全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（３）： ４５９ － ４６６ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０３􀆰 ０１５
基金项目：西南大学博士基金（ＳＷＵ１１１０４４），中央高校基本科研业务费专项资金（ＸＤＪＫ２０１４Ｃ０９５）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｎｉｋｅｍｇｈ＠ ｓｗｕ． ｅｄｕ． ｃｎ， Ｃｈｇｘｉａｏ＠ ｓｗｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
收稿日期： ２０１５ － ０１ － １１
内生枯草芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 对烟草疫霉的
抑制及生理生化影响
杨　 桃　 许冰心　 王秋月　 马冠华∗　 肖崇刚∗　 董国菊
（西南大学植物保护学院， 重庆 ４００７１６）
摘要： 为明确内生枯草芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 菌株抑制烟草疫霉生长的机理，分别采用电镜扫描法、生化
测定法和电导法研究了其对烟草疫霉菌丝形态及生理生化指标的影响。 结果显示，经 Ｉｔｂ５７ 菌株
发酵滤液处理的疫霉菌丝畸形膨大、分枝短粗，孢子囊的形成及萌发受到显著抑制，当发酵滤液浓
度为 ５０％时，抑制率分别为 ７９􀆰 ６９％和 ７０􀆰 ８５％ ；且与对照相比，处理组疫霉菌细胞壁主要成分碱溶
性、碱不溶性和水溶性的 β⁃１，３⁃葡聚糖含量分别降低了 ５１􀆰 １８％ 、４２􀆰 ５６％和 ３９􀆰 ４２％ ，β⁃１，３⁃葡聚糖
合成酶活性降低了 ７２􀆰 ４５％ ，ＤＮＡ 含量降低了 １４􀆰 ６４％ ；线粒体复合酶活性显著低于对照，其中复
合酶 ＩＩ活性降低了 ７９􀆰 ２５％ ，菌丝处理液电导率升高。 表明枯草芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液能减
少疫霉细胞壁主要成分 β⁃１，３⁃葡聚糖含量，破坏细胞膜的完整性，导致菌丝生长受阻或产生畸形，
对烟草黑胫病的控制具有潜在的生防价值。
关键词： 枯草芽胞杆菌； 烟草疫霉菌； 生理生化； 抑制
Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ Ｉｔｂ５７ ｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ
Ｙａｎｇ Ｔａｏ　 Ｘｕ Ｂｉｎｇｘｉｎ　 Ｗａｎｇ Ｑｉｕｙｕｅ　 Ｍａ Ｇｕａｎｈｕａ∗ 　 Ｘｉａｏ Ｃｈｏｎｇｇａｎｇ∗ 　 Ｄｏｎｇ Ｇｕｏｊｕ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１６， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｈｏｗ ｔｈｅ Ｉｔｂ５７， ａｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ， ｉｎｈｉｂｉｔｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ
ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ， ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｎ ｍｙｃｅｌｉｕｍ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ａｎ ａｒｒａｙ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙｓ． Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ５０％ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｃａｕｓｅｄ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｗｉｔｈ
ｓｈｏｒｔ ｂｒａｎｃｈｅｓ， ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｂｙ ７９􀆰 ６９％ ａｎｄ
７０􀆰 ８５％ ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｍａｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ， ｓｕｃｈ ａｓ ａｌｋａｌｉ ｓｏｌｕｂｌｅ β⁃１，３⁃
ｇｌｕｃａｎ， ａｌｋａｌｉ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ β⁃１， ３⁃ｇｌｕｃａｎ， ａｎｄ ｗａｔｅｒ⁃ｓｏｌｕｂｌｅ β⁃１， ３⁃ｇｌｕｃａｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗｅｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ
５１􀆰 １８％ ， ４２􀆰 ５６％ ａｎｄ ３９􀆰 ４２％ ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ β⁃１，
３⁃ｇｌｕｃａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｗａｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ ７２􀆰 ４５％ ， ａｎｄ ｔｈｅ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ａｌｓｏ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ １４􀆰 ６４％ ｉｎ ｔｈｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎ． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ， ａｎｄ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ ７９􀆰 ２５％ ． Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，
ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ． ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｍｙｃｅｌｉａ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｕｐｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ． Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｉｔｂ５７ ｃｏｕｌｄ ｒｅｄｕｃｅ β⁃１，３⁃ｇｌｕｃａｎ ａｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ
ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ ｏｆ Ｐ． ｐａｒａｓｉｔｉｃａ， ｄｅｓｔｒｏｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ， ｒｅｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｈｙｐｈａｌ
ｇｒｏｗｔｈ， ａｎｄ ｆｉｎａｌｌｙ ｌｅａｄ ｔｏ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｈａｅ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ
Ｉｔｂ５７ ｈａｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｂｉｏ⁃ｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｂｌａｃｋ ｓｈａｎｋ ｄｉｓｅａｓｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ； Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
　 　 烟草黑胫病是由烟草疫霉菌 Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａ⁃
ｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ （Ｂｒｅｄａ ｄｅ Ｈｅａｎ） Ｔｕｃｋｅｒ引起的
一种典型的土传病害，病原菌能产生游动孢子，繁殖
速度快且量大，在烟草的整个生育期均能侵染危害
（冯志珍等，２０１２）。 近年来，由于烟田连作使得烟
草黑胫病的发病率增加，一般田块的平均发病率为
１０％ ～２０％ ，严重的还出现大面积绝产毁种的现象
（马国胜和高智谋，２００７）。 有效控制烟草黑胫病的
发生发展、降低烟农的经济损失均面临严重的挑战。
当前防治烟草黑胫病的方法主要有农业防治、化学
防治和生物防治，而生物防治是国际上进行植物病
害防治研究的热点。 开发高效防治烟草黑胫病的生
防制剂，对烟草产业的发展、农民的增收和环境的保
护具有重要意义。
安全、高效的拮抗微生物制剂成为近年来的研
究热点，目前防治烟草黑胫病的微生物主要是从根
际土壤分离获得，定殖能力和防治效果均不稳定
（薛超群等，２０１４），而内生细菌可以很好地分布于
植物体内，防效比附生菌更加稳定持久（刘云霞，
１９９４）。 枯草芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ 能成功定殖
于植物根际、体表及体内，不仅能增强植物的防御能
力，还能分泌抗菌物质抑制病原菌的生长（Ｂａｉｓ ｅｔ
ａｌ． ，２００４）。 朱辉等（２００８）推测辣椒内生枯草芽胞
杆菌 ＳＣ２ 菌株可能产生了某种蛋白或是抗菌肽类
物质，溶解了辣椒疫霉的细胞壁；王芳等（２００９）从
苦参中分离获得枯草芽胞杆菌 Ｂ３６ 菌株，其发酵滤
液能抑制番茄叶霉病菌菌丝胞外细胞壁水解酶的合
成，但对细胞壁组成成分几丁质浓度没有影响；易龙
等（２０１２）研究表明烟草内生枯草芽胞杆菌 Ｉｔｂ２９５
菌株对烟草根黑腐病防效达 ７７􀆰 １％ ，其无菌发酵滤
液对黑腐病菌菌丝生长和孢子萌发均有较好的抑制
作用。 但关于内生枯草芽胞杆菌的拮抗机理研究报
道较少，为此，全面掌握枯草芽胞杆菌的拮抗机理对
开发高效的生防菌剂具有重要的指导作用。
本课题组从烟草内生菌中分离纯化出 １ 株枯草
芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 菌株，其发酵滤液对烟草黑胫病的
温室防治效果达 ６９􀆰 ２８％ ，且大田防治效果连续 ２
年均在 ６０％以上，与药剂 ５８％甲霜·锰锌可湿性粉
剂的防治效果没有显著差异，防治效果稳定（马冠
华等，２０１０）。 目前，内生枯草芽胞杆菌对烟草疫霉
拮抗机理的研究报道较少，因此本试验从烟草疫霉
菌细胞形态学、生理生化水平探索 Ｉｔｂ５７ 菌株抑制
疫霉菌生长的机理，以期为该菌的生防利用提供理
论依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株：烟草内生芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 菌株、烟草
疫霉菌 ＹＢＸ１２４ 菌株，均由西南大学植物生态病理
研究所提供。
培养基：燕麦（ｏａｔ⁃ａｇａｒ，ＯＡ）培养基：燕麦片 ３０
ｇ、琼脂 １７ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ；肉汁蛋白胨（ｎｕｔｒｉｅｎｔ
ａｇａｒ，ＮＡ）培养基：牛肉浸膏 ３􀆰 ０ ｇ、蛋白胨 ７􀆰 ０ ｇ、葡
萄糖 １０􀆰 ０ ｇ、琼脂 １５􀆰 ０ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ；马铃薯
葡萄糖琼脂（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基：马铃
薯 ２００ ｇ、葡萄糖 １０ ｇ、琼脂 ２０ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ。
试剂及仪器：考马斯亮蓝、叠氮钠、抗霉素 Ａ、
２，６⁃二氯酚靛酚、鱼藤酮、泛醌和 ＤＮＡ 提取试剂盒，
天根生化科技（北京）有限公司；其余试剂均为国产
分析纯。 ＤＤＳ⁃３０７ 电导率仪，成都世纪方舟科技有
限公司；ＢＫ５０００ 生物显微镜，重庆奥特光学仪器有
限责任公司；ＲＸＺ（ＰＱＸ）智能人工气候箱，宁波东南
仪器有限公司；Ｈｉｔａｃｈ Ｓ⁃３０００Ｎ 扫描电镜、Ｈｉｔａｃｈｉ
Ｉｏｎ Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｅ１０１０ 喷金器，日本日立公司；Ｅｐｐｅｎｄｏｌｆ
Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｐｌｕｓ 分光光度计， 德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｌｆ
公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液拮抗活性的检测
烟草疫霉于 ＯＡ 培养基上 ２５℃培养 ４ ｄ 后，沿
菌落边缘用直径 ６ ｍｍ 打孔器打取菌饼，备用。 将
Ｉｔｂ５７ 菌株接种于 ＮＡ 培养液中，２８℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ 振
荡培养 ４８ ｈ，经 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ 后取上清
液，用 ０􀆰 ２２ μｍ 微孔滤膜过滤除菌，所得发酵滤液
在 ４℃保存备用（陈海英等，２０１０）。 用 １ ｍＬ发酵滤
液与 ９ ｍＬ 融化 ＰＤＡ 培养基混合制成平板，在平板
中央接种疫霉菌饼，以等体积无菌水为对照，每处理
０６４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
３ 次重复，置于 ２５℃光照培养箱中培养 ３ ｄ 后测定
菌落直径，计算抑制率（沈奕等，２０１０）。 抑制率 ＝
（对照菌落生长直径 －处理菌落生长直径） ／对照菌
落生长直径 × １００％ 。
挑取受抑制的菌丝，用 ２％戊二醛固定 ２ ｈ；磷
酸缓冲液漂洗 ３ 次；再浸泡于体积分数为 １％的锇
酸溶液中。 经各级乙醇脱水、醋酸异戊酯置换。 最
后临界点干燥（５０％叔丁醇、７５％叔丁醇、１００％叔
丁醇、叔丁醇 ∶乙腈 ＝ ２ ∶ １、叔丁醇 ∶ 乙腈 ＝ １ ∶ １、乙
腈各 １０ ｍｉｎ），真空镀金进行电镜扫描观察。
１􀆰 ２􀆰 ２ Ｉｔｂ５７ 菌株对疫霉孢子囊形成及萌发的影响
分别取 １０ ｍＬ 浓度为 １０％ 、２０％ 、３０％ 、４０％ 、
５０％的 Ｉｔｂ５７ 无菌发酵滤液，每一浓度放入 １􀆰 ２􀆰 １ 制
备的菌饼 ５ 块，以无菌水为对照，重复 ３ 次，置于
２５℃光照培养箱中培养 ４８ ｈ 后，取出菌饼镜检 ５ 个
视野，统计疫霉孢子囊数。 另外取上述菌饼 １０ 块置
于玻璃皿中，加入无菌水将菌丝面刚好浸湿，２５℃光
照培养 ４８ ｈ，取出菌饼转移至 １０ ｍＬ 浓度为 １０％ 、
２０％ 、３０％ 、４０％ 、５０％的 Ｉｔｂ５７ 无菌发酵滤液，以无
菌水为对照，４℃处理 ３０ ｍｉｎ，２５℃处理 １ ｈ，取出菌
饼镜检 ５ 个视野，视孢子排出孢子囊体积的 １ ／ ２ 为
萌发，统计孢子囊形成总数和萌发的孢子囊数（王
晶晶等，２０１１）。
１􀆰 ２􀆰 ３ Ｉｔｂ５７ 菌株对疫霉菌生理生化的影响
取上述 １􀆰 ２􀆰 １ 制备的菌饼 ５ 块，置于 ２００ ｍＬ菌
株 Ｉｔｂ５７ 发酵滤液浓度为 １％ 、２％ 、３％ 、４％ 、５％的
ＯＡ培养液中，２５℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养 ６ ｄ，收集疫
霉菌丝， － ８０℃保存备用。 每项测定均设 ３ 次重复。
细胞壁 β⁃１，３ 葡聚糖含量的测定：将上述制备
的各发酵滤液浓度处理菌丝加液氮研磨至粉末，分
别各取 １􀆰 ５ ｇ 放入离心管中，参照杨晓彤等（１９９７）
的方法提取水溶性 β⁃１，３ 葡聚糖，碱溶性和碱不溶
性 β⁃１，３ 葡聚糖的提取参考冯俊涛等（２０１２）的方
法。 β⁃１，３ 葡聚糖含量的测定采用苯酚⁃硫酸法（Ｓａ⁃
ｈａ ＆ Ｂｒｅｗｅｒ，１９９４），取 β⁃１，３ 葡聚糖水解液 １ ｍＬ，
加入去离子水 １ ｍＬ、６％苯酚 １ ｍＬ、浓硫酸 ５ ｍＬ，静
置 １０ ｍｉｎ，摇匀后室温静置 ２０ ｍｉｎ，在 ４９０ ｎｍ 处测
定吸光度值。
细胞壁 β⁃１，３ 葡聚糖合成酶活性的测定：分别
取上述发酵滤液浓度为 １％ 、３％ 、５％培养的疫霉菌
丝各 １􀆰 ５ ｇ，置于预冷研钵中，加入５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ预冷的
乙酸钠缓冲液（ｐＨ ５􀆰 ０）６ ｍＬ，加入少量石英砂，冰
浴研磨成匀浆，４℃下、１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ２０ ｍｉｎ，收
集上清液，即粗酶液，置于 － ２０℃保存备用。 β⁃１，３
葡聚糖合成酶活性的测定参照王卫国等（２０１２）方
法，取葡萄糖溶液 ２５℃恒温水浴后加入粗酶液沸水
浴加热 ５ ｍｉｎ，冷却至室温后加入蒸馏水定容至 ５０
ｍＬ，于 ５４０ ｎｍ处测定吸光度值。
菌丝 ＤＮＡ含量的测定：分别取上述发酵滤液浓
度处理的菌丝各 １ ｇ，采用 ＣＴＡＢ 法提取菌丝 ＤＮＡ
（Ｍｕｒｒａｙ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９８０），检测提取 ＤＮＡ 的纯度
后，采用紫外分光光度法（陈秀芳和毛孙忠，２０１０）
测定菌丝 ＤＮＡ的含量。
呼吸链复合酶活性的测定：采用差速离心法提
取线粒体（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ． ，２０１２），分别取上述发酵滤液
浓度处理的菌丝各 ０􀆰 ５ ｇ 研磨成粉状，用 ５ 倍体积
线粒体提取缓冲液将粉末进行离心，收集上清；将收
集的线粒体在 ２０℃ ／ － ２０℃条件下反复融冻 ３ 次，
破坏线粒体膜，从而获得游离的呼吸链复合酶，复合
酶 Ｉ、复合酶 ＩＩ、复合酶 ＩＩＩ、复合酶 ＩＶ活性测定参考
熊杰和冯亦璞（１９９９）的方法。
蛋白质含量的测定：取 １􀆰 ２􀆰 １ 制备的菌饼 ５ 块，
接入 ２００ ｍＬ Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液浓度为 ５％ 、１０％ 、
１５％的 ＯＡ 培养液中，２５℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ 振荡培养 ６
ｄ，收集疫霉菌丝，采用考马斯亮蓝染色法测定菌丝
蛋白质含量（陈秀芳和毛孙忠，２０１０）。
细胞膜透性的测定：取 １􀆰 ２􀆰 １ 制备的菌饼 ５ 块，
接种于 ２００ ｍＬ ＯＡ 培养液中，２５℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ 振荡
培养 ３ ｄ，６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ收集菌丝体，用无
菌水洗涤 ２ 次，分别称取 ０􀆰 ５ ｇ 湿菌体置于 ５ ｍＬ浓
度为 １％ 、２％ 、３％ 、４％ 、５％的 Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液
中，以无菌水接菌、发酵滤液不接菌为对照，每隔
０􀆰 ５ ｈ离心测定 １ 次处理液电导率（余莎等，２０１３）。
１􀆰 ３ 数据分析
利用 ＳＰＳＳ １７􀆰 ０ 软件进行数据统计分析，对不
同处理间的差异进行单因素方差分析，应用 Ｄｕｎｃａｎ
氏新复极差法进行差异显著性检验。
２ 结果与分析
２􀆰 １ Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液对疫霉的拮抗活性
菌株发酵滤液对烟草疫霉菌生长具有较强的抑
制作用，与对照组的菌落直径 ３􀆰 ４０ ｃｍ 相比 （图
１⁃ａ），处理组的疫霉菌生长明显被抑制，菌落直径为
２􀆰 ０５ ｃｍ（图 １⁃ｂ），生长抑制率为 ３９􀆰 ６％ 。 对照组的
疫霉菌丝表面光滑、圆润，分枝较长（图 １⁃ｃ、１⁃ｅ），经
发酵滤液处理的疫霉菌丝则表现畸形、膨大且分枝
短粗，有的形成小瘤状物，多数表现出短粗的结节
（图 １⁃ｄ、１⁃ｆ）。
１６４３ 期 杨　 桃等： 内生枯草芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 对烟草疫霉的抑制及生理生化影响
图 １ 枯草芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 发酵滤液对烟草疫霉的拮抗活性
Ｆｉｇ． １ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｉｔｂ５７ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ
ａ、ｃ、ｅ： 对照菌落及菌丝生长情况（ × １ ０００）；ｂ、ｄ、ｆ： 经 Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液处理的疫霉菌落及菌丝生长情况（ ×
１ ０００）。ａ， ｃ， ｅ： Ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｈｙｐｈａ （ × １ ０００）； ｂ， ｄ， ｆ： ａｂｅｒｒａｎｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｙ ａｎｄ ｈｙｐｈａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｐ． ｐａｒａｓｉｔｉｃａ
ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｉｔｂ５７ ｆｉｌｔｒａｔｅ （ × １ ０００）．
　
２􀆰 ２ Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液对疫霉孢子囊的影响
不同浓度的 Ｉｔｂ５７菌株发酵滤液对疫霉孢子囊形
成及萌发均有很强的抑制作用，当发酵滤液浓度为
５０％时，对孢子囊形成及萌发的抑制率分别达到
７９􀆰 ６９％和 ７０􀆰 ８５％，当发酵滤液浓度降低到 １０％时，
孢子囊形成抑制率仍有 ３０􀆰 ２１％，而孢子囊萌发的抑
制率较低，为 １１􀆰 ４８％，表明 Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液在一
定浓度下能显著抑制疫霉孢子囊形成及萌发（表 １）。
２􀆰 ３ Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液对疫霉生理生化的影响
当发酵滤液浓度为 ５％时，碱溶性、碱不溶性、水
溶性的 β⁃１，３⁃葡聚糖含量分别为 ７􀆰 ２２％、１６􀆰 ７５％和
１２􀆰 ２８％，与对照相比，分别降低了 ５１􀆰 １８％、４２􀆰 ５６％
和 ３９􀆰 ４２％；β⁃１，３⁃葡聚糖合成酶活性为 ７􀆰 ８８３ Ｕ ／ ｍｇ，
与对照相比降低了 ７２􀆰 ４５％ （表 ２）。 表明 Ｉｔｂ５７ 菌株
发酵滤液能干扰疫霉细胞壁主要成分 β⁃１，３⁃葡聚糖
的合成，导致细胞壁主要成分含量降低。
表 １ Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液对疫霉孢子囊形成及萌发的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｉｔｂ５７ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｎ ｓｐｏｒａｎｇｉａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ
发酵滤液浓度 （％ ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ
抑制孢子囊形成
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
抑制孢子囊萌发
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
孢子囊数量
Ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ
ｎｕｍｂｅｒ
抑制率 （％ ）
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
孢子囊萌发率 （％ ）
Ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ
ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
抑制率 （％ ）
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
０ ６４􀆰 ００ ± ６􀆰 ５６ ａ — ８３􀆰 ０３ ± ４􀆰 ０９ ａ —
１０ ４４􀆰 ６７ ± ４􀆰 １６ ｂ ３０􀆰 ２１ ± ９􀆰 ６９ ａ ７３􀆰 ５０ ± ３􀆰 ９４ ｂ １１􀆰 ４８ ± ８􀆰 １８ ａ
２０ ２７􀆰 ６７ ± ２􀆰 ５２ ｃ ５６􀆰 ７７ ± ５􀆰 ３６ ｂ ５９􀆰 ０３ ± ２􀆰 ４６ ｃ ２８􀆰 ９１ ± ４􀆰 １７ ｂ
３０ ２３􀆰 ３３ ± ３􀆰 ５１ ｃｄ ６３􀆰 ５４ ± ７􀆰 １７ ｂ ５７􀆰 ８７ ± ４􀆰 ２５ ｃ ３０􀆰 ３０ ± ３􀆰 ６６ ｂ
４０ １９􀆰 ６７ ± １􀆰 ５３ ｄｅ ６９􀆰 ２７ ± ５􀆰 ０７ ｂｃ ３０􀆰 ９３ ± １􀆰 ８０ ｄ ６２􀆰 ７５ ± ３􀆰 ９７ ｃ
５０ １３􀆰 ００ ± ２􀆰 ６５ ｅ ７９􀆰 ６９ ± ５􀆰 ５５ ｃ ２４􀆰 ２０ ± ２􀆰 １１ ｅ ７０􀆰 ８５ ± １􀆰 ４４ ｃ
　 　 表中数据为平均数 ±标准误。 同列不同小写字母表示经 Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。 Ｄａｔａ ａｒｅ
ｍｅａｎ ± ＳＥ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ．
　 　 疫霉菌丝溶液电导率随发酵滤液浓度的增加而
升高，５％发酵滤液处理疫霉菌丝 ２􀆰 ５ ｈ 后，电导率
增加了 １６􀆰 ９５％ ，表明 Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液处理后引
起了菌丝细胞膜的破损，导致内含物外渗，使培养液
电导率增加（图 ２）；经发酵滤液处理后，线粒体复合
酶 Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ 活性随着发酵滤液浓度的增加而降
低，其中复合酶 ＩＩ活性降低 ７９􀆰 ２５％ ，当发酵滤液浓
度大于 ２％时，疫霉菌丝 ＤＮＡ 含量显著降低，ＤＮＡ
合成抑制率为 ７􀆰 １％ （表 ２）；当发酵滤液浓度高于
１５％时，疫霉菌丝蛋白质含量为 １􀆰 ０５１ ｍｇ ／ Ｌ，显著
２６４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
　 　 　
３６４３ 期 杨　 桃等： 内生枯草芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 对烟草疫霉的抑制及生理生化影响
低于对照处理（表 ３）。
表 ３ Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液对疫霉蛋白质含量的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｔｂ５７ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ
发酵滤液浓度 （％ ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ
吸光度值
Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ
蛋白质含量 （ｍｇ ／ Ｌ）
Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ
抑制率 （％ ）
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
０ ０􀆰 ７１５ １􀆰 １０７ ± ０􀆰 ０２０ ａ —
５ ０􀆰 ７０５ １􀆰 ０９３ ± ０􀆰 ００１ ａｂ １􀆰 ３ ± １􀆰 ８７ ａ
１０ ０􀆰 ６９９ １􀆰 ０８３ ± ０􀆰 ００６ ａｂ ２􀆰 ２ ± ２􀆰 ２７ ａ
１５ ０􀆰 ６７９ １􀆰 ０５１ ± ０􀆰 ０３８ ｂ ５􀆰 １ ± ５􀆰 ００ ａ
　 　 表中数据为平均数 ±标准误。 同列不同小写字母表示经 Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。 Ｄａｔａ ａｒｅ
ｍｅａｎ ± ＳＥ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ．
图 ２ Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液对疫霉菌丝细胞膜透性的影响
Ｆｉｇ． ２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｉｔｂ５７ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ
ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ
　
３ 讨论
芽胞杆菌制剂在田间应用的稳定性及与化学农
药的相容性等方面均优于非芽胞类细菌和其它真
菌，是一种理想的生防材料（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ，２００７）。 本
研究所用的烟草内生芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 菌株，对烟草
疫霉有较强的抑制效果，其发酵滤液对疫霉生长、孢
子囊形成及萌发均有明显的抑制作用。 周嘉平和王
宝华（１９８４）的研究表明，对烟草黑胫病发生发展、
传播流行起关键性作用的是致病菌孢子囊的数量和
萌发率，而本试验结果与前期大田试验中 Ｉｔｂ５７ 菌
株表现出稳定高效的控病结果（马冠华等，２０１０）互
相印证。
Ｓｔｅｉｎ（２００５）研究认为细胞壁对细胞起着定型
和保护的作用，细胞壁受到损伤，会使细胞壁上纤维
原变形，导致芽管末端扭曲膨大，菌丝分枝增多。 本
研究发现经 Ｉｔｂ５７ 菌株发酵滤液处理后的疫霉菌丝
产生了明显的畸形、扭曲，因此，推测 Ｉｔｂ５７ 菌株发
酵滤液可能破坏了疫霉菌丝的细胞壁。 孔建等
（１９９３）曾报道，枯草芽胞杆菌菌株 Ｂ⁃９０３ 产生的抗
生素能使镰刀菌菌丝细胞壁溶解，菌丝畸形；翟茹环
等（２００７）研究发现枯草芽胞杆菌菌株 Ｇ８ 发酵滤液
能使黄瓜菌核病菌菌丝消融，原生质渗漏；邢介帅等
（２００８）发现枯草芽胞杆菌 Ｔ２ 产生的蛋白酶能降解
棉花枯萎病菌菌丝细胞壁中的蛋白质，造成细胞壁
缺失，从而使菌丝畸形；Ｄｅｌｅｕ ｅｔ ａｌ． （２００８）研究证实
枯草芽胞杆菌脂肽类抗菌物质的抑菌机制就是作用
于病原菌的细胞膜，改变了细胞膜的结构。 本试验
中 Ｉｔｂ５７ 菌株菌丝经不同浓度发酵滤液处理后，细
胞壁的主要成分 β⁃１，３⁃葡聚糖合成酶活性显著降
低，且 β⁃１，３⁃葡聚糖含量显著下降，表明发酵滤液能
干扰疫霉细胞壁中 β⁃１，３⁃葡聚糖的形成；经不同浓
度发酵滤液处理的疫霉菌丝培养液电导率显著增
加，说明菌丝细胞膜结构受到损伤。 由此推测 Ｉｔｂ５７
菌株产生的抗菌物质可以作用于疫霉菌的细胞壁及
细胞膜，破坏菌体的完整性，使得胞内物质向外泄
漏，同时抗菌物质更易扩散进入胞内而起到杀菌
作用。
虽然有关芽胞杆菌生防机理的研究报道较多，
但针对卵菌病害的生防机理却很少，由于卵菌细胞
壁主要成分是纤维素，与其它真菌明显不同，所以拮
抗物质种类及作用位点也存在较大差异。 范瑞娟
（２０１１）用枯茗酸处理辣椒疫霉，可使疫霉 ＤＮＡ 含
量明显增加，蛋白质含量减少，推测枯茗酸可能使疫
霉代谢紊乱，ＤＮＡ 增加，从而干扰了转录和翻译过
程，致使蛋白质含量降低；冯俊涛等（２０１２）在研究
枯茗酸抑制辣椒疫霉机理时发现其作用靶标点可能
为细胞壁和细胞膜。 研究表明线粒体复合酶 ＩＩ 的
主要功能是催化电子从琥珀酸到 Ｑ 的传递，复合酶
ＩＩＩ是呼吸作用能量转换的中心部分，复合酶 ＩＩ 和复
合酶 ＩＩＩ 均是农用杀菌剂的作用靶标（李慧，２０１２）。
本试验用枯草芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 发酵滤液处理烟草疫
４６４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
霉，发现疫霉菌 ＤＮＡ含量、蛋白质含量均减少，菌丝
线粒体复合酶活性显著降低。 推测 Ｉｔｂ５７ 菌株产生
的抗菌物质可能类似枯茗酸或某些杀菌剂，通过对
疫霉 ＤＮＡ 合成的影响抑制了线粒体复合酶活性相
关基因的表达，进而影响了线粒体 ４ 种复合酶在电
子传递过程中的功能，最终使得疫霉生长过程受到
抑制。 而对于其是否影响了疫霉能量物质的合成还
需要观察线粒体内脊结构的变化来加以验证。
本试验研究了受抑制疫霉菌的形态变化和生理
生化变化，结果表明 Ｉｔｂ５７ 菌株的发酵滤液中可能
含有一种或多种抑菌活性物质，作用于疫霉菌丝的
细胞壁及细胞膜，抑制疫霉菌丝生长，致使菌丝畸
形，减少孢子囊的形成及萌发，因此后续研究可以对
受抑制疫霉线粒体内脊结构、Ｉｔｂ５７ 菌株产拮抗活性
物质的种类及结构作进一步研究，以期全面掌握内
生枯草芽胞杆菌 Ｉｔｂ５７ 拮抗烟草疫霉的机制，为该
菌生防制剂的开发利用提供理论依据。
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（责任编辑：李美娟）
６６４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷