全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(２): １８０￣１８７(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０６￣０７ꎻ 修回日期: ２０１３￣１２￣２１
基金项目: 国家现代农业产业技术体系资助项目(ＣＡＲＳ￣１８￣１５)ꎻ 国家自然科学基金资助项目(３０９００９６２ꎻ３１２７２０８５)ꎻ 国家“８６３”计划资助
(２０１１ＡＡ１０Ａ２０５)
通讯作者: 郭庆港ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物病害生物防治研究ꎻ Ｔｅｌ:０３１２￣５９１５６７７ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｇｑｇ７７＠１６３.ｃｏｍ
第一作者: 董伟欣ꎬ女ꎬ河北省石家庄人ꎬ主要从事生防细菌的分子遗传学研究ꎮ
枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２中调控因子 ＰｈｏＰ对
ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成的调控作用
董伟欣ꎬ 李社增ꎬ 鹿秀云ꎬ 张晓云ꎬ 王培培ꎬ 马 平ꎬ 郭庆港∗
(河北省农林科学院植物保护研究所ꎬ河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心ꎬ
农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室ꎬ 保定 ０７１０００)
摘要:ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ双因子调控系统是枯草芽胞杆菌中一个重要的全局性调控系统ꎬ在低磷环境下ꎬ感应激酶 ＰｈｏＲ 自磷酸
化ꎬ并且将获得的磷酸基团转移到调控因子 ＰｈｏＰ上ꎬ从而激活 ＰｈｏＰ的调控活性ꎮ 为了明确调控因子 ＰｈｏＰ 对枯草芽胞杆
菌 ＮＣＤ￣２菌株中主要抑菌活性物质￣ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成能力的调控作用ꎬ本研究通过同源重组技术缺失突变 ＮＣＤ￣２菌株中的
ｐｈｏＰ基因ꎬ拮抗活性测定结果表明ꎬｐｈｏＰ基因缺失菌株显著降低了对立枯丝核菌的抑菌活性ꎮ 通过快速蛋白质液相色谱
(ＦＰＬＣ)技术比较了 ＮＣＤ￣２菌株野生型及其 ｐｈｏＰ基因突变子 ｆｅｎｇｙｃｉｎ的合成能力ꎬ结果证明ꎬｐｈｏＰ 基因突变菌株降低了
ｆｅｎｇｙｃｉｎ的合成能力ꎮ 对突变子进行 ｐｈｏＰ基因互补发现ꎬ互补 ｐｈｏＰ基因可使突变子的相关性状恢复到野生型菌株水平ꎮ
以上结果证明ꎬｐｈｏＰ基因对枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２菌株中 ｆｅｎｇｙｃｉｎ的合成具有正调控功能ꎮ
关键词:枯草芽胞杆菌ꎻ 双因子调控系统ꎻ 脂肽类抗生素ꎻ 抑菌活性
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＰｈｏＰ ｉｎ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ
ＮＣＤ￣２　 ＤＯＮＧ Ｗｅｉ￣ｘｉｎꎬ ＬＩ Ｓｈｅ￣ｚｅｎｇꎬ ＬＵ Ｘｉｕ￣ｙｕｎꎬ ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ￣ｙｕｎꎬ ＷＡＮＧ Ｐｅｉ￣ｐｅｉꎬ ＭＡ Ｐｉｎｇꎬ
ＧＵＯ Ｑｉｎｇ￣ｇａｎｇ　 (Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ꎬ Ｈｅｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ ＩＰＭ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ＩＰＭ ｏｎ Ｃｒｏｐｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１０００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ ｔｗｏ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｓ ａ ｇｌｏｂａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ. Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｓｅｎｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰｈｏＲ ｓｅｌｆ￣ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｓ ｉｔｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ ｔｏ ｔｈｅ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＰｈｏＰ. Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ＰｈｏＰ ｉｍｐｒｅｓｓｅｓ ｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ.
Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＰｈｏＰ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤ￣２ꎬ
ｔｈｅ ｐｈｏＰ ｗａｓ ｉｎ￣ｆｒａｍｅｌｅｓｓ ｄｅｌｅｔｅｄ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｈｏＰ ｍｕｔａｎｔ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｂｉｌｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｉｎ ｖｉｔｒｏ. Ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ
ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｎｓ ＮＣＤ￣２ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｐｈｏＰ ｍｕｔａｎｔꎬ ｔｈｅｎ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ (ＦＰＬＣ) .
Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｎｇｙｃｉｎꎬ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｎ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２ꎬ
ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏＰ ｍｕｔａｎｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ. Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅｓｅ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｗｅｒｅ ｒｅｓｔｏｒｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏＰ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏＰ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ. Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｈｏＰ ｗａｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓꎻ ｔｗｏ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍꎻ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓꎻ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ
中图分类号: Ｓ４７６　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０２￣０１８０￣０８
　 　 枯草芽胞杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)由于能产生多 种抑菌活性物质ꎬ并且能形成抗逆性较强的芽胞ꎬ
　
　 ２期 董伟欣ꎬ等:枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２中调控因子 ＰｈｏＰ对 ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成的调控作用
目前已成为开发微生物源农药的重要资源[１ꎬ２]ꎮ
枯草芽胞杆菌所产生的抑菌活性物质按照其合成
途径分为核糖体和非核糖体途径ꎬ其中由非核糖体
途径合成的脂肽类抗生素 ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ、ｉｔｕｒｉｎｓ 和 ｓｕｒ￣
ｆａｃｔｉｎ 是枯草芽胞杆菌产生的主要抑菌活性物
质[３]ꎮ 枯草芽胞杆菌这些次级代谢产物的产生受
培养基成分及菌体自身生长阶段的影响[４]ꎬ说明
在枯草芽胞杆菌中存在复杂的调控网络控制其次
级代谢产物的产生ꎮ
在枯草芽胞杆菌中ꎬ可溶性磷酸盐参与细菌
多种生命代谢活动ꎬ控制细菌初级和次级代谢产物
的产生ꎬ可溶性磷酸盐对代谢产物的影响主要是通
过 ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ 双因子调控系统进行调控ꎮ 在低磷
环境下ꎬ位于细胞膜上的组氨酸蛋白激酶 ＰｈｏＲ 自
磷酸化ꎬ并且将获得的磷酸基团转移到位于细胞质
中的调控因子 ＰｈｏＰ 上ꎬ磷酸化的 ＰｈｏＰ 通过与下
游目的基因的启动子区相结合从而调控目的基因
的表达[５ꎬ６]ꎮ 目前已经从枯草芽胞杆菌中鉴定出
３４个 ＰｈｏＰ 下游调控基因ꎬ这些基因参与细菌碱性
磷酸酶合成、磷元素的转运及细胞壁中磷脂的脱酰
化等多种生理代谢活动[７]ꎮ 在链霉菌( Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ￣
ｃｅｓ) [８~１０]和分枝杆菌 (Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ) [１１]中ꎬ有报
道证明 ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ 双因子调控系统控制细菌抑菌
物质的产生ꎬ但目前为止ꎬ枯草芽胞杆菌中尚未见
有关 ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ 双调控系统调控抑菌物质产生的
报道ꎮ 由于在 ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ 双因子调控系统中ꎬ
ＰｈｏＰ 直接与目的基因结合并调控目的基因的转录
活性ꎬ并且未曾磷酸化的 ＰｈｏＰ 依然具有微弱的启
动子结合能力[１２]ꎬ相比 ＰｈｏＲ而言ꎬＰｈｏＰ 对目的基
因的调控功能更明显[１３]ꎮ
枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２菌株对多种植物病原真
菌的生长表现出较强的抑制活性ꎬ以该菌株为主要
活性成分开发的微生物农药能有效防治棉花土传
病害[１４]ꎮ 通过转座子随机插入突变技术ꎬ本课题
组成功构建了 ＮＣＤ￣２ 菌株的突变子库ꎬ筛选到一
株抑菌功能降低的突变子ꎬ证明突变子中转座子插
入到 ｐｈｏＲ 基因内部[１５ꎬ１６]ꎬ但未曾明确 ｐｈｏＲ 所调
控的抑菌物质ꎮ 研究证明ꎬｆｅｎｇｙｃｉｎ 是 ＮＣＤ￣２菌株
产生的主要抑菌活性物质[１７]ꎮ 本研究拟通过对
ｐｈｏＰ基因进行定位突变ꎬ明确 ｐｈｏＰ 基因对 ＮＣＤ￣２
菌株抑菌活性及抑菌活性物质 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成的影
响ꎬ为阐明 ＮＣＤ￣２ 菌株中抑菌活性物质的代谢途
径提供依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试菌株与质粒
　 　 本研究所用菌株及质粒见表 １ꎮ 大肠杆菌
(Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)ＤＨ５α采用 ＬＢ (Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ)培
养基ꎬ３７℃培养ꎻ枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２及其衍生菌
株在含有 ３０％甘油的 ＬＢ培养基中于－８０℃长期保
存ꎬ使用前在 ＬＢ固体培养基上 ３７℃活化ꎮ 根据质
粒的抗性ꎬ在 ＬＢ 培养基中加入适量抗生素(氨苄
青霉素工作浓度为 ５０ μｇ / ｍＬ、红霉素工作浓度为
２.５ μｇ / ｍＬ、四环素工作浓度为 １０ μｇ / ｍＬ)ꎮ 立枯
丝核菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ)由本实验室分离并保
存ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｓｔｒａｉｎ ＆ ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤ￣２ Ｗｉｄｅ￣ｔｙｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｏｃｋ
ＮＣＤ￣２Δ ｐｈｏＰ ＮＣＤ￣２ ｍｕｔａｎｔ ｔｙｐｅꎬ ｐｈｏＰ ｗａｓ ｄｅｌｅｔｅｄ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＨＢｐｈｏＰ Ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｏｆ ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ ｂｙ ｉｎｔａｃｔ ｐｈｏＰ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｇｒａｙ ｍｏｌｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｏｃｋ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７ ｄｅｏＲ ｔｈｉ２１ ｓｕｐＥ４４ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｐＭＡＤ Ｅ. ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒꎬ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｌａｓｍｉｄꎬ Ａｍｐｒꎬ Ｅｒｙｒ Ｄｏｎａｔｅｄ ｂｙ Ｄｒ Ｚｈａｎｇ Ｊｉｅ
ｐＭＡＤ￣Δ ｐｈｏＰ ｐＭＡＤ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｏＰ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎻ Ａｍｐｒꎬ Ｅｒｙｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＨＹ３００ＰＬＫ Ｅ. ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒꎬ Ａｍｐｒ Ｔｅｔｒ ＴａＫａＲａ
ｐＨＢ ｐｈｏＰ ｐＨＹ３００ＰＬＫ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｉｎｔａｃｔ ｐｈｏＰꎬ Ｔｅｔｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
　 Ｎｏｔｅ: Ａｍｐｒꎬ Ｔｅｔｒꎬ ａｎｄ Ｅｒｙｒ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎꎬ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅꎬ ａｎｄ Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ.
１８１
　
植物病理学报 ４４卷
１.２　 引物合成及 ＰＣＲ扩增
所用引物均根据枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２菌株基
因组序列ꎬ采用 Ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计ꎬ由上
海生工生物工程公司合成ꎬ引物名称和序列见表
２ꎮ ＰＣＲ扩增所用 ＨｉＦｉ ＤＮＡ聚合酶购自北京全式
金生物技术有限公司ꎻ试验所用限制性内切酶、Ｔ４
ＤＮＡ连接酶、ＰＣＲ 产物纯化试剂盒购自宝生物工
程(大连)有限公司ꎮ ＰＣＲ扩增产物由上海生工生
物工程公司进行测序ꎮ
１.３　 ｐｈｏＰ基因缺失突变子及其互补菌株的筛选
根据枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株中 ｐｈｏＰ 及其
上下游基因序列ꎬ在 ｐｈｏＰ 基因的上、下游分别设
计 １对引物ꎬ引物名称、序列及所带酶切位点见表
２ꎮ 以 ＮＣＤ￣２菌株基因组为模板ꎬ分别以 Ｐ１ / Ｐ２和
Ｐ３ / Ｐ４引物组合进行 ＰＣＲ 扩增ꎻＰＣＲ 扩增产物回
收纯化后同时利用 ＭｌｕⅠ进行酶切ꎬ酶切产物互连
后以连接产物为模板ꎬ用 Ｐ１ / Ｐ４ 引物进行 ＰＣＲ 扩
增ꎻ扩增产物用 ＢａｍＨⅠ和 Ｂｇｌ Ⅱ双酶切后插入到
ｐＭＡＤ质粒 ＢａｍＨⅠ和 Ｂｇｌ Ⅱ位点间ꎬ构建 ｐｈｏＰ
基因缺失突变载体 ｐＭＡＤ￣ΔｐｈｏＰꎮ 缺失突变载体
经测序验证正确后ꎬ采用原生质转化的方法转入枯
草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株中[１８]ꎮ 参照Ａｒｎａｕｄ等[１９]
和Ｗａｎｇ等[２０]报道的方法筛选 ｐｈｏＰ 基因缺失突
变子ꎮ
在 ｐｈｏＰ 基因起始密码子上游 １９８ ｂｐ 和终止
密码子下游 ２７７ ｂｐ 处分别设计引物 ＨＢｐｈｏＰ￣Ｕ /
ＨＢｐｈｏＰ￣Ｄꎬ扩增完整的 ｐｈｏＰ 基因及其启动子序
列ꎮ ＰＣＲ 扩增产物回收纯化后利用 ＢａｍＨⅠ和
Ｈｉｎｄ Ⅲ进行双酶切ꎬ酶切产物插入到穿梭载体
ｐＨＹ３００ＰＬＫ中的 ＢａｍＨⅠ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切位点之
间ꎬ构建 ｐｈｏＰ基因的互补载体ꎬ测序正确后ꎬ采用
电击转化的方法转入 ｐｈｏＰ 基因的突变体菌株中ꎬ
构建 ｐｈｏＰ基因的互补菌株ꎮ
１.４　 抑菌活性的测定
采用平板对峙培养法测定枯草芽胞杆菌对立
枯丝核菌的抑菌活性ꎮ 将枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２菌
株野生型及其衍生菌株在 ＮＢ(Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｂｒｏｔｈ)培
养基中 ３０℃、１８０ ｒ / ｍｉｎ振荡培养过夜后ꎬ１２ ０００ ｒ /
ｍｉｎ离心 ２ ｍｉｎ 收集菌体ꎬ并用无菌水悬浮菌体至
浓度为 ＯＤ６００ ＝２.０ꎬ获得菌体悬浮液ꎮ 在直径 ９ ｃｍ
的 ＰＤＡ培养基中心位置接种直径为 ５ ｍｍ 的立枯
丝核菌菌盘ꎬ距离立枯丝核菌 ２ ｃｍ 处等间距放置
３个牛津杯ꎬ分别加入枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 野生
型及其衍生菌株的菌体悬浮液 １０ μＬꎬ２５℃培养
４~５ ｄ后统计细菌菌落周围抑菌圈半径(抑菌带距
离细菌菌落边缘水平距离和垂直距离的平均值)ꎬ
每个处理 ３次重复ꎮ 根据抑菌圈大小比较各个菌
株对立枯丝核菌的抑制活性ꎮ
利用牛津杯法比较枯草芽胞杆菌脂肽提取物
对立枯丝核菌的拮抗活性ꎮ 在直径 ９ ｃｍ 的 ＰＤＡ
培养基中心位置接种直径为 ５ ｍｍ 的立枯丝核菌
菌盘ꎬ距离立枯丝核菌 ２ ｃｍ 处等间距放置 ３ 个牛
津杯ꎬ分别加入 ＮＣＤ￣２ 菌株野生型、ｐｈｏＰ 基因突
变子及其互补菌株的脂肽提取液 １５０ μＬ(约 ３００
μｇ)ꎬ２５℃静置培养 ５~７ ｄ后统计细菌菌落周围抑
菌圈半径(抑菌带距离细菌菌落边缘水平距离和
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ (５′￣３′) Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
Ｐ１ ＣＧＧｇｇａｔｃｃＣＣＡＴＣＴＴＣＧＧＴＴＡＴＴＣＴＴＴＣ ＢａｍＨⅠ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｐｈｏＰ
Ｐ２ ＣＧＧａｃｇｃｇｔＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＴ Ｍｌｕ Ⅰ
Ｐ３ ＣＧＧａｃｇｃｇｔＧＣＡＧＡＣＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＴ Ｍｌｕ Ⅰ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｐｈｏＰ
Ｐ４ ＣＧＧａｇａｔｃｔＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴ ＢｇｌⅡ
ＨＢｐｈｏＰ￣Ｕ ＧＣＧｇｇａｔｃｃＧＧＣＴＴＧＣＴＴＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴ ＢａｍＨⅠ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｐｈｏＰ
ＨＢｐｈｏＰ￣Ｄ ＧＣＣａａｇｃｔｔＴＣＴＣＣＣＧＴＴＴＧＡＣＣＣＡＴＡ ＨｉｎｄⅢ
ｐＭＡＤ￣Ｆ ＣＣＴＡＧＣＴＡＡＴＴＴＴＣＧＴＴＴＡＡＴ －
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｐＭＡＤ
ｐＭＡＤ￣Ｒ ＧＧＡＧＴＧＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＴＡ －
　 Ｎｏｔｅ: Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｓｉｔｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅ􀆰
２８１
　
　 ２期 董伟欣ꎬ等:枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２中调控因子 ＰｈｏＰ对 ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成的调控作用
垂直距离的平均值)ꎬ每个处理 ３ 次重复ꎮ 根据抑
菌圈大小比较各个菌株的脂肽提取物对立枯丝核
菌的拮抗活性ꎮ
１.５　 脂肽类抑菌物质的提取
采用正丁醇萃取的方法提取 ＮＣＤ￣２野生型菌
株及其衍生菌株中的抑菌物质ꎮ ＮＣＤ￣２ 菌株于
５ ｍＬ ＬＢ培养基中ꎬ３０℃、１８０ ｒ / ｍｉｎ 培养 １２ ｈꎬ然
后以 １％的接种量转接到 ２００ ｍＬ ＮＢ 培养基中ꎬ
３０℃、１８０ ｒ / ｍｉｎ 振荡培养 ７２ ｈꎮ 培养液于 ４℃、
８ ０００ ｒｐｍ 离心 ２０ ｍｉｎꎬ收集上清液ꎬ用 ２００ ｍＬ 正
丁醇分 ２次萃取抑菌物质ꎬ合并有机相ꎬ采用旋转
蒸发仪去除正丁醇ꎬ然后用甲醇溶解沉淀并调整浓
度为 ２ ｍｇ / ｍＬꎮ
１.６　 脂肽类抑菌物质的 ＦＰＬＣ分析
脂肽粗提物经 ０.２２ μｍ 细菌过滤器过滤ꎬ采用
ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０快速蛋白液相色谱(ＦＰＬＣ)对脂
肽提取物进行色谱分析ꎮ 色谱柱为 ＳＯＵＲＣＥ
５ＲＰＣ ＳＴ ４.６ / １５０ꎮ 流动相 Ａ 为含 ０.０６５％三氟乙
酸和 ２％乙腈的水溶液ꎬ流动相 Ｂ 为含 ０.０５％三氟
乙酸和 ８０％乙腈的水溶液ꎮ 检测波长为 ２１５ ｎｍꎬ
流速为 １ ｍＬ / ｍｉｎꎮ 梯度洗脱过程为 ５０ ｍｉｎ 内流
动相 Ａ由 １００％降至 ０ꎮ
１.７　 数据分析
采用 Ｏｒｉｇｉｎ ７.０ 软件中的方差分析(ＡＮＯＶＡ)
对试验中的数据进行统计及显著性分析ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＮＣＤ￣２ 菌株 ｐｈｏＰ 基因缺失突变子及其互
补菌株的构建
根据 ｐｈｏＰ 基因上下游序列分别设计 ４ 条引
物ꎬ以 ＮＣＤ￣２ 菌株基因组为模板ꎬ分别利用引物
Ｐ１ / Ｐ２和 Ｐ３ / Ｐ４进行 ＰＣＲ扩增ꎬ获得大小为 １ ５１０
和 １ ５８５ ｂｐ的扩增片段ꎮ ２个扩增片段经 ＥｃｏＲⅠ
酶切、连接后为模板ꎬ利用 Ｐ１ / Ｐ４引物进行 ＰＣＲ扩
增ꎬ获得大小为 ３ ０９８ ｂｐ的扩增片段ꎬ同 ＮＣＤ￣２菌
株中的 ｐｈｏＰ基因相比ꎬＰ１ / Ｐ４ 扩增片段中缺少了
４０２ ｂｐ 的片段ꎮ ｐｈｏＰ 基因的 Ｐ１ / Ｐ４ 扩增片段经
ＢａｍＨⅠ、 Ｂｇｌ Ⅱ双酶切后ꎬ插入同样双酶切的
ｐＭＡＤ质粒相应位点ꎬ即得到 ｐＭＡＤ￣ΔｐｈｏＰ 缺失
突变载体(图 １)ꎮ 以 ｐＭＡＤ 多克隆位点两侧引物
ｐＭＡＤ￣Ｆ / ｐＭＡＤ￣Ｒ为引物进行双向测序ꎬ证明重
组质粒 ｐＭＡＤ￣ΔｐｈｏＰ 中的 ｐｈｏＰ 基因内部缺失
４０２ ｂｐꎮ
　 　 将构建好的缺失突变载体转入 ＮＣＤ￣２菌株中
进行高温突变筛选ꎬ获得红霉素敏感菌株ꎮ 以敏感
菌株及 ＮＣＤ￣２野生型菌株基因组 ＤＮＡ为模板ꎬ以
Ｐ１ / Ｐ４为引物进行 ＰＣＲ扩增ꎬ结果发现ꎬ红霉素敏
感菌株的扩增片段较 ＮＣＤ￣２野生型菌株扩增片段
小约 ４００ ｂｐ(图 ２)ꎮ 以该红霉素敏感菌株 ＤＮＡ为
模板ꎬ利用引物 ＨＢｐｈｏＰ￣Ｕ和 ＨＢｐｈｏＰ￣Ｄ进行 ＰＣＲ
扩增并对扩增片段进行测序ꎬ结果证明该菌株的
ｐｈｏＰ基因中间缺少了４０２ ｂｐꎮ以上结果证明ꎬ该
Ｆｉｇ. １　 Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＰｈｏＰ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＮＣＤ￣２ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ
Ｔｈｅ ｂａｒｓ ｄｅｓｉｇｎａｔｅ ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＡＤ ｔｏ ｂｅ ｐＭＡＤ￣ΔｐｈｏＰꎬ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＨＹ３００ＰＬＫ ｔｏ
ｂｅ ｐＨＢｐｈｏＰ. Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎ ｐＨＢｐｈｏＰ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｔｈｅ ｐｈｏＰ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ.
３８１
　
植物病理学报 ４４卷
红霉素敏感菌株即为 ｐｈｏＰ 基因缺失突变子ꎬ命名
为 ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰꎮ 以 ＮＣＤ￣２ 菌株基因组 ＤＮＡ 为
模板克隆完整的 ｐｈｏＰ 基因ꎬ其中包括 ７２３ ｂｐ 的
ＣＤＳ序列以及上游 ５０７ ｂｐ的启动子区域ꎮ 将克隆
的 ｐｈｏＰ基因插入穿梭载体 ｐＨＹ３００ＰＬＫ的多克隆
位点中ꎬ构建 ｐｈｏＰ 基因的互补载体 ｐＨＢｐｈｏＰꎬ互
补获得突变子 ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ 的互补菌株ꎬ命名为
ＨＢｐｈｏＰꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ｉｎ￣ｆｒａｍｅｌｅｓｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏＰ ｉｎ Ｂａｃｉｌ￣
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤ￣２
Ｌａｎｅ Ｍ: ｌ ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣２: ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１ / Ｐ２ ａｎｄ Ｐ３ / Ｐ４ ｕｓｉｎｇ ＮＣＤ￣２ ＤＮＡ ａｓ
ｔｅｍｐｌａｔｅꎻ Ｌａｎｅ ３: ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１ / Ｐ４
ｕｓｉｎｇ ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ ＤＮＡ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅꎻ Ｌａｎｅ ４: ＰＣＲ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１ / Ｐ４ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ＮＣＤ￣２
ＤＮＡ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ.
２.２　 ＮＣＤ￣２ 菌株野生型及其衍生菌株对立枯丝
核菌的抑菌活性比较
在 ＰＤＡ培养基上比较了 ＮＣＤ￣２ 菌株野生型
及其衍生菌株对立枯丝核菌的抑菌活性ꎮ结果表
明ꎬ２５℃静置培养 ５ ｄ 后ꎬ同 ＮＣＤ￣２菌株野生型相
比ꎬ突变子 ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ 显著降低了对立枯丝核
菌的抑菌活性ꎬ而互补菌株对立枯丝核菌的抑菌能
力恢复到了野生型菌株的水平(表 ３)ꎮ 采用牛津
杯法比较了 ＮＣＤ￣２菌株野生型及其衍生菌株的脂
肽提取物对立枯丝核菌的抑菌活性ꎮ 结果表明ꎬ
２５℃静置培养 ７ ｄ后ꎬＮＣＤ￣２野生型菌株的脂肽提
取物对立枯丝核菌表现出较强的抑菌活性ꎬ突变子
ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ显著降低了对立枯丝核菌的抑菌活
性ꎬ而互补菌株的脂肽提取物对立枯丝核菌的抑菌
能力恢复到了野生型菌株的水平(表 ３)ꎮ
２.３　 ＮＣＤ￣２ 菌株野生型及其衍生菌株脂肽提取
物的色谱分析
采用正丁醇抽提法提取 ＮＣＤ￣２菌株野生型、突
变子 ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ 及其互补菌株的脂肽类物质ꎬ
ＦＰＬＣ 分析表明ꎬ野生型 ＮＣＤ￣２ 菌株在(３９. ４１ ~
４８.９５)ｍｉｎ处出现响应峰值ꎮ 前期研究证实ꎬ该峰为
ｆｅｎｇｙｃｉｎ检测峰ꎮ 与 ＮＣＤ￣２菌株野生型相比ꎬ突变
子 ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ在(３９.４１ ~ ４８.９５)ｍｉｎ 处没有出现
明显的响应峰值ꎬ证明突变子丧失了 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 产生
能力ꎬ对突变子 ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ进行互补ꎬ其互补菌株
恢复了 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 的合成能力(图 ３)ꎮ 结果证明ꎬ
ｐｈｏＰ调控 ＮＣＤ￣２菌株 ｆｅｎｇｙｃｉｎ的合成ꎮ
３　 讨论
ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ是枯草芽胞杆菌中普遍存在的双
因子调控系统ꎮ 前期研究发现ꎬ突变 ｐｈｏＲ 基因可
降低枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２ 菌株的抑菌活性ꎬ该结
果表明 ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ 双因子调控系统与 ＮＣＤ￣２ 菌
株的抑菌活性有关[１５]ꎮ ＰｈｏＲ 是一种位于细胞膜
上的组氨酸蛋白激酶ꎬ负责感应环境中的低磷信号
并激活反应调控因子￣ＰｈｏＰꎬＰｈｏＰ负责识别组氨酸
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤ￣２ ａｎｄ ｉｔｓ
ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｎ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ
Ｓｔｒａｉｎ
Ｒａｄｉｕｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｚｏｎｅ (ｍｅａｎ±ＳＤ)
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｙ Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ
ＮＣＤ￣２ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ０.８７±０.１０ ａ １.３１±０.０５ ａ
ＨＢｐｈｏＰ ０.９０±０.０５ ａ １.０９±０.０７ ａ
ＮＣＤ￣２ΔｐｈｏＰ ０.５３±０.１３ ｂ ０.３６±０.０７ ｂ
Ｔｈｅ ｄａｔａ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｂｌｅ ａｒｅ ｍｅａｎ±ＳＤ. Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｓｈｏｗ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ≤０.０５ ｌｅｖｅｌ
ｂｙ ＡＮＯＶＡ.
４８１
　
　 ２期 董伟欣ꎬ等:枯草芽胞杆菌 ＮＣＤ￣２中调控因子 ＰｈｏＰ对 ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成的调控作用
Ｆｉｇ. ３　 ＦＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＮＣＤ￣２ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ
蛋白激酶传递的信号分子并进行自身磷酸化ꎬ磷酸
化的 ＰｈｏＰ通过与靶标基因上游启动区的结合ꎬ从
转录水平或转录后水平调控下游基因的表达[６]ꎮ
细菌中双因子调控系统往往具备以下特性:①组氨
酸蛋白激酶和调控因子的编码基因处于同一个操
纵子中ꎻ②定点突变组氨酸蛋白激酶编码基因和突
变调控因子编码基因一般具有相同的性状表现ꎬ但
相比组氨酸蛋白激酶ꎬ突变调控因子后引起的性状
改变更为明显[１３]ꎮ 因此ꎬ本研究对 ＮＣＤ￣２菌株中
ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ双因子调控系统中的调控因子 ｐｈｏＰ
基因进行了定位突变ꎮ
进一步试验证明ꎬｐｈｏＰ 基因突变子的脂肽提
取物显著降低了对立枯丝核菌的拮抗活性ꎮ 前期
研究证明ꎬＮＣＤ￣２ 菌株可以产生脂肽类抗生素
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ和 ｆｅｎｇｙｃｉｎꎬ并且证明 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 在 ＮＣＤ￣２
菌株抑菌活性中发挥主要作用[１７]ꎮ 因此ꎬ推测突
变 ｐｈｏＰ基因可能影响 ＮＣＤ￣２ 菌株中 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 的
合成ꎮ 通过快速蛋白液相色谱技术(ＦＰＬＣ)比较
ＮＣＤ￣２菌株野生型和 ｐｈｏＰ 基因突变子的脂肽提
取物ꎬ结果发现ꎬｐｈｏＰ基因突变后没有改变 ＮＣＤ￣２
菌株脂肽提取物中的物质组成ꎬ即 ＮＣＤ￣２ 菌株野
生型与 ｐｈｏＰ 基因突变子的脂肽提取物具有相同
的液谱峰谱ꎮ 但 ｐｈｏＰ 基因突变子显著降低了
ｆｅｎｇｙｃｉｎ的合成能力ꎮ 因此ꎬ证明调控因子 ＰｈｏＰ
正调控 ＮＣＤ￣２ 菌株 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 的合成ꎮ 在链霉菌
中ꎬ众多研究证明 ｐｈｏＰ 基因与抑菌物质的产生有
关[９ꎬ ２１]ꎬ但在枯草芽胞杆菌中ꎬ至今尚未有关于
ｐｈｏＰ调控抑菌物质的报道ꎬ本研究结果首次证明
调控因子 ＰｈｏＰ 调控脂肽类抗生素 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 的合
成ꎮ
ＰｈｏＰ属于多效应调控因子(Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅｇｕｌａ￣
ｔｏｒ)ꎬ调控下游多个基因的表达ꎬ其中有些基因属
于直接调控ꎬ而有些基因属于间接调控ꎮ 以往研究
证实ꎬ受 ｐｈｏＰ直接调控的基因其上游启动子区域
存在明显的 ＰｈｏＰ 识别序列ꎬ即 ＴＴ(Ａ / Ｔ / Ｃ)ＡＣＡ￣
Ｎ４￣６￣ＴＴ ( ＡＴＣ) ＡＣＡ[２２]ꎮ 在枯草芽胞杆菌中ꎬ
ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成酶基因簇包含 ５ 个基因ꎬ依次是
ｆｅｎＣ、ｆｅｎＤ、ｆｅｎＥ、ｆｅｎＡ 和 ｆｅｎＢꎬ在 ｆｅｎＣ 基因上游存
在 ２个启动子区域ꎬ分别控制指数生长期和对数生
长期末期 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 的合成[２３]ꎮ 通过对 ＮＣＤ￣２ 菌
株中 ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶基因簇启动子区域进行序列
分析ꎬ没有发现 ＰｈｏＰ 特异性识别的序列ꎬ据此推
测ꎬｐｈｏＰ对 ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成的调控属于间接调控ꎬ即
磷酸化的 ＰｈｏＰ并不与 ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶基因簇的启
动子区相结合ꎬ而是通过影响下游其他基因的表达
从而间接调控 ｆｅｎｇｙｃｉｎ合成酶基因的表达ꎮ
尽管 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 对多种植物病原真菌具有较强
的拮抗活性ꎬ但在枯草芽胞杆菌中关于 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合
成的调控机制报道甚少ꎮ Ｔｓｕｇｅ 等[２４]研究发现ꎬ
ＤｅｇＱ通过调控 ＤｅｇＵ / ＤｅｇＳ 双因子调控系统的活
性从而调控枯草芽胞杆菌 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 的产生ꎮ 通过
转录组学分析研究 ＮＣＤ￣２ 菌株中 ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ 下
游调控基因以及 ＤｅｇＱ 与 ＰｈｏＲ / ＰｈｏＰ 之间的关
系ꎬ将丰富人们对枯草芽胞杆菌中 ｆｅｎｇｙｃｉｎ 合成调
控途径的理解ꎬ为生防枯草芽胞杆菌的遗传改良和
明确生防菌的作用机理提供理论依据ꎮ
５８１
　
植物病理学报 ４４卷
参考文献
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ｔｏｒ ａｆｓＳ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ: ＰｈｏＰ ａｎｄ ＡｆｓＲ ａｒｅ ｏｖｅｒｌａｐ￣
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ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｎｐｒＲ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｃｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
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[２１] Ｍａｒｔíｎ Ｊ Ｆꎬ Ｓａｎｔｏｓ￣Ｂｅｎｅｉｔ Ｆꎬ Ｒｏｄｒíｇｕｅｚ￣Ｇａｒｃíａ Ａꎬ
ｅｔ ａｌ. Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ
ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ [ Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ￣
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[２２] Ｅｄｅｒ Ｓꎬ Ｌｉｕ Ｗꎬ Ｈｕｌｅｔｔ Ｆ Ｍ. Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｈｏＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ: ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
ＰｈｏＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏ ｒｅｇｕｌｏｎ
ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９９９ꎬ １８１
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[２３] Ｋｅ Ｗ Ｊꎬ Ｃｈａｎｇ Ｂ Ｙꎬ Ｌｉｎ Ｔ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｆｅｎｇｙｃｉｎ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｏｐｅｒｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＵＰ
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[２４] Ｔｓｕｇｅ Ｋꎬ Ａｎｏ Ｔꎬ Ｈｉｒａｉ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｓ ｄｅｇＱꎬ
ｐｐｓꎬ ａｎｄ ｌｐａ￣８ (ｓｆｐ) ａｒｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ｔｏ ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ [ Ｊ ] .
Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙꎬ １９９９ꎬ ４３
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责任编辑:于金枝
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