastrum pyrenaicum) 020007 2002.7.12 长白山自然保护区
15 塔藓(Hylocomium splendens) 020002 2002.7.12 长白山自然保护区
1.2　试验方法
取同一物种 100 ～ 200 mg(来自 10 株个体)用
于DNA提取 。总 DNA 提取及 PCR扩增参照侯义
龙等[ 18] 。PCR扩增反应重复 3 次 , 选取可重复的
DNA带(包括强带和弱带)记录。每个样品的扩增
谱带按“有”或“无”记录。“有”赋值为 1 , “无”赋值
为0。根据 Nei和 Li(1979)[ 19]的方法计算样品间的
简单遗传相似系数 I , I=2Ni j/(N i+N j),其中 , N i ,
N j为两样品的总扩增带数 , N ij为两样品共有的扩
增带数 。根据上述结果计算样品之间的相似系数 ,
列成矩阵 ,采用编网法[ 20] 进行聚类分析 ,建立系统
聚类分析树状图 。
2　结果与分析
2.1　随机扩增能力和多态性分析
利用 48个随机引物进行多态性产物筛选 , 26
个引物(占54.2%)产生不清晰和无法检测的产物 ,
6个引物(占 12.5%)产生单一的带 , 16 个(占
33.3%)能产生多态性谱带 ,仅选能得到清晰扩增
带和对照无假带的 8个引物进行正式的扩增 ,共产
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图 1　引物 OPC-05的 RAPD产物电泳结果
Fig.1　RAPD profiles generated by primer OPC-05
生 56条可区分的 DNA 带 ,结果见表 2。最少的在
引物OPB-08和 OPQ-18 ,分别只获得 3 条带 ,最
多的在引物 OPA-13和 OPG-16 ,分别得到 11条
带 ,平均每个引物产生 7条带 ,其中引物 OPC-05
和OPP-16的扩增结果见图 1和图 2(材料编号见
表1 ,M为λDNA/EcoRI+HandⅢ)。
56条带中 ,有 16条(占28.57%)存在于所有分
析的 15个东北藓类植物中 ,40条(占7l.43%)为多
态性带 。这说明了这些东北藓类植物遗传背景的
复杂性 ,它们存在着丰富的遗传多样性。15种东北
藓类植物之间 RAPD产物多态性见表 3。
2.2　15个东北藓类植物之间遗传关系
Nei氏遗传相似系数的计算结果见表 3 ,变幅为
0.68 ～ 0.98。
图 2　引物 OPP-16 的 RAPD产物电泳结果
Fig.2　RAPD profiles generated by primer OPP-16
表 2　引物及其序列和扩增结果
Table 2　List of primes , their sequences and amplification results
引物
Primers
序列(5′-3′)
Sequence(5′-3′)
总扩增带数
Total
bands
多态性扩增带数
Scorable
polymorphic bands
OPA13 CAGCACCCAC 11 8
OPB01 GTTTCGCTCC 7 4
OPB08 GTCCACACGG 3 1
OPC05 GATGACCGCC 8 6
OPG16 AGCGTCCTCC 11 9
OPG18 GGCTCATGTG 3 1
OPH19 CTGACCAGCC 8 7
OPP16 CCAAGCTGCC 5 4
总计 Total 8 56 40
表 3　15种东北藓类植物 RAPD分析的相识矩阵及 RAPD产物多态性
Table 3　Similarity among 15 moss taxa from Northeast China and polyphormism of their RAPD profiles
rij 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 1 2/88 6/ 90 7/ 87 8/86 21/83 21/ 81 12/ 83 13/84 13/ 84 14/ 84 15/87 15/ 88 14/ 80 19/83
2 0.98 1 9/ 90 6/ 87 8/86 19/83 21/ 81 14/ 83 13/84 14/ 84 14/ 84 15/87 14/ 88 16/ 80 17/83
3 0.93 0.90 1 7/ 89 10/ 88 16/85 19/ 83 14/ 85 14/86 15/ 86 15/ 86 15/89 17/ 90 14/ 80 21/85
4 0.92 0.93 0.92 1 8/85 18/82 20/ 80 16/ 82 16/83 16/ 83 16/ 83 15/86 15/ 87 13/ 79 22/82
5 0.91 0.91 0.89 0.91 1 23/81 25/ 79 13/ 81 14/82 15/ 82 14/ 82 15/85 15/ 86 13/ 78 25/81
6 0.74 0.77 0.81 0.78 0.72 1 4/ 76 18/ 78 19/79 23/ 79 17/ 79 15/82 21/ 83 19/ 75 18/78
7 0.74 0.74 0.77 0.75 0.68 0.95 1 20/ 76 21/77 25/ 77 19/ 77 14/80 21/ 81 19/ 73 14/76
8 0.85 0.83 0.84 0.81 0.84 0.77 0.74 1 8/ 79 9/ 79 15/ 79 14/82 12/ 83 11/ 75 14/78
9 0.84 0.84 0.84 0.83 0.83 0.76 0.73 0.90 1 9/ 80 10/ 80 15/83 12/ 84 12/ 76 23/79
10 0.84 0.83 0.83 0.83 0.82 0.71 0.68 0.89 0.89 1 10/ 80 15/83 12/ 84 10/ 76 23/79
11 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83 0.79 0.75 0.81 0.87 0.88 1 13/83 12/ 84 14/ 76 23/79
12 0.83 0.83 0.83 0.82 0.82 0.82 0.83 0.83 0.82 0.82 0.84 1 8/ 87 15/ 79 16/82
13 0.83 0.84 0.81 0.83 0.83 0.75 0.74 0.85 0.86 0.86 0.86 0.91 1 10/ 80 21/83
14 0.83 0.83 0.83 0.83 0.83 0.75 0.74 0.85 0.84 0.87 0.82 0.81 0.87 1 7/ 75
15 0.77 0.80 0.75 0.73 0.69 0.77 0.82 0.74 0.71 0.71 0.71 0.81 0.75 0.90 1
　　注:＊　材料编号见表 1。 　　＊＊　右上角数字为 15种东北藓类植物之间 RAPD产物多态性 ,分母为两物种的总带数 ,分子为两物种
之间共有的带数。左下角为 15种东北藓类植物之间 RAPD产物 Nei氏遗传相似系数。
　　Note:＊　The No.of experimental materials is in Table 1.　　＊＊　The Numbers.in right upper corner are the polyphormism of RAPD profiles ,and
those in left bottom corner are the Nei coeffi cients of similarity.
4794期　　　　　　　　　　　　　　　　　侯义龙等:中国东北 15 种藓类植物 RAPD分析及其分类学意义
根据这些相似系数用编网法进行聚类分析 ,得
到一树状分支图(图 3)。由图 3可以看出:当截矩
λ=0.88时 ,羽平藓 、木藓 、扁枝藓 、万年藓与小白齿
藓;小金发藓与球蒴金发藓;拟垂枝藓 、垂枝藓 、粗
枝藓以及褶叶藓;赤茎藓与绢藓;星塔藓与塔藓分
别聚为5类 ,表明它们之间的亲缘关系较近。而各
类内的情况是:木藓与羽平藓先聚在一起 ,然后 ,分
别与扁枝藓 ,万年藓和小白齿藓先后聚在一起 。扭
叶小金发藓与球蒴金发藓亲缘关系较近 。拟垂枝
藓与垂枝藓先聚在一起 ,其后与粗枝藓和褶叶藓聚
在一起。赤茎藓和狭叶绢藓亲缘关系较近 。星塔
藓与塔藓亲缘关系较近 。扭叶小金发藓与球蒴金
发藓从形态上来看 ,二者都属于线齿类金发藓目 ,
RAPD分析结果也将二者单独聚为一类 ,而与其它
节齿藓类不同;羽平藓 、木藓 、扁枝藓 、万年藓与小
白齿藓虽然在形态上分属于不同的科 ,但它们都归
属于变齿藓目 ,所以 , RAPD分析时 ,它们首先聚在
一起;拟垂枝藓 、垂枝藓 、粗枝藓 、褶叶藓 、赤茎藓 、
狭叶绢藓 、星塔藓以及塔藓均属于灰藓目 ,因此 ,它
们先聚在了一起。这与形态分类基本相同 。从
RAPD分析的基础上 ,进一步证实了形态分析的准
确性。此外 ,从本研究的结果看 ,绢藓科与塔藓科
的亲缘关系比与垂枝藓科的亲缘关系更近一些 ,变
齿藓目与灰藓目的亲缘关系比与金发藓目更近一
些 ,这是形态研究所没有提及的。
图 3　编网法聚类图
Fig.3　Dendrogram generated by using Nei coefficients of similarity
3　讨论
3.1　关于 RAPD分析及其多态性
本研究利用 8个引物共产生 56条 RAPD扩增
带 ,虽然所用的引物不多 ,但能从 56个位点对供试
的15个物种进行了检测 ,这种效率是形态性状 、细
胞学特征和 RFLP 等方法无法比拟的。结果表明:
羽平藓 、木藓 、扁枝藓 、万年藓和小白齿藓;扭叶小
金发藓和球蒴金发藓;拟垂枝藓 、垂枝藓 、粗枝藓和
褶叶藓;赤茎藓和狭叶绢藓;星塔藓和塔藓各自聚
为一支。各支内的物种的亲缘关系较近 ,并且越先
聚在一起的亲缘关系越近 。在分析的 15个东北藓
类植物中 ,多态性带占7l.43%,这说明了这些东北
藓类植物遗传背景的复杂性 ,它们存在着丰富的遗
传多样性 。
本研究的结果基本上同形态学分析结果相吻
合。因此 , RAPD分析将是东北藓类植物系统学研
究的有效补充手段。
由于 RAPD所用的随机引物是 10bp的寡聚核
苷酸 ,同时 , 扩增反应还会受到模板 DNA 用量 、
dNTPs 、MgCl2 及 Taq酶浓度等诸多因素影响 ,因而
RAPD技术较其它分子标记(如 RFLP)稳定性差 ,限
制了它更广泛的应用。本实验注重扩增所用的反
应条件和体系的相对固定一致 ,其扩增结果的稳定
性较好。类似的报道很多[ 7 ,15 ,21] 。总之 ,在传统的
分类基础上 ,利用现代 DNA分析技术 ,将会为东北
藓类植物的系统学研究提供更可靠的依据 。
3.2　关于赤茎藓的分类地位问题
赤茎藓(Pleurozium schreberi)是在全世界有广
泛分布的大型藓类。有关其系统地位与归属有不
同观点 , 或者认为该属应单置于绢藓科(Etodon-
taceae)[ 2] ,或者认为该属应单置于柳叶藓科(Am-
blystegiaceae)或灰藓科(Hypnaceae)[ 22] ,但多倾向将
其置于塔藓科(Hylocomiaceae)[ 23～ 28] 。本研究的
RAPD结果表明 ,此种与绢藓(Entodon)首先聚在一
起 ,说明赤茎藓与绢藓有一定的亲缘关系 ,从植物
480 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷
体和叶片构造来看二者均十分相象 ,而后 ,二者又
与塔藓科的塔藓和星塔藓聚在一起 ,表明该种与塔
藓科植物近缘。因此 ,目前将其置于塔藓科中是合
适的 。
3.3　关于两个东亚特产属———褶叶藓和粗枝藓的
分类地位问题
褶叶藓属(Okamuraea)主要分布在中国 、朝鲜 、
日本和俄罗斯远东地区 。本属曾置于垂枝藓科
(Hyitidiaceae )[ 2 , 23] , 现 多 置 于 薄 罗 藓 科
(Leskeaceae)[ 24 , 28～ 30] 。从本研究结果来看 ,本属与
垂枝藓 、拟垂枝藓 、粗枝藓三个种先聚在一起 ,可能
说明本属与垂枝藓科植物更近缘 ,由于本研究没有
涉及薄罗藓科种属 ,上述结果当否还需进一步研
究。
粗枝藓(Gollania)主要分布在中国 、日本 、朝鲜
和喜玛拉雅山区 。本属多置于灰藓科 ,而高谦[ 9]将
其归属于垂枝藓科 ,与本研究 RAPD 分析结果相
近。
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