全 文 ：第 22 卷　第 2 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002年　4 月
Vol.22　No.2　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Apr., 　2002
根癌农杆菌介导 GUS基因对白桦转化的研究
于景华　祖元刚　孔　瑾　石福臣　聂明珠　唐中华
(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室 , 哈尔滨　150040)
摘　要　本文报道了根癌农杆菌介导 GUS 基因转化白桦叶盘的研究方法 ,对转化过程中各种因
素进行了全面探讨 ,结果表明:白桦叶盘对卡那霉素的敏感实验 ,得出最适筛选浓度为 50mg/l;对
头孢霉素和羧苄青霉素的抑菌实验 ,最适抑菌浓度为 500mg / l;100μM AS 的加入可将抗性不定
芽的诱导率提高 3倍;3 ～ 4d的预培是最适合叶盘转化的时间;10 ～ 20min是最适合叶盘浸染的时
间;3 ～ 4d的共培养对于叶盘转化比较合理 。在上述最适合的转化条件下 ,农杆菌介导的 GUS 基
因对白桦叶盘的转化获得了抗性再生植株 ,转化率为 2.8%。
关键词　白桦;叶盘法;GUS基因;基因转化;根癌农杆菌
THE STUDYONAGROBACTERIUMTUMIFACIENS-MEDIATED TRANSFORMATION
FORWHITEBIRCH(BETULA PLATYPHYLLA)FLASK CONTAINING GUS
YU Jing-hua　ZU Yuan-gang 　KONG Jin　SHI Fu-chen　NIE Ming-zhu　TANG　Zhong -hua
(Key Labo rato ry of Forest Plant Ecolog y , Ministry of Education , P.R.China , Harbin , 150040)
Abstract　Agrobacterium tumifaciens-mediated transformation fo r leaf disc of Betula platyphy lla
containing GUS w as investigated and facto rs on Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer
is also discussed in detail.The opt imal concentration of kanamycin to strain fungus is 50mg/ l and of
carbenicillin and cefotaxime is 500mg/ l.Regeneration ratio of advent itious buds will improve 3-fold
by adding of 100μM AS to regeneration medium.The optimal pre-cultivation period for leaf disc
t ransformation is 3 ～ 4 days , the ideal time for leaf disc dipping in Ag robacterium is 10 ～ 20 minutes ,
and the optimal co-cultivation is 4 days.Transfo rmed plants of white birch were obtained under
above condi tions and the t ransformation rate is 2.8%.
Key words　White bi rch;Leaf disc;GUS gene;Gene transformation;Agrobacterium tumifaciens
　　白桦(Betula platyphyl la Suk.)是我国东北次
生林的主要树种之一 ,生长迅速且对环境适应能力
强 ,但是干形不好 ,材质差 ,可利用率低 。将具有提
高植物体纤维素含量的 UDPG-Ppase 基因对白桦
进行转化 ,对于培育速生 、纤维素含量高的优良纸浆
用材林新品种有重要意义 。
根癌农杆菌介导的转化是自然界存在的完美转
化系统 ,具有操作简便 、培养周期短等优点 ,而且导
入的外源基因插入的拷贝数低 、插入的目的基因完
整 ,外源基因的整合率和表达率高 。因此 ,根癌农杆
菌介导的转化已成为目前被广泛接受并大量使用的
常规转化手段 。但由根癌农杆菌介导的白桦的转化
还未见报道。
在农杆菌介导的成功转化中 ,叶盘外植体占了
第一作者简介:于景华(1972-),男 ,讲师 ,主要从事植物分子生态学研究。
国家自然科学基金资助项目(39870634)
收稿日期:2001-09-20
65%以上[ 1] ,叶盘再生体系是最适于根癌农杆菌转
化的再生体系。本文即在已经建立高效的白桦叶盘
再生系统的基础上[ 2] ,对根癌农杆菌转化白桦叶盘
的各项影响因素进行了详细研究 ,导入了报告基因
GUS基因 ,优化各种参数 ,确定最佳转化条件 ,建立
了一个完整 、可靠的白桦叶盘转化体系 。
1　材料
1.1　植物材料
桦树种子采自小兴安岭。轻轻搓去种子的双
翅 ,流水冲洗 , 75%乙醇处理 30s。无菌水浸种 48h
后再用75%乙醇处理30s ,然后用 5%的次氯酸钠处
理12 ～ 17min 。将灭菌后的种子接种在 1/2MS 培
养基上 , 在光照培养箱中萌发 , 光强为 1000 ～
1500Lux ,光照周期为 16h /8h ,温度为 22℃±1℃,
在相同条件下对白桦无菌苗进行继代培养。
取无菌苗 1cm ～ 1.5cm 的叶片为实验材料 ,每
测试使用 20个叶盘外植体。
1.2　供试菌株及质粒
根癌农杆菌菌株为 LBA4404 , 供试质粒为
pBI121 ,该质粒携有 GUS 基因 ,其启动子为 35S 启
动子 ,筛选标记基因为 nptII 。
1.3　供试培养基
1.3.1　诱导培养基
C2:MSB5 +1.0mg/ l BA +0.2mg/ l NAA +
30g/l蔗糖
1.3.2　培养根癌农杆菌培养基
YEB培养基:胰蛋白胨 5 g/ l ,牛肉浸膏 5 g/ l ,
酵母提取物 1 g/ l ,MgSO4·7H2O 0.493 g/l ,蔗糖 5
g/ l ,pH 值 7.0。
1.3.3　转化用植物培养基(见表 1)
2　实验方法
2.1　卡那抗性梯度实验
配置含 10 ～ 100mg/ l卡那的诱导培养基 C 2 ,
以 10mg/ l为梯度 ,将叶盘外植体分别接入各梯度培
养基 ,两周后统计结果。
2.2　根癌农杆菌介导的转化
2.2.1　菌体的获得
用灭菌的牙签挑取根癌农杆菌 LBA4404
(pBI121)单菌落 , 分别在 YEB 、YEB -AS(含有
100μM AS)培养基中 28℃, 180rpm 振荡培养 ,培养
基中含有卡那霉素 50mg / l、链霉素 300 mg / l 、利福
平 100 mg / l。培养大约 2 ～ 3d ,当菌液 OD值达到
0.5 ～ 0.6时 ,菌体处于对数生长期 ,可用于转化 。
　　表 1 叶盘转化用培养基
Table 1　Different transformation medium of leaf discs
名称 Name 培养基Medium
预培养培养基
Pre-cultivation medium C 2
悬浮培养基
Medium for suspending
C 2(pH 5.2)
共培养培养基
Co-cult ivation medium C 2
筛选培养基 I
Select ive medium Ⅰ
C 2+500mg/ l car
+50mg/ l kan
筛选培养基 II
Select ive medium Ⅱ
G+500mg/ l car.
+50mg/ l kan
筛选培养基 III
Select ive medium Ⅲ
E+500mg/ l car.
+50mg/ l kan
筛选培养基Ⅳ
Select ive medium Ⅳ
R1/R2+500mg/ l cef.
+50mg/ l kan
　　注:G　MSB5+0.1mg/l GA3+0.4mg/ l BA+30g/ l sucrose
E　MSB5+0.5mg/ l BA+20g/ l sucrose
R1　1/ 2MS+0.1mg/ l NAA+40mg/l sucrose
R2　1/ 2MS+0.1mg/ l NAA+40mg/l sucrose
2.2.2　预培养
在进行转化前 ,将叶盘外植体分别接入诱导培
养基 ,进行 2d 、3d 、5d 、7d的预培养 。
2.2.3　转化
图 1　叶盘外植体的卡那梯度实验
Fig.1　The gradient experiment o f kanamycin
to leaf disc explants
将菌液离心后 ,去上清 ,用等体积 pH 为 5.2 、5.
5的诱导培养基 、无激素培养基或 AS 诱导培养基
(含 100μM AS/200μM AS)、无激素 AS培养基(含
100μM AS/200μM AS)重悬 ,以除去培养物中残存
的抗生素和细菌代谢物。将供试叶盘外植体在重悬
后的菌液中分别浸染 1min 、2min 、3min 、5min 、
10min 、15min 、20min 、30min 后取出 ,在灭菌的滤纸
上吸取多余的菌液 ,置于诱导培养基或 AS 诱导培
养基(含 100μM AS/200μM AS)上。
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2.2.4　共培养时间对转化率的影响
将转化过的叶盘外植体在 22℃分别共培养 2d 、
3d 、4d 、5d 、7d。
2.2.5　抑菌剂的抑菌梯度实验
将转化过的叶盘外植体分别接种于含 200 mg
/ l 、300 mg / l 、400 mg /l 、500 mg /l头孢霉素 ,含200
mg /l 、300 mg / l 、400 mg / l 、500 mg / l羧苄青霉素
的诱导培养基中 ,两周后观察结果 。
2.2.6　抗性植株的再生
将完成共培养的供试外植体转至筛选培养基 Ⅰ
中并于光照培养箱中培养(条件同 1.1)。
将抗性芽和抗性愈伤转入筛选培养基 I I 及筛
选培养基 III 中进行伸长和继代筛选 ,培养条件同
上。
将抗性再生苗转入筛选培养基Ⅳ中进行生根筛
选培养。
3　实验结果
3.1　卡那筛选浓度的确定
卡那筛选浓度的确定对转基因植物的获得非常
重要。实验结果表明 ,50mg/ l的卡那浓度是叶盘的
最佳筛选浓度 ,在此浓度下 ,叶盘外植体的致死率几
乎达到 100%,而且与相差 10mg/ l卡那 、含抗生素
更高的培养基致死率相当 ,因此确认其为最佳筛选
浓度 。
3.2　抗性植株的获得
转化后将叶盘外植体在无抗生素的培养基上经
过3 ～ 4d的共培养 ,直接转入含卡那的培养基上进
行第一轮筛选 ,然后分别转入伸长和继代筛选培养
基进行第二轮和第三轮筛选 ,然后在生根筛选培养
基中进行第四轮筛选 。
大约经过 1 ～ 2周 ,转化后的外植体有部分开始
白化(叶盘和下胚轴)或褐化(茎段)。20d后叶盘边
缘出现少量抗性芽点 ,其启动速度低于非选择条件
下的材料 ,未经转化处理的对照实验与非选择条件
下的转化材料无显著差异 。转入第二轮筛选培养基
培养 3 ～ 4周 ,白化和褐化现象更为明显 。在进行为
期一个月的第三轮筛选后 ,大部分抗性芽正常生长 。
最终经过卡那的筛选 ,获得了叶盘来源的抗性再生
植株 。
实验结果表明 ,运用根癌农杆菌转化体系通过
叶盘诱导不定芽并再生抗性植株是成功的。但是转
化率较低(见表 2),该体系尚需进一步完善 。
　　表 2 叶盘抗性不定芽的诱导率和抗性苗的再生率
Table 2 The induction percentage of resistant adventitious buds and the regeneration
percentage of resistant shoo ts from leaf discs
　叶盘数
Number of
leaf discs
诱导出抗性不定芽数
Number of induced
resistant adventi-
tious buds
不定芽诱导率
Induction rat io of
adventi tious buds
抗性再生苗数
Number of resis-
t ant regenerat ion
shoots
不定芽伸长率
Elongation rat io of
advent itious buds
　转化率
Rat io of
transformation
对照
Cont rol
100 66 66% 33 50%
转化叶盘
Leaf discs for
t ransformat ion
300 18 6% 8 44% 2.8 %
3.3　抑菌剂浓度对抑菌的影响
实验结果表明 ,头孢霉素和羧苄青霉素都能很
好的抑制农杆菌。羧苄青霉素的抑菌能力较强 ,在
300mg/ l时就能将菌完全抑住;头孢霉素在500mg/l
能起到很好的抑菌效果(见表 3)。
　　表 3 抑菌剂浓度对抑菌的影响
Table 3 Effect of antibiotics concentration on bacteria
羧苄青霉素浓度(mg / l)
C oncentration of carbenici llin(mg / l)
头孢霉素浓度(mg /l)
Concentration of cefotaxime(mg / l)
200 300 400 500 200 300 400 500
抑菌效果
Ef fect of bacteria-rest rained — + + + — — — +
　　注:+表示起到抑菌效果 , — 代表没有抑菌效果。
　　Note:+means it has the ef fect of rest raining bacteria , — means it has no that effect.
3.4 预培养时间对转化的影响 农杆菌对植物带来的损伤也很大 ,如果同时进
2492 期　　　　　　　　　　　　　于景华等:根癌农杆菌介导 GUS 基因对白桦转化的研究
行浸染 ,大量外植体会直接死去 ,经过预培养阶段使
植物对创伤有所适应和反应对提高农杆菌介导的转
化率十分重要。预培养的时间因各种植物启动脱分
化或再分化的时间各异 ,启动快 、耐受能力强的物种
(如烟草),预培养几乎不影响转化率。
实验结果表明 ,预培养的时间对白桦叶盘的转
化率有很大影响 ,当预培养时间超过 4d ,叶盘产生
的不定芽很快在筛选培养基上白化 。这是由于不定
芽是多细胞来源的 ,如果转化前分化已经启动 ,这就
使再生芽成为嵌合体的机率增大 ,因此嵌合芽在筛
选培养基上逐渐白化 。当预培养时间短于 3d时 ,外
植体的恢复尚不充分 ,转化致死率较高 ,因此 ,预培
3 ～ 4d比较合理(见图 2)。
图 2　预培养天数对致死率的影响
Fig.2 Effects of pre-cultiva tion day on ratio of lethality
3.5　重悬培养基 pH 值对转化的影响
在 pH值为 5.2时获得了最高的抗性芽诱导率
(见图 3)。
图 3　重悬培养基 pH 值对抗性芽诱导率的影响
Fig.3 Effects of the pH in resuspended medium
on induction ratio of resistant buds.
3.6　重悬培养基中分裂素的附加对转化的影响
附加了细胞分裂素的重悬培养基获得了高于无
激素培养基的一倍的转化率。在农杆菌介导的转化
中 ,目的基因的插入区一般是转录活跃区[ 3] , 因此
当细胞分裂活跃 ,大量基因启动进行转录表达时 ,外
源基因的插入机率随之增大。因此在重悬培养基中
加入细胞分裂素有助于提高转化率 。
3.7　转化时间对转化率的影响
浸染 10min以下的外植体转化率为零 ,浸染时
间超过20min后 ,抑菌比较困难 ,外植体的致死率也
大大增高 ,因此 10 ～ 20min的转化时间比较适宜。
3.8　共培养时间对转化率的影响
共培养超过 4d时 ,抗性芽的诱导率极低 ,且在
后继的培养中逐渐白化 ,再生苗率为零 ,这是由于在
没有选择压力的情况下 ,未转化细胞优先启动形成
了不定芽 。共培养 2d的叶盘外植体转化率也为零 ,
其原因应是外源基因导入是在农杆菌吸附 16h 后开
始的 ,这是涉及一系列基因表达的复杂过程[ 4] ,相
对较短的共培养时间可能不能产生足够大量的转化
细胞 。因此 ,3 ～ 4d的共培养时间比较合理 。
3.9　抑菌剂对抗性再生苗再生的影响
有报道表明头孢霉素对芽的分化有抑制作用而
羧苄青霉素对根的分化有抑制作用[ 5] ,这与本实验
的结果一致。在诱导不定芽的筛选培养基中以羧苄
青霉素为抑菌剂能获得更好的诱导率(见图 4)。
图 4　抑菌剂对不定芽诱导的影响
Fig.4 Effects of antibio tics on induction of adventitious buds
a 羧苄青霉素 carbenicillin;b 头孢霉素 cefotaxime
3.10　乙酰丁香酮对转化率的影响
植物和菌株相互作用的基础是细菌具有趋化
性 ,即菌株对植物细胞所释放的化学物质产生趋化
反应。研究表明 ,根癌农杆菌对一些酚类化合物具
有趋化性。根癌农杆菌 Ti 质粒的 Vir区基因对 T
-DNA的转移起介导作用 ,而这些酚类化合物正是
Vir 区基因活化的诱导物 。其中乙酰丁香酮(简称
AS)已被证明是诱导效果最好的酚类化合物[ 6 ,7] 。
250 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　22 卷
图 5　乙酰丁香酮浓度对抗性不定芽诱导率的影响
Fig.5　Effects of acetosy ringone concentration
on induction of resistant adventitious buds
因此 ,在实验中添加了适量的 AS ,从图 5中可以看
出其促进了根癌农杆菌的转化 ,达到了预期的效果 。
添加 AS 后 , 诱导率提高了 3 倍 , 100μM AS 和
200μM AS的诱导率几乎相同 ,因此 100μM AS 较
为适宜。
4　讨论
为了进一步提高根癌农杆菌转化白桦的转化频
率 ,更好地优化该转化体系 ,需要在以下几个方面做
深入探讨:
农杆菌有效地附着于植物细胞上是保证将其 T
-DNA进入寄主植物细胞的前提 ,目前已经知道根
癌农杆菌染色体上至少有 6个基因与其附着功能有
关(Hawe ,K.C.,1989 , Thomashow ,MF , 1987),他
们或通过影响鞭毛形成及行动 ,或通过影响葡聚糖
的合成以及细菌细胞壁脂多糖(LPS)的成分来最终
影响农杆菌对植物的吸附 。Lippinco tt 等(1980)认
为:PS 是细菌识别植物细胞壁附着位点的成分 ,所
以不同根癌农杆菌菌株染色体背景差异对其附着功
能产生一定影响 ,因此 ,选择合适菌株对成功转化白
桦必要的工作。本实验所用菌株 LBA4404 是章鱼
碱型的 ,它的染色体背景是 Achs ,生长慢 ,菌株在培
养过程中结球 ,难于操作 ,培养后不易洗掉。可以尝
试生长快 、不结球的胭脂碱型或琥珀碱型的菌株 ,尤
其是琥珀碱型的菌株具有极强的浸染能力。
另外 ,根据有关文献 ,在共培养体系中添加对农
杆菌表现强烈趋化性的精氨酸类物质 ,刺激细菌鞭
毛的转动并提高其菌体涌动能力 ,有利于细菌去寻
找和发现宿主细胞表面的附着位点[ 8 , 9] 。
参　考　文　献
1.Abu-Quaoud H , et al.I nfluence of nitogen form and NH4
-N/ NO3 -Nratios on adventitious shoo t formation from
pear leaf explant in vitro..Plant Cell Tissue O rgan Cult ,
1991;27:315 ～ 319
2.石福臣 , 孔瑾 , 吴双秀 , 等.以叶盘为外植体的白桦的再
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3.Maheshw aran G , et al.T ransfo rmation of apple rootstock
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4.M Confalonieri , et al.Genetic transformation o f Populus ni-
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5.Manorama C , et al.Expression o f an Agrobacterium T i
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6.G A Moo re, et al.Agrobacterium-mediated transfo rmation
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7.Horsch RB , et al.A simple and general menthod fo r trans-
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8.R S Sangwan , et al.Effect of culture condition on Ag robac-
terium - mediated transfo rmation of Datura.Plant Cell
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9.Rocha SP , et al.In vitro multiplication and Agrobacterium
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