全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４３(４): ４０１￣４１０(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０９￣０４ꎻ 修回日期: ２０１３￣０４￣１０
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３０９００９６２)ꎻ 国家高技术研究发展计划(“８６３”计划) (２０１１ＡＡ１０Ａ２０５)ꎻ 河北省财政专项
(Ｆ１２Ｃ１００３６)
通讯作者: 郭庆港ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物病害生物防治研究ꎻ Ｔｅｌ:０３１２￣５９１５６７７ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｇｑｇ７７＠１６３. ｃｏｍ
第一作者: 董伟欣ꎬ女ꎬ河北省石家庄人ꎬ主要从事生防细菌的分子遗传学研究ꎮ
脂肽类抗生素 ｆｅｎｇｙｃｉｎ在枯草芽胞杆菌
ＮＣＤ￣２ 菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析
董伟欣ꎬ 李宝庆ꎬ 李社增ꎬ 鹿秀云ꎬ 马 平ꎬ 郭庆港∗
(河北省农林科学院植物保护研究所ꎬ河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心ꎬ
农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室ꎬ 保定 ０７１０００)
摘要:枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株及其无细胞发酵液对多种植物病原真菌具有较强的拮抗活性ꎮ 为了明确 ＮＣＤ￣２ 菌株抑菌
作用机理ꎬ本研究利用快速蛋白液相色谱技术(ＦＰＬＣ)结合抑菌活性测定ꎬ对 ＮＣＤ￣２ 菌株的脂肽类抑菌物质进行分离、纯
化ꎬ经质谱鉴定ꎬ该抑菌物质为芬荠素( ｆｅｎｇｙｃｉｎ)ꎮ 从 ＮＣＤ￣２ 菌株中克隆出 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成酶基因 ｆｅｎＣ 及其上游启动子序
列ꎬ通过同源重组技术对 ｆｅｎＣ基因进行了内缺失突变ꎬ同 ＮＣＤ￣２ 野生型菌株相比ꎬｆｅｎＣ基因缺失突变子丧失了 ｆｅｎｇｙｃｉｎ的
合成能力ꎬ同时该突变子显著降低了对番茄灰霉病菌的拮抗活性ꎮ 进一步在离体叶片上比较了 ＮＣＤ￣２ 野生型菌株和突变
子之间脂肽提取物和菌体细胞对番茄灰霉病的保护作用ꎬ结果发现ꎬ突变子不论是脂肽提取物还是菌体细胞显著降低了对
番茄灰霉病的防治作用ꎮ
关键词:枯草芽胞杆菌ꎻ 番茄灰霉病菌ꎻ ｆｅｎｇｙｃｉｎꎻ 突变
Ｔｈｅ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣
２ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ＤＯＮＧ Ｗｅｉ￣ｘｉｎꎬ ＬＩ Ｂａｏ￣ｑｉｎｇꎬ ＬＩ Ｓｈｅ￣ｚｅｎｇꎬ ＬＵ
Ｘｉｕ￣ｙｕｎꎬ ＭＡ Ｐｉｎｇꎬ ＧＵＯ Ｑｉｎｇ￣ｇａｎｇ (Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ꎬ Ｈｅｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎻ
ＩＰＭ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎻ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ＩＰＭ ｏｎ Ｃｒｏｐｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ
Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１０００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｅｌｌ￣ｆｒｅｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ. Ｔｈｅ ＮＣＤ￣２ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ
ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ. Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ
Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ (ＦＰＬＣ)ꎬ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ
ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ / ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ￣ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ (ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ) . Ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｅｎｇｙ￣
ｃｉｎ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｉｎ￣ｆｒａｍｅｌｅｓｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｔ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｆｅｎｇｙｃｉｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅꎬ ｔｈｅ ｆｅｎｇｙｃｉｎ￣ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎ￣
ｇａｌ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ. Ｆｕｒｔｈｅｒ ｂｉｏａｓｓａｙ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｎｇｙｃｉｎ￣ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ
ｍｕｔａｎｔ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｌｏｓｔ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂ. ｃｉｎｅｒｅａ ｉｎ ｖｉｔｒｏꎬ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅ￣
ｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｔｏｍａｔｏ ｇｒｅｙ ｍｏｌｄ ｏｎ ｄｅｔａｃｈｅｄ ｔｏｍａｔｏ ｌｅａｖｅｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ
ｂｙ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｅｎｇｙｃｉｎ￣ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓꎻ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａꎻ ｆｅｎｇｙｃｉｎꎻ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
中图分类号: Ｓ４７６ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０４￣０４０１￣１０
植物病理学报 ４３ 卷
枯草芽胞杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)防治植物病
害的机制复杂多样ꎬ主要包括抑菌作用、竞争作用
和诱导抗性等ꎮ 枯草芽胞杆菌可以产生多种抑菌
活性物质ꎬ其中脂肽类抗生素是其所产生的主要抑
菌物质ꎮ 脂肽类抗生素由于具有抑菌谱广、热稳定
性强、持效期长等优点ꎬ在植物病害防治中具有重
要的作用[１]ꎮ 表面活性素( ｓｕｒｆａｃｔｉｎ)、伊枯草菌素
(包括 ｉｔｕｒｉｎ Ａ、ｍｙｃｏｓｕｂｔｉｌｉｎ 和 ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ)以
及芬荠素 ( ｆｅｎｇｙｃｉｎ) 类抗生素 ( ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ 和
ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ｂ)是枯草芽胞杆菌产生的三大类脂肽抗
生素[２]ꎮ 这些抗生素由多酶复合体通过非核糖体
途径合成ꎬ一般由 ７ ( ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 和 ｉｔｕｒｉｎｓ) 或 １０
(ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ)个 α￣氨基酸组成的环形肽链和 １ 个由
１３￣１８ 个￣ＣＨ２ 组成的 β￣脂肪酸链组成ꎬ并且同一
种脂肽类抗生素一般具有 ３￣５ 个同系物ꎬ不同的同
系物在脂肪酸链的长度上有所差异[３]ꎮ ｉｔｕｒｉｎｓ 和
ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ类抗生素对多种植物病原真菌具有较强
的拮抗活性[４ꎬ５]ꎬｓｕｒｆａｃｔｉｎ 虽然自身对真菌没有明
显的抑菌活性ꎬ 但 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 可增强 ｉｔｕｒｉｎｓ 或
ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ的抑菌活性[６ꎬ７]ꎮ 除了直接的抑菌活性
外ꎬｓｕｒｆａｃｔｉｎ和 ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ还具有诱导抗病性的作用
( ＩＳＲ) [８ꎬ９]ꎮ
枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株是一株对棉花黄萎
病菌和番茄灰霉病菌等多种植物病原真菌具有较
强拮抗活性的生防细菌[１０]ꎬ以 ＮＣＤ￣２ 菌株为活性
成分开发的微生物农药“１０ 亿 /克枯草芽胞杆菌可
湿性粉剂”已获得农药正式登记ꎮ 前期研究发现ꎬ
该菌株产生的抑菌活性物质具有热稳定性ꎬ并且对
酸、碱和蛋白酶 Ｋ 不敏感[１１]ꎬ据此推测 ＮＣＤ￣２ 菌
株产生的抑菌活性物质可能为脂肽类抗生素ꎮ 本
研究以番茄灰霉病菌(Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ)为指示菌ꎬ
通过蛋白质液相色谱(ＦＰＬＣ)和质谱技术对 ＮＣＤ￣
２ 菌株产生的抑菌活性物质进行分离鉴定ꎬ通过分
子遗传学手段明确抑菌活性物质在 ＮＣＤ￣２ 菌株抑
制番茄灰霉病菌中的作用ꎮ 明确 ＮＣＤ￣２ 菌株产生
的主要抑菌活性物质ꎬ可为 ＮＣＤ￣２ 菌株发酵条件
的优化以及 ＮＣＤ￣２ 菌株的遗传改良提供重要理论
依据ꎮ
１ 材料与方法
１. １ 供试菌株与质粒
本研究所用的菌株及质粒见表 １ꎮ 大肠杆菌
(Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ) 采用 ＬＢ 培养基、３７℃培养ꎻ枯草
芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株及其突变子在含有 ３０％甘油
的 ＬＢ(Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ)培养基中于 － ８０℃长期保存ꎬ
使用前在 ＬＢ固体培养基上 ３７℃活化ꎮ 根据质粒的
抗性ꎬ在 ＬＢ培养基中加入抗生素(抗生素的终浓度
分别为:氨苄青霉素 １００ μｇ / ｍＬ、红霉素 ２ ５ μｇ /
ｍＬ)ꎮ 番茄灰霉病菌由本实验室分离并保存ꎮ
１. ２ 引物合成及 ＰＣＲ扩增
本研究所用引物均根据枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２
菌株基因组序列设计ꎬ引物设计由 Ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ
５. ０ 软件完成ꎬ引物名称和序列见表 ２ꎮ 引物合成
和序列测定由上海生工生物工程公司完成ꎮ ＰＣＲ
扩增所用ＤＮＡ聚合酶购自北京全式金生物技术
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｓｔｒａｉｎ ＆ ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ
ＮＣＤ￣２ Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｏｃｋ
ＮＣＤ￣２(Δｆｅｎ)
ＮＣＤ￣２ ｍｕｔａｎｔ ｔｙｐｅꎬ ｆｅｎＣ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗｅｒｅ ｄｅｌｅｔｅｄ ｂｙ
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｇｒａｙ ｍｏｌｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｏｃｋ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ｒｅｃＡ / ｅｎｄＡ / ｈｓｄＲ１７ ｄｅｏＲ ｔｈｉ２ / ｓｕｐＥ４４ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ / ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｐＭＡＤ
Ｅ. ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒꎬ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ｐｌａｓｍｉｄꎬ Ａｍｐｒꎬ Ｅｒｙｒ
Ｇｉｆｔｅｄ ｂｙ Ｄｒ Ｚｈａｎｇ Ｊｉｅ
ｐＭＡＤ￣Δｆｅｎ
ｐＭＡＤ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｅｎＣ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎻ
Ａｍｐｒꎬ Ｅｒｙｒ
Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｎｏｔｅ: Ａｍｐｒꎬ ａｎｄ Ｅｒｙｒ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ.
２０４
４ 期 董伟欣ꎬ等:脂肽类抗生素 ｆｅｎｇｙｃｉｎ在枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ (５￣３) Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ∗
Ｐ１ ＣＧＣ ＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣ ＢａｍＨⅠ ＋２ ００５ ｂｐ
Ｐ２ ＣＧＣ ＡＣＧＣＧＴＣＣＧＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＡＴＴＡＧ Ｍｌｕ Ⅰ ＋１６１ ｂｐ
Ｐ３ ＣＧＣ ＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＧＣＴＡＴ Ｍｌｕ Ⅰ －３６３ ｂｐ
Ｐ４ ＣＧＣ ＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＧＣＡＧＴＧＡＡＴ ＥｃｏＲⅠ －２ ００８ ｂｐ
“∗”: Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｗａｓ ｆｉｘｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ ｏｆ ｆｅｎＣ ｇｅｎｅ. Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ａｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ.
有限公司的 ＨｉＦｉ ＤＮＡ聚合酶ꎻ试验所用限制性内
切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、ＰＣＲ 产物纯化试剂盒均购
自宝生物工程(大连)有限公司ꎮ
１. ３ ＮＣＤ￣２ 菌株脂肽类抑菌物质的提取
采用盐酸沉淀和甲醇溶解的方法提取 ＮＣＤ￣２
菌株中的脂肽类物质[１２]ꎮ ＮＣＤ￣２ 菌株于 ５ ｍＬ ＬＢ
液体培养基中ꎬ３０℃、１８０ ｒ / ｍｉｎ 培养 １２ ｈꎬ然后以
１％的接种量转接到 ２００ ｍＬ ３ 号培养基中[１３]ꎬ
３０℃、１８０ ｒ / ｍｉｎ 培养 ４８ ｈꎮ 培养结束后ꎬ将发酵液
于 ４℃、８ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎꎬ收集上清液ꎬ并用
５ ｍｏｌ / Ｌ 的 ＨＣｌ 调节 ｐＨ 值至 ２. ０ ~ ２. ５ꎬ４℃静置
过夜ꎮ 次日以 ８ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎꎬ收集沉淀ꎬ
将沉淀在超净工作台中吹干后用 ５０ ｍＬ 甲醇抽提
２ 次ꎬ合并抽提液得到脂肽粗提物ꎮ
１. ４ ＮＣＤ￣２ 菌株抑菌活性物质的分离和鉴定
ＮＣＤ￣２ 菌株脂肽粗提物过 Ф ＝ ０. ２２ μｍ 细菌
过滤器ꎬ采用 ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ 快速蛋白液相色谱
(ＦＰＬＣ)对过滤液中抑菌活性物质进行分离和纯
化ꎮ 色谱柱为 ＳＯＵＲＣＥ ５ＲＰＣ ＳＴ ４. ６ / １５０ 柱ꎮ 流
动相 Ａ 为含 ０. ０６５％三氟乙酸和 ２％乙腈的水溶
液ꎬ流动相 Ｂ为含 ０. ０５％三氟乙酸的 ８０％乙腈溶
液ꎮ 检测波长为 ２１５ ｎｍꎬ流速为 １ ｍＬ / ｍｉｎꎮ 梯度
洗脱过程为 ５０ ｍｉｎ 内流动相 Ａ 由 １００％到 ０ꎮ 手
动收集 ＦＰＬＣ各组分ꎬ收集液利用旋转蒸发仪进行
浓缩ꎬ利用浓缩液进行抑菌活性测定 (方法见
１ ６)ꎬ对具有抑菌活性的组分进行基质辅助激光
解析电离飞行时间质谱(ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ)分析鉴
定ꎬ根据文献已报道的枯草芽胞杆菌脂肽类抗生素
的分子量对 ＮＣＤ￣２ 菌株中的抑菌活性物质进行鉴
定[１４ꎬ１５]ꎮ
１. ５ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶基因缺失突变菌株的构建
根据枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成
酶基因序列ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５. ０ 软件在
ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶基因 ｆｅｎＣ的上、下游分别设计 ４ 条
引物ꎬ引物名称、位置及所带酶切位点见表 ２ꎮ 以
ＮＣＤ￣２ 菌株基因组为模板ꎬ分别以 Ｐ１ / Ｐ２ 和 Ｐ３ /
Ｐ４ 引物组合进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ ＰＣＲ 扩增产物回收
纯化后同时利用 ＭｌｕⅠ进行酶切ꎮ 酶切产物互连
后以连接产物为模板ꎬ用 Ｐ１ / Ｐ４ 引物进行 ＰＣＲ 扩
增ꎮ 扩增产物用 ＢａｍＨⅠ和 ＥｃｏＲⅠ双酶切后插入
到 ｐＭＡＤ 质粒 ＢａｍＨⅠ和 ＥｃｏＲⅠ位点间ꎬ构建
ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶基因缺失突变载体 ｐＭＡＤ￣△ｆｅｎꎮ
缺失突变载体经测序验证正确后ꎬ采用原生质转化
的方法转入枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株中[１６]ꎮ 参
照 Ａｒｎａｕｄ 等[１７]和 Ｗａｎｇ 等[１８]报道的方法筛选
ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶基因缺失突变子ꎮ
１. ６ 对番茄灰霉病菌的抑菌活性测定
采用平板对峙培养法比较 ＮＣＤ￣２ 菌株野生型
及突变子对番茄灰霉病菌的抑菌活性ꎮ 在直径 ９
ｃｍ的 ＰＤＡ 培养基中心位置接种直径为 ５ ｍｍ 的
番茄灰霉病菌菌盘ꎬ距离灰霉病菌 ２ ｃｍ 处点接新
活化的 ＮＣＤ￣２ 野生型菌株及其突变子ꎬ２５℃培养
５ ~ ７ ｄ后比较 ＮＣＤ￣２ 野生型菌株及其突变子对番
茄灰霉病菌的拮抗活性ꎮ
利用牛津杯法比较 ＮＣＤ￣２ 菌株野生型及其突
变子脂肽提取物对番茄灰霉病菌的拮抗活性ꎮ 制
备 １％ ＰＤＡ(１ Ｌ培养基中含有 １０ ｇ 琼脂)培养基
作为下层平板ꎬ待下层平板完全凝固后(间隔 ２４
ｈ)ꎬ在 ５０℃、１００ ｍＬ ０. ８％ ＰＤＡ 培养基(１ Ｌ 培养
基中含有 ８ ｇ琼脂)中加入 ２ ｍＬ 番茄灰霉病菌分
生孢子悬浮液(孢子浓度为 １０６ 个 / ｍＬ)ꎬ轻轻混匀
后倒在下层培养基上作为上层平板ꎮ 待培养基凝
固后ꎬ在制备好的双层培养基平板上放置 ２ 个灭菌
牛津杯ꎬ分别加入 ＮＣＤ￣２ 菌株野生型及突变子的
脂肽提取液ꎬ每个牛津杯中加入 １５０ μＬ 脂肽提取
３０４
植物病理学报 ４３ 卷
物ꎬ２５℃静置培养 ５ ~ ７ ｄ 后比较 ＮＣＤ￣２ 野生型菌
株及其突变子的脂肽提取物对番茄灰霉病菌的拮
抗活性ꎮ
１. ７ ＮＣＤ￣２ 菌株野生型及其 ｆｅｎＣ突变子对番茄
灰霉病的防效测定
在番茄离体叶片上分别比较 ＮＣＤ￣２ 菌株野生
型及其 ｆｅｎＣ突变子脂肽提取物和菌体细胞对番茄
灰霉病的保护作用ꎮ
１. ７. １ 脂肽提取物对番茄灰霉病的保护作用 选
取叶龄相同ꎬ大小一致的健康番茄叶片ꎬ用无菌水
洗净晾干后将超纯水溶解的脂肽提取物均匀喷洒
于叶片的正反面ꎬ叶片放入铺有湿润滤纸的培养皿
中ꎬ叶柄用湿润的脱脂棉包裹保湿ꎬ在每张叶片中间
部位接种直径为 ５ ｍｍ 的番茄灰霉病菌菌盘ꎬ然后
将盛有叶片的培养皿放入２５℃光照培养箱中培养ꎬ５
~７ ｄ后观察叶片的发病情况ꎬ设超纯水为对照ꎮ
１. ７. ２ 菌体细胞对番茄灰霉病的保护作用 ＮＣＤ￣
２菌株野生型及其 ｆｅｎＣ 突变子分别于 ２００ ｍＬ ＮＢ
(Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ)培养液中 ３７℃ꎬ１８０ ｒ / ｍｉｎ 振荡培
养 ２４ ｈꎬ１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ２０ ｍｉｎ 收集菌体ꎬ并用
３０ ｍＬ 新鲜的 ＮＢ 培养液悬浮菌体ꎬ制备菌悬液
(菌体浓度约为 １０９ ｃｆｕ / ｍＬ)ꎮ 选取叶龄相同ꎬ大
小一致的健康番茄叶片ꎬ用无菌水洗净晾干后在菌
悬液中浸泡 １ ｍｉｎꎬ在每张叶片中间接种番茄灰霉
病菌菌盘ꎬ然后置于 ２５℃光照培养箱中培养ꎬ５ ~ ７
ｄ后观察叶片的发病情况ꎬ设新鲜的 ＮＢ 培养液处
理为对照ꎬ每个处理重复 ３ 皿ꎬ每皿 ２ 张叶片ꎮ
２ 结果与分析
２. １ ＮＣＤ￣２ 菌株中抑菌物质的分离和鉴定
ＮＣＤ￣２ 菌株脂肽提取物经 ＦＰＬＣ 分离后呈现
３ 组物质(ＬＰ￣ａ、 ＬＰ￣ｂ、 ＬＰ￣ｃ)ꎬ手工收集 ３ 组物质ꎬ
分别浓缩定容至 １ ｍＬ 后进行抑菌活性测定ꎮ 结
果表明ꎬ只有组分 ２ 物质 (ＬＰ￣ｂ) 对番茄灰霉病菌
表现出明显的拮抗活性ꎬ而组分 １ 和组分 ３ 没有明
显拮抗活性(图 １)ꎮ 将组分 ２ 物质 (ＬＰ￣ｂ) 进行
ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ质谱分析ꎬ结果表明ꎬＬＰ￣ｂ 中包含 ２
种物质ꎬ而每种物质又包含 ５ 种同系物ꎬ相邻同系
物之间的分子量相差 １４ Ｄａꎬ恰好为脂肪酸链￣
ＣＨ２ꎮ ＬＰ￣ｂ中的第一种物质分子量分别为 １ ４４７、
１ ４６１、１ ４７５、１ ４８９ 和 １ ５０３ Ｄａꎬ该物质与 ｆｅｎｇｙｃｉｎ
Ａ的分子量相匹配ꎻＬＰ￣ｂ 中的另一种物质分子量
分别为 １ ４４９、１ ４６３、１ ４７７、１ ４９１ 和 １ ５０５ Ｄａꎬ该物
质与 ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ｂ的分子量相匹配(图 ２)ꎮ 因此ꎬ根
据分子量推断 ＮＣＤ￣２ 菌株产生的主要抑菌活性物
质为 ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ[１９]ꎮ
Ｆｉｇ. １ ＦＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ＮＣＤ￣２
ｓｔｒａｉｎ (Ａ) ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ
ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ (Ｂ)
ａꎬ ｂ ａｎｄ ｃ ｗｅｒｅ ｔｈｒｅｅ ｍａｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＦＰＬＣꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ
ｗａｓ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ￣ｆｒｅｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２.
４０４
４ 期 董伟欣ꎬ等:脂肽类抗生素 ｆｅｎｇｙｃｉｎ在枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析
Ｆｉｇ. ２ Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ (ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ) ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ
ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤ￣２
２. ２ ＮＣＤ￣２ 菌株 ｆｅｎＣ基因缺失突变子的构建
通过对 ＮＣＤ￣２ 菌株的全基因组序列进行分
析ꎬ获得 ９. ０６ ｋｂ的 ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶基因簇的部分
序列(ＧｅｎＢａｎｋ 登录号:ＧＱ９０６５７９)ꎮ 序列比对发
现ꎬＮＣＤ￣２ 菌株中的 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成酶基因簇序列
与枯草芽胞杆菌 １６８ 菌株中 ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ( ｆｅｎｇｙｃｉｎ)
合成酶基因簇(ＡＬ００９１２６)序列同源性为 ９５％ ꎬ与
枯草芽胞杆菌 Ｆ２９￣３ 菌株中 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成酶基因
簇(ＡＦ０８７４５２)序列同源性为 ８３％ ꎮ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成
酶存在 ５ 个编码基因ꎬ依次为 ｆｅｎＣ、ｆｅｎＤ、ｆｅｎＥ、ｆｅ￣
ｎＡ和 ｆｅｎＢ[２０]ꎬ根据 ＮＣＤ￣２ 菌株中第一个 ｆｅｎｇｙｃｉｎ
合成酶基因—ｆｅｎＣ 基因上下游序列设计 ４ 条引
物ꎬ以 ＮＣＤ￣２ 野生型菌株基因组为模板ꎬ分别利用
Ｐ１ / Ｐ２ 和 Ｐ３ / Ｐ４ 引物组合进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ获得大
小为 １ ８４４ ｂｐ 和 １ ６４５ ｂｐ 的扩增片段ꎮ ２ 个扩增
片段经 ＭｌｕⅠ酶切、连接后为模板ꎬ利用 Ｐ１ / Ｐ４ 引
物进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ获得大小为 ３ ４８９ ｂｐ 的扩增片
段ꎮ 同 ＮＣＤ￣２ 菌株中的 ｆｅｎＣ 基因相比ꎬＰ１ / Ｐ４ 扩
增片段中缺少了 ５２４ ｂｐ 的片段ꎬ缺少的片段中包
含 ｆｅｎＣ基因及其启动子的部分序列ꎮ Ｐ１ / Ｐ４ 扩增
片段经 ＢａｍＨⅠ、ＥｃｏＲⅠ双酶切后ꎬ插入同样双酶
切的 ｐＭＡＤ 质粒相应位点ꎬ即得到 ＰＭＡＤ￣△ｆｅｎ
缺失突变载体ꎮ 将构建好的缺失突变载体转入
ＮＣＤ￣２ 菌株中进行高温突变筛选ꎬ获得红霉素敏
感菌株ꎮ 以敏感菌株及 ＮＣＤ￣２ 野生型菌株基因组
ＤＮＡ为模板ꎬ以 Ｐ１ / Ｐ４ 为引物进行 ＰＣＲ扩增ꎮ 结
果证明ꎬ红霉素敏感菌株的扩增片段较 ＮＣＤ￣２ 野
生型菌株扩增片段小约 ５００ ｂｐ(图 ３)ꎬ表明该红霉
素敏感菌株即为 ｆｅｎＣ 基因缺失突变菌株ꎬ命名为
ＮＣＤ￣２(Δｆｅｎ)ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ
ｖｅｃｔｏｒｓ
Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣２ ｗｅｒｅ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｍ￣
ｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１ / Ｐ２ ａｎｄ Ｐ３ / Ｐ４ ｕｓｉｎｇ ＮＣＤ￣２ ＤＮＡ ａｓ
ｔｅｍｐｌａｔｅꎻ Ｌａｎｅ ３ ｗａｓ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｐ１ / Ｐ４ ｕｓｉｎｇ ＮＣＤ￣２ (Δｆｅｎ) ＤＮＡ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅꎻ Ｌａｎｅ ４ ｗａｓ
ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１ / Ｐ４ ｕｓｉｎｇ ＮＣＤ￣２
ＤＮＡ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ.
５０４
植物病理学报 ４３ 卷
２. ３ ＮＣＤ￣２ 菌株野生型及其突变子 ＮＣＤ￣２
(Δｆｅｎ)脂肽提取物的高效液相色谱分析
将盐酸沉淀法提取的 ＮＣＤ￣２ 野生型菌株及其
突变子脂肽类物质ꎬ经 ＦＰＬＣ 分析表明ꎬ野生型
ＮＣＤ￣２ 菌株在 ３９. ４１ － ４８. ９５ ｍｉｎ 处出现响应峰
值ꎬ前期研究证实ꎬ该峰为 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 检测峰(图 ４￣
Ａ)ꎮ 与 ＮＣＤ￣２ 野生型菌株相比ꎬ突变子 ＮＣＤ￣２
(Δｆｅｎ)在 ３９. ４１ －４８. ９５ ｍｉｎ处没有出现明显的响
应峰值(图 ４￣Ｂ)ꎬ证明突变子 ＮＣＤ￣２(Δｆｅｎ)丧失
了产生 ｆｅｎｇｙｃｉｎ的能力ꎮ
２. ４ ＮＣＤ￣２ 菌株及其突变子对番茄灰霉病菌的
拮抗活性比较
在 ＰＤＡ培养基上比较了 ＮＣＤ￣２ 野生型菌株
及其突变子对番茄灰霉病菌的抑菌活性ꎮ 结果发
现ꎬＮＣＤ￣２ 野生型菌株对番茄灰霉病菌表现出明
显的抑菌活性ꎬ而突变子对番茄灰霉病菌的抑菌活
性显著降低(图 ５￣Ａ)ꎮ 采用牛津杯法比较了野生
型 ＮＣＤ￣２ 和突变子的脂肽提取物对番茄灰霉病菌
的抑菌活性ꎬ结果表明ꎬＮＣＤ￣２ 野生型菌株的脂肽
提取物对番茄灰霉病菌表现出较强的抑菌活性ꎬ而
Ｆｉｇ. ４ ＦＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤ￣２
ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ (Ａ) ａｎｄ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２ (Δｆｅｎ) (Ｂ)
Ｆｉｇ. ５ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ａ: Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂ. ｃｉｎｅｒｅａ ｂｙ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤ￣２ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２(Δｆｅｎ)ꎻ
Ｂ: Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂ. ｃｉｎｅｒｅａ ｂｙ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤ￣２
ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２(Δｆｅｎ) .
６０４
４ 期 董伟欣ꎬ等:脂肽类抗生素 ｆｅｎｇｙｃｉｎ在枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析
突变子的脂肽提取物几乎完全丧失了对番茄灰霉
病菌的抑菌活性(图 ５￣Ｂ)ꎬ证明 ｆｅｎｇｙｃｉｎ在 ＮＣＤ￣２
菌株对灰霉病菌的抑制作用中发挥主要功能ꎮ
２. ５ ＮＣＤ￣２ 菌株野生型及其 ｆｅｎＣ突变子对番茄
灰霉病的防治作用
在离体叶片上比较了野生型 ＮＣＤ￣２ 菌株及其
突变子脂肽提取物和菌体细胞对番茄灰霉病的防
治作用(图 ６)ꎮ 接种 ５ ｄ 后ꎬ对照处理的叶片出现
大面积灰褐色病斑ꎬ并且病斑上着生大量灰色霉
层ꎮ ＮＣＤ￣２ 野生型菌株不论是脂肽提取物还是菌
体细胞处理的叶片没有明显的发病迹象ꎬ而突变子
ＮＣＤ￣２(Δｆｅｎ)的脂肽提取物或菌体细胞处理的叶
片均出现明显的灰霉病斑ꎬ尽管相比对照而言病斑
面积有所减小ꎬ但在灰褐色病斑上面仍然着生大量
的灰色霉层ꎮ 证明在离体叶片上ꎬＮＣＤ￣２ 野生型
菌株的脂肽提取物或菌体细胞对番茄灰霉病具有
较理想的防治作用ꎬ而突变子 ＮＣＤ￣２(Δｆｅｎ)的脂
肽提取物或菌体细胞显著降低了对番茄灰霉病的
防治作用ꎮ
３ 讨论
目前对枯草芽胞杆菌中脂肽类抗生素的鉴定
主要采用液谱分析结合质谱鉴定ꎬ根据物质的保留
时间和分子量判断物质的性质[２１ꎬ２２]ꎬ而通过分子
遗传学手段对活性物质进行验证的研究报道较少ꎮ
本研究从 ＮＣＤ￣２ 菌株中分离纯化出一种对番茄灰
霉病菌具有较强活性的抑菌物质ꎬ液谱分析发现ꎬ
该物质与解淀粉芽胞杆菌(Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)
ＦＺＢ４２ 菌株中的 ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ 具有相同的保留时间
(结果未列出)ꎬ经质谱分析发现该物质与 ｆｅｎｇｙｃｉｎ
的分子量相匹配ꎬ据此推断该活性物质为 ｆｅｎｇｙｃｉｎ
类抗生素ꎮ 为进一步证明 ＮＣＤ￣２ 菌株产生的抑菌
活性物质为 ｆｅｎｇｙｃｉｎꎬ本研究通过同源重组技术对
ＮＣＤ￣２ 菌株中编码 ｆｅｎｇｃｙｉｎ合成酶的基因 ｆｅｎＣ进
行了缺失突变ꎬ通过液谱分析证明ꎬ突变子丧失了
产该抑菌活性物质的能力ꎬ据此确认该活性物质为
ｆｅｎｇｙｃｉｎꎮ
Ｆｅｎｇｙｃｉｎ对多种植物病原真菌ꎬ尤其是丝状真
菌具有较强的拮抗作用ꎬ其作用机理是作用于病原
菌细胞壁的类脂层ꎬ从而破坏细胞膜的结构和透
性[５]ꎮ 目前已有报道证明 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 对番茄灰霉病
菌表现较强的拮抗活性ꎬ如 Ｌｉ 等[２３]研究发现ꎬ枯
草芽胞杆菌 ＢＡＢ￣１ 菌株所产生的 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 对番茄
灰霉病菌表现较强的拮抗活性ꎬ并且造成灰霉病菌
Ｆｉｇ. ６ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｇｒａｙ ｍｏｌｄ ｂｙ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ (Ａ) ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ (Ｂ) ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤ￣２ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｕｔａｎｔ ｉｎ ｖｉｖｏ
７０４
植物病理学报 ４３ 卷
菌丝膨大、畸形ꎬ部分原生质体外渗ꎬＴｏｕｒｅ 等[２４]也
发现 ｆｅｎｇｙｃｉｎ对灰霉病菌具有抑菌活性ꎮ 然而由
于这些生防菌株同时产生多种抑菌物质ꎬ如 ｓｕｒｆａｃ￣
ｔｉｎ、ｉｔｕｒｉｎ Ａ、ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ 和 ｍｙｃｏｓｕｂｔｉｌｉｎ 等ꎬ因
此无法明确 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 在生防枯草芽胞杆菌抑菌功
能中所发挥的作用ꎮ 通过分子遗传学手段ꎬ对生防
菌株中抑菌物质的编码基因进行突变ꎬ比较野生型
生防菌株和突变子对病原菌的抑菌活性ꎬ可确定生
防菌中发挥主要抑菌作用的活性物质[２５]ꎮ 解淀粉
芽胞杆菌(Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)Ｃ０６ 菌株同时产
生脂肽类抗生素 ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ 和 ｆｅｎｇｙｃｉｎꎬ通过
基因突变技术分别获得丧失 ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ 和
ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成能力的突变子ꎬ抑菌活性测定表明ꎬ
ｆｅｎｇｙｃｉｎ在 Ｃ０６ 菌株抑制褐腐病菌(Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃ￣
ｔｉｃｏｌａ)发挥主要作用[２６]ꎮ Ｙａｎｅｚ￣Ｍｅｎｄｉｚａｂａｌ 等[２７]
研究发现ꎬ尽管枯草芽胞杆菌 ＣＰＡ￣８ 菌株可以产
生 ｆｅｎｇｙｃｉｎ、ｉｔｕｒｉｎ Ａ和 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ等多种脂肽类抗生
素ꎬ但丧失 ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成能力的突变子完全丧失了
对 Ｍ. ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ 的抑菌活性ꎬ该结果同样证明
ｆｅｎｇｙｃｉｎ在抑菌活性中发挥主要的作用ꎮ 本研究
对 ＮＣＤ￣２ 菌株中 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成酶基因 ｆｅｎＣ 进行
了缺失突变ꎬ结果发现ꎬ同野生型 ＮＣＤ￣２ 菌株相
比ꎬ丧失产 ｆｅｎｇｙｃｉｎ的突变子显著降低了对番茄灰
霉病菌的拮抗活性ꎻ进一步在离体叶片上比较了
ＮＣＤ￣２ 菌株野生型及其突变子的脂肽提取物对番
茄灰霉病的防治作用ꎬ结果证明ꎬ同 ＮＣＤ￣２ 菌株野
生型相比ꎬ其突变子的脂肽提取物也丧失了对番茄
灰霉病的防治作用ꎮ 由此说明ꎬｆｅｎｇｙｃｉｎ 在枯草芽
胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株抑制灰霉病菌生长以及防治番
茄灰霉病中发挥了主要作用ꎮ
枯草芽胞杆菌基因组中大约 ５％的基因用于
编码抑菌物质[３]ꎬ其中包括脂肽类抗生素ꎬ如
ｆｅｎｇｙｃｉｎ、ｓｕｒｆａｃｔｉｎ、 ｉｔｕｒｉｎ Ａ、ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄꎬｍｙｃｏ￣
ｓｕｂｔｉｌｉｎ 等ꎬ但这并不意味着同一菌株在生长代谢
过程中能够同时产生这些抑菌物质ꎬ某些抗生素编
码基因或其启动子只有在某些特定的生长阶段或
特定环境下才表达[２８]ꎮ 通过对 ＮＣＤ￣２ 菌株的全
基因组序列进行分析发现ꎬＮＣＤ￣２ 菌株基因组中
存在多个脂肽类物质的编码基因簇ꎬ其中包括编码
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ的 ｓｒｆ基因簇、编码 ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ 的 ｂｍｙ
基因簇、编码 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 的 ｆｅｎ 基因簇以及编码 ｂａ￣
ｃｉｌｌａｅｎｅ的 ｐｋｓ 基因簇ꎬ由于本研究采用了适合
ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成的 ３ 号培养基(数据未发表)ꎬ因此
ＮＣＤ￣２ 菌株的脂肽提取物中主要为 ｆｅｎｇｙｃｉｎꎮ 但
本研究发现ꎬ缺失 ｆｅｎＣ 基因的突变子虽然丧失了
ｆｅｎｇｙｃｉｎ的合成能力ꎬ但突变子中产生了一种新的
物质ꎬＦＰＬＣ结果发现ꎬ该物质与 ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ 的
保留时间基本一致ꎬ质谱分析结果发现该物质与
ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ具有一致的分子量(结果未列出)ꎬ
因此推测ꎬ缺失突变 ｆｅｎＣ 基因造成 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成
能力丧失ꎬ但增加了突变子中 ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ 的合
成ꎮ 通过 ＲＴ￣ＰＣＲ( ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ)技术
分析突变 ｆｅｎＣ 基因后 ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ 合成酶基因
的表达情况ꎬ将会从分子水平明确 ｆｅｎＣ基因对 ｂａ￣
ｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ合成能力的影响ꎮ
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ｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ [ Ｊ ] . Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓꎬ
２００９ꎬ ８(６３): １ －１２.
[１５] Ｌｅｅｎｄｅｒｓ Ｆꎬ Ｓｔｅｉｎ Ｔ Ｈꎬ Ｋａｂｌｉｔｚ Ｂꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒａｐｉｄ ｔｙｐｉｎｇ
ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｔｈｅｉｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏ￣
ｌｉｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ￣ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ / ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ
ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ [ Ｊ] . Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕ￣
ｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙꎬ １９９９ꎬ １３(１０): ９４３ －
９４９.
[１６] Ｍａｒｔｉｎ Ｐꎬ Ｌｏｈｒ Ｊꎬ Ｄｅａｎ Ｄ. Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｂｙ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９８１ꎬ １４５ (２):
９８０ －９８３.
[１７] Ａｒｎａｕｄ Ｍꎬ Ｃｈａｓｔａｎｅｔ Ａꎬ Ｄｅｂａｒｂｏｕｉｌｌｅ Ｍ. Ｎｅｗ ｖｅｃｔｏｒ
ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｌｌｅｌｉｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｎｏｎｔｒａｎｓ￣
ｆｏｒｍａｂｌｅꎬ ｌｏｗ￣ＧＣ￣ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ｇｒａｍ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ
[Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ
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[１８] Ｗａｎｇ Ｙꎬ Ｄｅｎｇ Ｃꎬ Ｐｅｎｇ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｑｕｏｒｕｍ
ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｎｐｒＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ Ｃｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｉｎｉｃａ (微生物学报)ꎬ
２０１０ꎬ ５０(１１): １５５０ －１５５５.
[１９] Ｄｅ Ｆａｒｉａ Ａ Ｆꎬ Ｓｔｅｆａｎｉ Ｄꎬ Ｖａｚ Ｂ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ
ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＬＳＦＭ￣０５ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｒａｗ
ｇｌｙｃｅｒｏｌ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ ３８(７): １ －９.
[２０] Ｗｕ Ｃ Ｙꎬ Ｃｈｅｎ Ｃ Ｌꎬ Ｌｅｅ Ｙ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｏｎ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ
ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ￣
ｍｉｓｔｒｙꎬ ２００７ꎬ ２８２: ５６０８ －５６１６.
[２１] Ｈｕ Ｌ Ｂꎬ Ｓｈｉ Ｚ Ｑꎬ Ｚｈａｎｇ Ｔꎬ ｅｔ ａｌ. Ｆｅｎｇｙｃｉｎ ａｎｔｉｂｉｏ￣
ｔｉｃｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂ￣ＦＳ０１ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ Ｓｈｅｌｄｏｎ ＡＴＣＣ ３８９３２ [ Ｊ ] .
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓꎬ ２００７ꎬ ２７２(１): ９１ －９８.
[２２] Ｖａｔｅｒ Ｊꎬ Ｋａｂｌｉｔｚ Ｂꎬ Ｗｉｌｄｅ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍａｔｒｉｘ￣ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａ￣
ｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ￣ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅ￣
ｔｒｙ ｏｆ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｕｌ￣
ｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｃ￣１ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅ￣
ｔｒｏｌｅｕｍ ｓｌｕｄｇｅ [ Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉ￣
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００２ꎬ ６８(１２): ６２１０ －６２１９.
[２３] Ｌｉ Ｂ Ｑꎬ Ｌｕ Ｘ Ｙꎬ Ｇｕｏ Ｑ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎ￣
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｐｒｏ￣
ｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＢＡＢ￣１ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ (中国农业科学)ꎬ
２０１０ꎬ ４３(１７): ３５４７ －３５５４.
[２４] Ｔｏｕｒｅ Ｙꎬ Ｏｎｇｅｎａ Ｍꎬ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｏｌｅ ｏｆ
ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＡ１ ｉｎ ｔｈｅ
ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｙ ｍｏｕｌｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ
９０４
植物病理学报 ４３ 卷
ｃｉｎｅｒｅａ ｏｎ ａｐｐｌｅ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣
ｇｙꎬ ２００４ꎬ ９６(５): １１５１ －１１６０.
[２５] Ｚｅｒｉｏｕｈ Ｈꎬ Ｒｏｍｅｒｏ Ｄꎬ Ｇａｒｃｉａ￣Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ
Ｉｔｕｒｉｎ￣ｌｉｋｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｒｓｅｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｇａｉｎｓｔ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｃｕｃｕｒｂｉｔｓ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣
Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２０１１ꎬ ２４(１２): １５４０ －１５５２.
[２６] Ｌｉｕ Ｊꎬ Ｚｈｏｕ Ｔꎬ Ｈｅ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ
ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ ａｎｄ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ０６ ｔｏｗａｒｄｓ Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ￣
ｎｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ ２０(１): ４３ －５２.
[２７] Ｙａｎｅｚ￣Ｍｅｎｄｉｚａｂａｌ Ｖꎬ Ｚｅｒｉｏｕｈ Ｈꎬ Ｖｉｎａｓ Ｉꎬ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏ￣
ｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｅａｃｈ ｂｒｏｗｎ ｒｏｔ (Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｓｐｐ. ) ｂｙ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＣＰＡ￣８ ｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｆｅｎｇｙｃｉｎ￣ｌｉｋｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ [ Ｊ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０１２ꎬ １３２(４): １ －１１.
[２８] Ｋｅ Ｗ Ｊꎬ Ｃｈａｎｇ Ｂ Ｙꎬ Ｌｉｎ Ｔ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｏｐｅｒｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＵＰ
ｅｌｅｍｅｎｔ [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ １９１
(１４): ４６１５ －４６２３.
责任编辑:于金枝
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