全 文 ：第 25卷　第 3期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005年　7月Vol.25　No.3　　　　　　　　　　　　BULLETINOFBOTANICALRESEARCH July, 　2005
基金项目:国家自然科学基金(30070056)和中国科学院(KSCXZ-SW-101A, KZCX1-10-01)资助项目
第一作者简介:马清温(1969—),男 ,博士研究生,副教授 ,从事结构植物学研究工作。
＊　通讯作者 Authorforcorrespondence　E-mail:lifl@bjfu.edu.cn
收稿日期:2004-11-16
角质层的离析及显微观察方法
马清温1　张秀省2　李凤兰 1＊
(1.北京林业大学生物科学与技术学院 , 北京　100083)
(2.聊城大学农学院 ,聊城　252059)
摘　要　植物角质层的离析方法很多 ,获取化石植物的角质层可以同时用几种化学处理方法 。舒
氏液浸解是最常用的方法 ,也是几种方法共用时最关键的步骤。浸解液浓度过大或处理时间过长
有可能破坏角质层的结构 。对于已经获取到的角质层 ,利用相差光学显微技术可以增加反差 。利
用微分干涉光学显微技术不仅反差增加 ,而且有立体感 ,背景颜色也可以调节。荧光显微分析技
术在不破坏标本的前提下 ,可以获取到表皮的特征。扫描电子显微镜具有观察不透明物体 ,放大
范围广以及高的分辨力等优越性 ,可作为光学显微镜的必要补充 。
关键词　离析;显微技术;角质层
Methodsofmacerationandmicroscopicalanalysisoncuticle
MAQing-Wen1　ZHANGXiu-Sheng2　LIFeng-Lan1＊
(1.CollegeofBiologicalSciencesandTechnology, BeijingForestryUniversity, Beijing　100083)
(2.CollegeofAgricultureSciences, LiaochengUniversity, Liaocheng　252059)
Abstract　Cuticlesareusualyveryresistantandcanbeisolatedfromthefossilspecimens.Several
methodsofmacerationcanbeappliedinpreparationoffosilcuticles.MacerationinSchulze sreagent
isthemostcommonprocedureanditisthemostcriticalstepinthemethods.Thecuticlesmaybede-
stroyedbystrongmacerationsolutionwithlongertime.Theuseofmicroscopyofphase-contrastisvery
usefulforverythincuticlesasitshowsgreatercontrast.Theuseofdiferential-interferenceisbeterthan
useofmicroscopyofphase-contrastforthesethincuticles, foritenhancesthereliefandmakesfine
structuresvisible.Fluorescencemicroscopyhastheadvantagethatnomacerationprocedureisnecessary
andsothespecimensarenotdamaged.Scanningelectronmicroscopyisanessentialandsupplementary
methodintheanalysisofcuticlesforitproduceshighresolution, scientificalyinformative, three-dimen-
sionalimages.
Keywords　maceration;microscopy;cuticle
角质层是覆盖在植物体表面的一层非细胞结
构 ,植物表皮上各种细胞的形态特征都能在角质层
上反映出来 。很多化石植物保存为枝叶形式 ,表皮
的结构是压型化石(compressionfosils)细胞信息
的重要来源 [ 1] 。在缺少生殖器官的情况下 ,对于
枝叶形态特征相似的化石植物 ,表皮的特征为重要
的鉴定依据 [ 2 ～ 6] 。表皮细胞的形态和排列方式以
及突起和表皮毛等表面附属物在分类鉴定上是非
常重要的特征 。气孔的分布 、排列方式 、开口方向
以及气孔器的形态结构等也是典型的分类特
征 [ 4, 6] 。植物表皮的气孔参数可以指示大气 CO2
浓度[ 7] ,同时表皮的特征为展示进化环节上形态
结构的特征演变与系统联系 [ 8] ,以及植物体的整
体重建和植物的生存环境提供了有用的信息[ 9] 。
本文主要讨论了角质层的获取方法和这些方法对
角质层的影响 ,以及不同的光学显微技术在研究角
质层时的应用。
1　角质层的离析方法及注意的问题
现生植物角质层的离析方法有很多。在利用
扫描电镜观察植物角质层的工作中 , Alvin和 Boul-
ter[ 10]推荐用 CrO3方法离析植物叶片 ,表皮的许多
微细结构可以保留 。单用浓硝酸离析现代植物叶
片 2 ～ 3 h,或单用舒氏液 (HNO3和KClO3的混合
液)5 ～ 15min,一般也可保留保卫细胞的木质化增
厚部分[ 3, 4] 。利用 30%的双氧水(H2O2)和 99%的
冰醋酸(CH3COOH)的混合液(1:1), 60℃水浴处
理几分钟至几天的不同时间 ,获取杉科植物北美红
杉 (Sequoiasempervirens)、水杉 (Metasequoiaglyp-
tostroboides)和水松 (Glyptostrobuspensilis)[ 11 ～ 14]等
叶片角质层 ,光学和扫描电子显微镜观察也可以取
得较好的效果。用透明的指甲油覆盖植物的叶片 ,
指甲油干后撕下 ,观察指甲油薄膜可以获得表皮特
征 。
化石植物标本也可以获取角质层 ,但未经处理
的角质层很容易破碎 [ 1] 。通常用化学方法处理化
石标本 ,以获得大块角质层 。大块角质层可以获得
更多的表皮特征的信息 ,也比较容易统计气孔参
数 。对于不同的化石标本通常用不同的化学处理
方法 ,碳酸盐化石可以用 25%盐酸(HCl)处理。含
硅质的化石可以用45%氢氟酸(HF)处理。对于大
多数碳质化石 ,最好的方法是先用舒氏液处理 ,再
用 5%的碱液 (KOH)或氨液 (NH4 + /OH-)冲
洗 [ 1, 15, 16] 。不同的材料要求用不同浓度的舒氏液
浸解不同的时间 ,强度过大的处理方式有可能损失
部分表皮特征 。强度最小的浸解液是 5% ～ 10%
的次氯酸氢钠(NaHClO2 )和 10% ～ 25%双氧水
(H2O2)。根据化石标本的保存状况不同 ,可以几
种方法共用 ,先除去标本中的钙质和硅质 ,再用舒
氏液浸解。舒氏液浸解是最常用的方法 ,也是几种
方法共用时最关键的步骤。云南中新世红杉属化
石标本角质层的获取是利用舒氏液浸解法[ 17] ,比
其他的处理方法获取到的角质层要好 。高浓度的
硝酸容易使角质层变碎或角质层上的细节消失 ,浓
度过低作用又不明显 ,处理时硝酸的浓度可由低到
高的逐渐增加。根据化石标本的性质和大小不同 ,
有时只用 KOH、氨水或 H2O2处理就可以了 [ 1, 16] 。
用透明的指甲油倾倒在压型化石上 ,然后把粘有角
质层的薄膜从母岩上揭下来 ,直接显微观察有时也
可以获取表皮的特征[ 16] 。只要方法得当 ,有些保
存很好的化石角质层可以见到和现代材料中同样
的细微结构 [ 18] 。
获取植物表皮特征的方法有很多 ,但由于化石
角质层很容易破碎 ,且处理方法不同 ,获取大块的
角质层的机会仍然不多。对于现存植物来说 ,有些
研究工作是把叶片切成小块 ,然后再离析获取角质
层[ 3] 。通过对水杉[ 12] 、北美红杉 [ 11]和水松[ 14]等
杉科植物的研究发现:叶片的上表皮气孔分布有差
异 ,有时在上表皮气孔仅分布在很小的局部区域 。
根据小块角质层得出的部分结论 ,如气孔的分布等
特征 ,有时不能代表整个叶片的情况 [ 6] 。表皮特
征的获得只有在观察一定数量的角质层的基础上
才有分类学的意义 ,现存植物应尽量观察完整的叶
角质层并且具备一定的数量。
杉科的保卫细胞壁普遍增厚[ 11, 12, 14] ,但在制片
过程中 ,增厚的木质素容易溶解。化石标本中的保
卫细胞的增厚结构 ,甚至保卫细胞本身有时没有被
保留 [ 4, 19] 。根据植物材料的不同 ,合理安排试剂和
离析时间 ,可以保留保卫细胞的增厚结构 ,同时也
有利于用不同光学显微技术观察。
2　应用不同的光学显微技术观察植物的角质层
光学显微技术是一项古老的技术 ,也是最常用
的观察植物角质层的方法 。光学显微镜具有速度
快 、费用低和对样品的处理简单等优点。在观察植
物角质层时 ,荧光 、相差和微分干涉等不同光学显
微技术 , 可以利用一台系统显微镜 (如 Olympus
BX50等)的众多功能就可以完成。
对于已经获取到的特定的角质层 ,应用不同的
光学显微技术可以产生许多特定的效果 。研究水
杉 、水松等特别薄 、反差小的植物角质层时 ,用普通
明视野显微镜观察 ,因样品的不同组分对可见光的
吸收程度几乎相同 ,难以分辨其微细结构 ,并且在
装片前一般要经过染色处理 。染色的效果与不同
的染色剂和不同植物的角质层有关。植物角质层
染色过程中也容易变成碎片 ,且染色后 ,除保卫细
胞外的其他部位难以着色 ,观察效果也不理想 。利
用相差显微技术(phase-contrastmicroscopy),可以
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观察到比普通明视野显微镜反差更大 、更清晰的效
果 。在相差显微镜中 ,光线通过样品上不同密度区
域的光程差之间不同步 ,即产生了光程差 ,并因此
发生不同程度的偏移 。相差显微镜观察的反差是
以样品中的密度差别为基础形成的 ,故相差显微镜
的样品不需染色 ,就可以取得非常理想的效果 。
微分干涉显微技术(diferential-interferencemi-
croscopy)对于特别薄 、反差小的植物角质层时可产
生更好的效果。微分干涉显微镜用的是平面偏振
光 ,光线经棱镜折射后分成两束 ,在不同时间经过
样品的相邻部位 ,然后再经过另一棱镜将这两束光
汇合 ,样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区
别 ,增加了反差并且具有很强的立体感。利用微分
干涉显微技术观察未染色的角质层 , 影像有浮雕
感 ,用白光照明时可产生彩色影像 ,旋转主棱镜旋
钮 ,背景颜色可以连续变化 ,调节到标本与背景的
反差匹配合适 ,可以更清晰的观察植物角质层的特
征 。用微分干涉显微技术观察现生植物水杉 [ 12] ,
北美红杉[ 11]和水松 [ 14]以及化石红杉 [ 17]的角质层 ,
取得了很好的观察效果。
化石植物标本由于保存或处理方法的原因 ,有
时难以得到角质层 ,这时可以考虑利用荧光显微分
析技术 (fluorescencemicroscopy)。这种观察方法
不需要对化石材料进行特殊处理 ,在不破坏原材料
的前提下 ,得到大块的表皮特征 ,并可以进一步用
化学方法处理化石标本[ 1] 。利用荧光显微分析技
术观察山东山旺中新世化石植物叶表面 ,气孔和角
质层细胞形态清晰 ,并且可以统计气孔参数 [ 20] 。
用这种方法观察化石植物的角质层特征比较便捷 ,
但需要标本中含有荧光物质。
研究压型化石标本的表皮特征 ,可以先分离角
质层再进行显微观察 。而印痕化石 (impression
fossils)标本没有保存植物的实体以及角质层。研
究印痕植物化石的表皮特征 ,可以用体视显微镜观
察印痕 ,但由于体视显微镜放大倍数较小 ,有时不
能清晰的观察气孔和表皮细胞的结构 。用透明的
指甲油倾倒在这类化石标本上 ,然后把指甲油薄膜
揭下来 ,再利用不同的光学显微技术观察 。
3　利用电子显微技术研究植物的角质层
扫描电子显微镜自诞生以来 ,已经广泛用于自
然科学的各个领域。目前 ,扫描电子显微镜已成为
研究植物表皮结构的一种比较普遍的仪器设备。
扫描电子显微镜有较大的景深 ,一般不受样品大
小 、厚度的影响 ,能获得具实感的三维物体图象 。
同时扫描电子显微镜具有观察不透明物体 ,放大范
围广以及高的分辨力等优越性 ,特别适于观察分析
样品的表面或断面的微细形态及构造。利用扫描
电子显微镜观察植物的角质层 、化石印痕或复制出
印痕化石表面 ,都能获得表皮的微细结构 ,可作为
光学显微镜的必要补充。
透射电子显微镜观察到的某些角质层的结构 ,
也是可用于植物分类的重要特征。透射电子显微
镜下的现生植物角质层的许多特征在化石植物上
也可以发现 [ 21] 。 Taylor[ 16]描述了制备现生植物和
化石植物角质层用于透射电镜观察的方法 。利用
透射电子显微镜研究植物的角质层 ,不论对现存植
物还是化石植物 ,还不是很普遍的一种方法。
4　结语
角质层分析是古植物学分类研究的一种标准
方法 。在利用表皮特征进行化石植物分类鉴定时 ,
可以利用的表皮特征 ,化学处理过程对角质层的影
响都是需要考虑的因素 。利用不同的光学显微技
术 ,结合电子显微技术 ,可以更充分的获取表皮的
特征 。化石植物对应的现生植物的表皮特征可以
提供参照标准。另外 ,表皮的特征是宏观形态特征
的必要补充 ,而不能作为排他性的分类标准。
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