全 文 ：第 25卷　第1 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2005 年　1 月
Vol.25　No.1　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Jan., 　2005
基金项目:省科技厅攻关课题(GCO4B112)
第一作者简介:李新玲(1975—),女 ,博士 ,助教 ,主要从事植物遗传育种研究工作。
＊　通讯作者 Author for correspondence　E-mail:xxl8761@126.com
收稿日期:2004-11-02
影响小麦成熟胚培养及植株再生因素的研究
李新玲1 , 2 　曲　敏3 　闫玉清1　徐香玲1＊
(1.哈尔滨师范大学生命与环境科学学院 , 哈尔滨　150080)
(2.东北林业大学林木遗传育种教研室 , 哈尔滨　150040)
(3.哈尔滨商业大学食品工程学院生物系 , 哈尔滨　150010)
摘　要　对3个不同栽培品种小麦的成熟胚进行离体培养 ,研究影响小麦愈伤组织诱导和植株再
生的一些因素 。结果表明 ,东农 7742的苗分化率明显高于龙麦 9814和龙麦 26;高浓度的玉米素
可明显提高芽的分化率;附加低浓度 NAA的 1/2 MS 培养基可有效促进生根。可见 ,基因型对小
麦愈伤组织的分化有很大的影响 ,附加一定的外源激素有利于提高植株的再生频率 。
关键词　小麦;成熟胚;愈伤组织;植株再生
Study on the factors of wheat mature embryos culture and
plant regeneration
LI Xin-Ling1 ,2　QUMin3　YAN Yu-Qing1　XU Xiang-Ling1＊
(1.School of Life and Environmental Science , Harbin Normal University , Harbin　150080)
(2.Teaching and Research Section of Forestry Genetics and Breeding , Northeast Forestry University , Harbin　150040)
(3.Biology department of Food Engineering College, Harbin University of Commerce , Harbin　150010)
Abstract　To culture wheat mature embryos from three cultivars in vitro and study the factors of wheat callus
induction and plant regeneration.The result of research shows bud differentiation rate of dongnong 7742 is
much higher than longmai 9814 and longmai 26.ZT with high concentration could increase the rate of bud
differentiation.The bud formation could be stimulated by half amount of culture medium togetherwith NAA of
low concentration.So the genotypes have great influence on wheat callus differentiation and to add certain
amount of hormone could increase the rate of plant regeneration.
Key words　wheat;mature embryos;callus;plant regeneration
小麦是重要的粮食作物之一 ,在世界范围内种
植面积及总产量均超过了其它作物 。目前 ,随着生
物技术的发展 ,利用生物技术的方法改良小麦品种
资源越来越受到重视[ 1] 。植物组织培养技术的兴
起 ,使小麦无性系的利用及建立小麦的遗传转化体
系等方面的研究取得了一定的进展 。目前 ,国际上
仅有少数实验室小麦遗传转化获得了成功[ 2～ 4] ,主
要原因是小麦的离体再生比较难 ,严重地阻碍了小
麦基因工程工作的顺利进展 。研究小麦组织培养
条件和植株再生的影响因素是小麦生物技术育种
的一个亟待解决的重要课题 。在小麦幼穗 、幼胚和
成熟胚培养中 ,幼穗 、幼胚愈伤组织具有较高的再
分化能力[ 5～ 7] ,成熟胚同幼胚 、幼穗相比虽然其愈
伤组织的芽分化频率较低 ,但种子保存期长 ,易于
获取 ,且不受生长季节 、植株发育时期等因素限制 ,
是进行小麦基因转化的良好受体[ 8] 。因此 ,本文对
小麦成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生频率的影
响因素进行了系统的研究 ,旨在探索小麦成熟胚愈
伤组织诱导 、植株再生的有效方法 ,建立一套合适
的植株再生体系 。
1　材料与方法
1.1　植物材料
供试小麦品种东农 7742 ,由东北农业大学农
学系小麦作物生理实验室提供;龙麦 9814和龙麦
26由哈尔滨师范大学生物系遗传研究室提供 。
1.2　培养基
(1)愈伤组织诱导培养基:N6+1 g/L水解酪蛋
白+30 g/L蔗糖+2 mg/L 2 , 4-D +0.8%琼脂 , pH
5.8 。
(2)分化培养基(2种):B1:MS+10 mg/L ZT+
20 g/L 蔗糖 +0.8%琼脂 , pH 5.8;B2:MS +
0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L ZT +30 g/L蔗糖+0.8%
琼脂 ,pH 5.8。
(3)生根培养基(2 种):C1:1/2MS 盐+MS 维
生素+15 g/L蔗糖+0.8%琼脂 ,pH 5.8;C2:1/2MS
盐+MS 维生素 +0.2 mg/L NAA +30 g/L蔗糖+
0.8%琼脂 ,pH 5.8。
1.3　小麦种子含水量的测定
取收获后保存了 8个月的麦粒饱满的成熟种
子100粒 ,在 40℃烘箱中干燥24 h ,根据干燥前后
麦粒重量的变化 ,计算出小麦种子的含水量。
1.4　外植体的获得
选择麦粒饱满的成熟种子 , 在无菌条件下 ,
0.1%HgCl2浸泡8 min ,无菌水冲洗 3 ～ 4遍 ,置于适
量无菌水中 ,在 27±1℃培养室中浸泡 24 ～ 48 h 。
70%乙醇消毒1 min , 无菌水冲洗 1 ～ 2 遍 , 再用
0.1%HgCl2消毒12 min ,无菌水冲洗 5 ～ 6遍 ,将胚
取出 , 盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基上 ,
27±1℃暗培养 ,将萌发的芽切除 ,保留愈伤组织 ,
进行继代培养。
1.5　愈伤组织的继代 、分化及再生
挑选淡黄色 、结构较致密的愈伤组织 ,转接到
新鲜的愈伤诱导培养基上 ,大约每 2周继代一次 。
选择呈淡黄色 、颗粒状结构的胚性愈伤组织 ,转到
分化培养基中诱导芽的分化 , 光照15 h/d , 光强
2 500 ～ 3 000 Lux ,温度 27±1℃。当分化出来的芽
长至 2 ～ 3 cm时 ,转至生根培养基中生根。
1.6　再生植株的移栽
将再生植株的瓶口敞开 ,室温下练苗 3 ～ 4 d ,
幼苗分两步移栽 ,首先用水冲洗净根部的培养基 ,
移到蛭石中 ,待幼苗成活后 ,移入土中 。
2　结果与分析
2.1　小麦种子含水量和浸种时间对出愈率的影响
小麦成熟种子须经浸泡才易剥离出胚 ,否则胚
受到伤害降低出愈率。本实验所用的东农 7742 、
龙麦 9814和龙麦 26这 3个品种成熟种子的含水
量分别为16.4%、15%、16.1%。在相同条件下 ,发
现浸种 24 ～ 32 h时种子吸涨变软 ,但种皮仍然较
硬 ,很难剥离胚。浸种36 h ,东农 7742 、龙麦 26 胚
乳较软 ,容易剥离出胚 ,且出愈率可达100%;龙麦
9814浸种38 h取胚较容易 。当 3个小麦品种浸种
时间超过44 h ,致使胚乳发粘 ,取胚困难 。实验表
明 ,不同品种应采用不同的浸种时间 ,但对于大多
数品种来说 ,当种子的含水量在15%～ 16.5%时 ,
浸种 36 ～ 40 h易于取胚 ,并可提高出愈率。
2.2　不同激素组合对愈伤组织分化的影响
本实验通过查阅大量文献 ,设置了 2种分化培
养基 ,实验结果见表 1。
小麦愈伤组织分化时 ,一般先形成绿色芽点
(图 1 , a),随后由绿色芽点处分化形成不定芽(图
1 ,b),而只有少部分愈伤组织的绿色芽点可出芽 。
从表 1中可看出 ,3种不同的基因型小麦成熟胚愈
表 1　不同分化培养基对愈伤组织芽分化的影响
Table 1　The effect of different medium of differentiation on the bud differentiation of callus
基因型
Genotype
培养基
Media
接种胚数(个)
Number of
inoculated embryos
产生芽的愈伤数(个)
Number of callus
with green buds
分化率(%)
Frequency of
dif ferentiation
每块愈伤的绿芽数(个)
Green buds numbers of
each callus
东农 7742 B1 380 236 62.11 2-5
B2 375 217 57.87 2-4
龙麦 9814 B1 326 187 57.36 2-3
B2 340 171 50.29 2-3
龙麦 26 B1 257 142 55.37 1-3
B2 261 128 49.04 2-3
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图 1　小麦愈伤组织再生植株
a.胚性愈伤组织产生绿色芽点;b.由绿色芽点处分化出芽苗;c.小苗产生茁壮的根
Fig.1　The regeneration plants of the wheat calli
a.The green buds which are producted by the Embryogenic calli;b.The seedling which grows from the bud points;
c.The strong roots which grow f rom the seedling
表 2　不同生根培养基对植株再生的影响
Table 2　The effect of the different medium of root formation on plants regeneration
基因型
Genotype
培养基
Media
接种芽数(个)
Number of inoculated shoots
生根芽数(个)
Number of rooted shoots
生根率(%)
Frequency of rooting
根的形态
Form of roots
东农 7742 C1 146 63 43.15 细分枝
C2 150 69 46.00 粗长盘曲
龙麦 9814 C1 151 59 39.07 细长
C2 150 63 42.00 粗长分枝
龙麦 26 C1 155 61 39.35 粗短
C2 149 65 43.62 粗长盘曲
伤组织形成绿芽的频率有差异 ,介于49.04%～
62.11%之间 ,每块愈伤组织的出芽数多于 1个 。
可见 ,小麦的基因型不同 ,体细胞的再生能力有很
大的差异。但是 , 3种基因型小麦 ,在含有高浓度
玉米素的 B1培养基上 ,分化率均高于含0.5 mg/L
IAA+0.5 mg/L ZT 的 B2培养基上的分化率。高
于的频率为4.24%～ 7.07%。
2.3　不同生根培养基对植株再生的影响
愈伤组织表面长出的绿芽及其分蘖接种在不
同生根培养基上后 ,绿芽逐渐伸长 ,同时产生大量
的小根 。由表 2 和图 1 , c 看出 ,附加有0.2 mg/L
NAA的 C2 培养基能促进芽快速生根 ,根多 ,根系
发达。而不添加任何激素的 1/2 MS的 C1培养基
虽然也能生根 ,但是生根速度明显低于C2培养基 ,
且根细 ,分枝少 ,不粗壮。因此 ,在培养基中添加低
浓度的生长素有助于促进植株生根 。
3　讨论与结论
本研究表明 ,在相同培养条件下 ,不同基因型
小麦成熟胚的愈伤诱导能力差别不大 ,出愈率均可
达100%。但有报道说 ,小麦不同基因型之间的出
愈率和愈伤质量都存在明显差异[ 9] ,这可能与选用
基因型的数量和外植体来源有关 。但基因型的差
异对小麦愈伤组织的分化却有着重大的影响。
植物激素对于组织和细胞培养中的器官或胚
状体形成 ,具有重要的调节作用。组织培养中生长
素和细胞分裂素两类物质的相对浓度控制着芽的
分化和根的再生 ,较高浓度的生长素有利于根的形
成而抑制芽的分化;相反 ,较高浓度的细胞分裂素
则促进芽的形成而抑制根的生长 。为了利于芽的
分化 ,在分化培养基中一般应去掉 2 ,4-D ,添加细
胞分裂素 。本试验设置了 2种不同的分化培养基 ,
实验结果表明 ,小麦愈伤组织在含10 mg/L ZT的培
养基上很快就能分化出许多小芽 。而添加了低浓
度NAA的 1/2 MS培养基可有效促进生根 。
起始愈伤组织的状态对组织培养中细胞分化
及形态建成有明显的影响[ 10] 。只有那些质地致
密 ,表面呈颗粒状 ,颜色淡黄的胚性愈伤组织才能
分化出绿色芽苗 ,进而长成植株。那些呈透明或半
透明状的愈伤永远也不能产生绿色芽点。
511期　　　　　　　　　　　　　李新玲等:影响小麦成熟胚培养及植株再生因素的研究
参　考　文　献
1.于晓红 , 朱祯 , 付志明 , 等.提高小麦愈伤组织分化频率
的因素.植物生理学报 , 1999 , 25(4):388 ～ 394
2.Becker D , Brettscheider R , Lorz H.Fertile transgenic wheat
from microprojectile bombardment of scutellar tissue.Plant J ,
1994 , 5(2):299 ～ 307
3.Nehar N S , Chibbar R N , Leung N , et al.Self-fertile transgenic
wheat plants regenerated from isolated scutellar tissue following
microprojectile bombardment with two distinct gene constructs.
Plant J , 1994 , 5:285～ 297
4.Vasil V , Castillo A M , Fromm M E , et al.Herbicide resistant
fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bom-
bardment of regenerable embryogenic callus.Bio Technology ,
1992 , 10(7):667 ～ 674
5.Maheshwari N , Rajyalakshmi K , Chwdhary C N.In vitro culture
of wheat and genetic transformation retyospect and prospect.
Critical Reviewon Plant Sciences , 1995 , 14:149 ～ 178
6.Zaghmout O M F , Trolinder N L.Simple and efficient method
for directly electroporating agrobacterium plasmid DNA into
wheat callus cells.Nucl Acid Res , 1993 , 21:1048～ 1051
7.Zamora A B , Scott K J.Callus formation and plant regeneration
from wheat leaves.Plant Sci Lett , 1983 , 29:183 ～ 186
8.崔林 , 范银燕.裸燕麦胚性愈伤组织诱导及植株再生能
力的研究.国外农学麦类作物 , 1999 , 6:32～ 33
9.梁静静 , 吕德彬 , 陈军营 , 等.不同基因型对小麦成熟胚
愈伤组织诱导及植株再生的影响.河南农业大学学报 ,
2003 , 37(2):107～ 110
10.许智宏.Differentiation of plant cell.Plant Physics Commun
(植物生理学通讯), 1979 , 3:66～ 71(in Chinese)
误指改正　植物研究2004(24)2:227页 ,“图 1　细疣绢藓地理分布图　Fig.1　Geographical distribution of Entodon verru-
culosus”更正为“图 1　细疣绢藓　1.植物体;2 ～ 6.叶;7.叶先端细胞;8.叶中部细胞;9.角细胞;10.孢蒴;11.蒴齿(绘图标本:
赵建成 96-219(HBNU))　Fig.1　Entodon verruculosus　1.Plant;2～ 6.Vegetative leaces;7.Apical leaf cells;8.Median leaf cells;
9.Alar cells;10.Capsule;11.Peristome(All drawn form J.C.Zhao96-219(HBNU))”
52 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　25 卷