全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 18 卷　第 2 期 1998 年　4 月
Vol.18　No.2 April , 　1998
　　　收稿日期:1997-12-10
低温诱导小麦叶片细胞表面糖蛋白的变化
弭忠祥　胡宝忠　王学东　崔　林　刘秀玫
(东北农业大学 , 哈尔滨 150030)
摘　要　利用细胞化学的方法 ,对经过不同时间低温诱导小麦细胞表面糖蛋白的动态
变化进行了标记定位电镜观察 。小麦幼苗经 2-3℃下低温锻炼后 ,细胞表面的糖蛋白
层出现明显的增厚 ,随之开始逐渐地减少变薄 ,有些细胞表面的糖蛋白层部分脱落于
细胞间隙 。随低温诱导处理时间不同 ,细胞表面糖蛋白层表现出的由少量到增厚 ,最
后部分的脱落减少变薄这一有规律的变化现象表明 ,低温诱导能够引起小麦细胞表面
糖蛋白的合成积累 ,抗寒性较强的冬小麦较非抗寒性的春小麦 ,糖蛋白层增厚的现象
更加明显 ,耐受低温条件的时间也较长 。
关键词　小麦;细胞化学;糖蛋白;抗寒性
THE DISTRIBUTION ON GLYCOPROTEINS
LAYER AT THE CELL SURFACE IN THE LEAVES
OF WHEAT DURING COLD HARDENING
M i Zhong-xiang 　Hu Bao-zhong 　Wang Xue-dong　Chui Lin　Liu Xiu-mei
(Northeast Ag ricultural University , Harbin 150030)
Abstract　Cy tochemical localization of glycopro teins at the cell surface in the leaves of
wheat was observed by electron microscopy using ruthenium red changes in the cell sur-
face , g ly coproteins in cold hardened.the thickness of glycoproteins layer seemed to have
increased during the seedling s hardened at 2-3℃.prolong the time of cold hardened the
gly coproteins layer appeared to have moved into the intercellular spaces and thinner.the
gly coproteins at the cell surface in hardy w inter wheat seedlings appeared richer than
those of non-hardy spring w heat seedling.the results mentioned above suggested that
plant cell surface may be closely associated w ith the plant s ability to resist cold hardi-
ness.
Key words　Tr iticum aestiv um L.;Glycoprotein;Cy tochemist ry;Resist cold hardiness
低温寒害是农业生产中的一种严重的自然灾害 ,全世界每年受此灾害造成的损失十分
巨大 。因此 ,阐明植物细胞的抗寒机制及决定此抗寒性的遗传因素 ,是当代植物分子生物学
研究中重大问题之一 。然而上述工作的基础是要找出与此有关的蛋白和抗性基因。
近年来发现 ,植物细胞表面糖蛋白不仅与细胞识别有关 ,而且与多种植物病害有着密切
的关系 ,它的合成积累还涉及到植物的抗性表现〔4 , 6〕 ,因此引起人们的普遍关注。最近的一
些研究表明它与植物的抗寒性也有着密切的关系〔2 , 5〕。以往关于植物抗寒性的研究 ,主要
集中在水的平衡 、碳水化合物 、核酸及蛋白质的含量 ,氨基酸 、脂的不饱和性 ,细胞壁的特性 ,
质膜的改变和膜的稳定性 ,植物的生长调节剂以及细胞骨架的完整性等方面。上述所提及
的这些因素 ,或多或少与抗寒力的增加有关 ,但是真正的因果关系至今还未揭示出来 。细胞
表面糖蛋白与植物抗寒性的关系 ,利用生化手段从其含量上已有一些研究报导〔8〕 。而采用
细胞化学的方法 ,对其形态学的描述迄今知之甚少 。
本文利用电子显微镜 ,通过细胞化学的方法 ,对小麦细胞表面糖蛋白进行了定位观察 ,
发经过低温诱导 ,能够引起小麦细胞表面糖蛋白从其含量和形态上表现出有规律性的变化。
1.材料和方法
1.1　实验材料　小麦(Trit icum aest ivum L.)采用两个品种 ,抗寒性强的冬小麦伊农 13和
不抗寒的春小麦东农 121。将两个品种的种子在水中浸泡 24小时后 ,播种于培养皿内的润
湿滤纸上 ,置于 25℃恒温箱中萌发生长 2天 ,随即转移到 2-3℃冰箱内低温诱导处理 40
天 ,每隔 5天取出一批放入 25℃恒温箱中继续生长 ,待幼苗长至约高 1.5 厘米左右 ,取第一
片真叶作为实验材料 ,对照组不经过低温诱导处理 。
1.2　实验方法　上述实验材料切取小于 0.5x l毫米大小的组织片 ,迅速投入到 50mmolL-1
二甲胂酸纳缓冲液(PH6.8)配制的 2.5%戊二醛+1000ppm(1mg/ml)钌红混合液中 ,于室
温 ,黑暗条件下固定染色 2小时 ,其间不断震荡并更换一次新液。用含有 500ppm 钌红的二
甲胂酸纳缓冲液(PH6.8)洗涤三次 ,每次 5-10分钟 ,随后用二甲胂酸纳缓冲液(PH6.8)配
制 2%锇酸+500ppm 钌红混合液 ,在室温 ,黑暗条件下二次固定染色 3小时上述缓冲液冲
洗后 ,用双蒸水洗3次 ,并迅速通过丙酮系列脱水 ,环氧树脂 Epon812包埋 , LKB-V 型超薄
切片机切片 ,厚度 500-700埃 。不经铀 、铅染色直接于 JEM-1200EX型透射电镜下观察 ,
拍照 。对照组不加钌红其它条件相同。
2.结果与讨论
2.1　钌红显示细胞表面糖蛋白定位与分布
小麦叶片细胞表面糖蛋白 ,经钌红特异性染色处理 ,在电镜下表现出很高的电子密度 ,
均匀的定位于细胞间隙周围游离的细胞壁表面 ,紧贴细胞壁的部分比较致密 ,外部边缘松
散 ,有些呈现为絮状 ,厚度一般在 40-60nm之间(图1),在细胞壁内及紧密相连的细胞之间
没有显示出钌红的阳性反应(图 2)。糖蛋白是高等植物的细胞壁中普遍存在的一种结构蛋
白 ,含有寡糖和肽链两部分 ,钌红能特异性的结合显示糖蛋白的存在部位 ,在光镜下呈现出
褐色 ,在电子显微镜下表现稠密的电子密度 ,产生强的电子反差 。未加钌红处理的叶片组织
细胞壁表面 ,没有显示出如上所述的高电子密度物质。钌红用于标记定位细胞表面糖蛋白 ,
是由 Ramboung , A.(1971)和 Luf t , J.H.(1976)等人最初用以动物组织细胞表面糖蛋白
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的标记显示 ,具有很高的特异性 ,在植物方面的研究报道不多 ,我们曾用于钌红标记显示大
豆细胞表面的糖蛋白并获得成功〔1〕 ,与在小麦中研究的结果基本一致 ,这些结果进一步证
明 ,钌红不仅是显示动物细胞表面糖蛋白的一种有效方法 ,对植物细胞壁表面糖蛋白的标记
定位显示也是一种很好的方法 。
2.2　低温诱导小麦细胞表面糖蛋层形态学的动态变化
图 3 ,和图 4分别显示抗寒品种冬小麦伊农 13和不抗寒的春小麦东农 121 ,未经低温诱
导处理的细胞表面糖蛋白层的定位分布情况 ,比较可以看出 ,抗寒性冬小麦幼苗叶片细胞壁
表面的糖蛋白层较不抗寒的春小麦显得丰富 。但是上述两个品种小麦种子经萌发培养 ,低
温诱导处理后 ,不论是抗寒品种冬小麦伊农 13和不抗寒的春小麦东农 121。叶片细胞表面
的糖蛋白层最初均表现出增厚的趋势 ,并随着低温条件处理时间的加长 ,糖蛋白层表现出脱
落现象 ,已脱落的糖蛋白分布于细胞的间隙 ,糖蛋白层出现减少变薄 。值得注意的是 ,抗寒
性冬小麦品种伊农 13 ,经低温诱导处理后 ,叶片细胞表面糖蛋白层的增厚较不抗寒春小麦
东农 121更加显著。图5显示伊农 13冬小麦幼苗经 2-3℃低温诱导处理20天的细胞表面
糖蛋白层增厚的情况 ,较未经低温处理同一品种对照组图 3 所示细胞表面糖蛋白层增厚约
20-30nm ,而不抗寒的春小麦品种东农 121 ,糖蛋白层增厚不如前者明显(图 6),而且糖蛋
白层的增厚主要表现在低温处理的前 10天有增厚的趋势 ,随后已开始有一些糖蛋白层从细
胞壁的表面脱落于细胞间隙。经过 20天的低温处理以后 ,春小麦东农 121细胞表面糖蛋白
层已有大部分脱落于细胞的间隙 ,在细胞壁的表面还能观察到少量残留的糖蛋白(图 7)。
低温处理 40天的冬小麦伊农 13 ,细胞表面糖蛋白层也出现大部分的脱落现象(图 8)。只是
在糖蛋白出现脱落时 ,较前者在低温处理的时间上有所推迟 。
上述两个品种的小麦幼苗经 2-3℃低温诱导分别处理 5 、10 、15 、20 、25 、30 、35 、40天后
细胞表面糖蛋白层厚度的动态变化曲线如图 1:
图 1　随着低温处理的时间小麦细胞壁表面糖蛋白层厚度的动态变化
Fig.1　The thickness of glycoproteins layer w as different during cold hardening
抗寒品种伊农 13 ,小麦幼苗经低温处理前 20天 ,细胞表面的糖蛋白层的增厚呈现上升
1912期 弭忠祥等:低温诱导小麦叶片细胞表面糖蛋白的变化
的趋势 ,随之趋于平稳 ,随着低温处理时间的加长 ,糖蛋白层表现出有脱落的现象 ,逐渐减少
变薄。不抗寒的春小麦品种东农 121 ,幼苗经低温诱导处理 ,细胞表面的糖蛋白层表现出增
厚的现象主要集中在前 5-10天 ,经低温诱导处理 20天后 ,细胞表面的糖蛋白层开始大部
分脱落于细胞的间隙 ,在细胞壁的表面仅有少量残留的糖蛋白。
从上述观察的结果来看 ,低温诱导不论是抗寒性冬小麦和非抗寒性的春小麦 ,都能够引
起小麦细胞表面的糖蛋白层的增厚 ,随着低温处理时间的加长均表现出由薄到厚 ,最终大部
分的脱落减少变薄这一有规律的变化。分析其原因可能是 ,低温条件起到了一种由于环境
因素的改变造成的一种诱导信号 ,促使合成糖蛋白基因的表达 ,大量合成新的糖蛋白在细胞
壁表面的堆积 ,表现出糖蛋白层的增厚 。Ecker〔3〕和 Show alter〔7〕等人 ,对细胞表面的糖蛋白
抗性机制的研究中指出 ,环境因素的改变如机械损伤 ,病原菌的侵染都能够诱导糖蛋白迅速
的合成积累 ,而且细胞内合成糖蛋白的 mRNA含量也相应的提高。我们上述观察的结果表
明 ,低温处理同样能够引起小麦细胞表面糖蛋白层的增厚 ,低温是一个诱导的因素。低温促
使细胞表面糖蛋白层增厚的意义 ,可能在于糖蛋白在细胞的游离表面起着加固和保护作用 ,
以防止细胞间隙结冰时冰晶对细胞的机械损伤。
随着低温处理时间的加长 ,细胞表面糖蛋白层引起脱落的原因 ,推测有两个方面的可
能 ,一方面由于低温引起细胞的代谢活动降低 ,糖蛋白的合成受到影响 ,新合成的糖蛋白不
能给以及时的补充 ,已有的糖蛋白层逐渐丧失其功能 ,表现出从细胞壁的表面脱落于细胞的
间隙;另外一种可能是 ,植物对低温寒害表现出的一种生理反应 ,糖蛋白大量地从细胞壁的
表面脱落于细胞的间隙中 ,以增加细胞间隙的渗透压 ,降低冷冻点与再结晶点的温差 ,从而
使冰晶带来的损伤降到最小。
抗寒品种冬小麦伊农 13与不抗寒品种春小麦东农 121 ,经不同时间的低温处理后 ,细
胞表面糖蛋白的变化存在有一定的差异 ,前者糖蛋白层增厚的趋势更为显著 ,且糖蛋白层在
细胞壁表面保持的时间也较后者长 。糖蛋白在上述两个品种中的不同表现是否与小麦的抗
寒性有着密切的关系 ,以及引起两者差异的内在本质 ,还有待于进一步研究 。
参　　考　　文　　献
1.弭忠祥等.大豆叶片细胞表面糖蛋白形态与功能的研究.电子显微学报 , 1995 , 14(4):252-254
2.简令成等.抗寒锻炼中不同抗寒性小麦细胞膜糖蛋白的细胞化学研究.实验生物学报 , 1991 , 24(3):249-257
3.Ecker JR , Davis RW.Plant defense genes are regulated by ethylene.Proc Nat l Acad Sci USA , 1987 , 84:5202
4.Hori T , Y.Saito.Dif ference of lectin binding sites in Human Pituitary Adenom a Cells.J.Histochem .Cytochem ., 1983 ,
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5.Jian ling-cheng et a l.Glycoproteins at the cell Surface in Cold hard and Cold tender w heat.P lant biol., 1987 , 5:59-66
6.Show alter A , Varner J.In manus A(ed)The Biochemist ry of plants:Acomplihensive T reatise Vol.15.Molecular biology
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Proc Na tl Acad Sc i USA., 1985 , 82:6551
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图　　版　　说　　明
图版Ⅰ 　1.在 25℃生长的幼苗叶片细胞表面糖蛋白 ,经钌红染色被定位分布于游离的细胞壁表面 , Is:细胞间隙 W:细
胞壁 箭头示糖蛋白层 , ×30000;　2.在细胞壁内及紧密相连的细胞之间没有显示出钌红的阳性反应 , ×27000;　3.抗
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寒性冬小麦品种伊农 13 ,细胞表面糖蛋白的分布 , ×25000;　4.不抗寒春小麦品种东农 121 ,细胞表面糖蛋白的分布 , ×
25000;　5.伊农 13冬小麦幼苗经 2-3℃低温诱导处理 20天 ,糖蛋白层表现出增厚, ×25000;　6.东农 121春小麦幼
苗经 2-3℃低温诱导处理 10天 ,细胞壁表面糖蛋白层已有部分的脱落于细胞间隙 , ×25000;　7.东农 121春小麦幼苗
经 2-3℃低温诱导处理 20天 ,细胞壁表面仅有少量残留的糖蛋白层 , ×27000;　8.伊农 13冬小麦幼苗经 2-3℃低温
诱导处理 40天 ,细胞壁表面糖蛋白层表现出脱落的现象 , ×30000。
Explanation of plate
PlateⅠ Fig.1 Leaf cells f rom the seedling grow n at 25℃.the glycoproteins exhibi ted by staining w ith ruthenium red w ere local-
ized at the f ree surfaces of leaf cells bordering the intercelluar spaces , Is:intercellular space W:cell w all ↑:glycop rotein , ×
30000;Fig.2 Disappeared reaction of ruthenium red in the inside of cell w all and close part of cell with cell , ×27000;Fig.3
Hardy w inter wheat variety Yinong No.13 , the glycoprotein layer w as observed at the cell surface , ×25000;Fig.4 Non-
hardy spring w heat variety Dongnong No.121 , the glycoprotein layer was observed at the cell su rface , ×25000;Fig.5 The
thickness of glycoproteins layer seemed to have increased during cold hardening in hardy w inter w heat seedling hardened for 20
days at 2-3℃, ×25000;Fig.6 Non-hardy spring w heat seeding hardened for 10 days at 2-3℃ glycoproteins layer appeared
to have moved into the intercellular space;Fig.7 Non-hardy spring w heat variety Dongnong No.121 seedlings w ere t reated for
20 days at 2-3℃, the glycoproteins layer appeared thinner or completely absent , ×30000;Fig.8 Hardy w inter w heat variety
Yiong No.13 , the seedlings w ere t reated for 40 days at 2-3℃, the glycop rotein layer appeared to have moved in to the intercel-
lular space , ×30000.
1932期 弭忠祥等:低温诱导小麦叶片细胞表面糖蛋白的变化