全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１５， ４２（６）： ９０８ － ９１３ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００７
基金项目：国家现代农业（玉米）产业技术体系（ＣＡＲＳ⁃０２⁃１５），国家自然科学基金（３１４０１７０２）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｌｉｘｉａｏｍａｉｚｅ＠ １６３． ｃｏｍ； 收稿日期： ２０１５ － ０４ － ２１
我国玉米灰斑病菌遗传多样性的 ＩＳＳＲ分析
张小飞１ 　 李　 晓１∗　 崔丽娜１ 　 邹成佳１ 　 李　 菁２ 　 龙永昌３
（１．四川省农业科学院植物保护研究所， 农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室， 成都 ６１００６６；
２．西安文理学院， 西安 ７１００６５； ３．凉山州西昌农业科学研究所， 西昌 ６１５０００）
摘要： 为明确我国发生的玉米灰斑病菌地理差异及遗传结构，利用简单序列重复区间（ ＩＳＳＲ）对玉
米灰斑病菌遗传多样性进行了分析，并利用尾孢菌特异引物对分离自四川、云南、湖北、贵州等西南
地区的 １６ 个玉米灰斑病菌菌株进行了分子鉴定。 结果显示，通过 ＩＳＳＲ标记筛选出 １０ 个扩增多态
性好且稳定的通用引物，共扩增出 ８１ 条 ＤＮＡ 条带，均为多态性条带，扩增片段大小在 ２００ ～
２ ０００ ｂｐ之间，菌株遗传相似系数为 ０􀆰 １９ ～ １􀆰 ００。 在遗传相似系数为 ０􀆰 １９ 时，供试菌株被聚为 ２
大类群，来自西南地区和东北地区的菌株各自聚为一组，在 ＤＮＡ 水平上表现出明显差异，认为是 ２
类不同的致病类群。 分子鉴定结果显示引起西南各地区玉米灰斑病的主要致病菌均为玉米尾孢菌
Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅｉｎａ。 表明我国玉米灰斑病菌存在丰富的遗传多样性，ＩＳＳＲ 标记可揭示出玉米灰斑病
菌株间的亲缘关系及遗传差异性，可用于其遗传多样性研究。
关键词： 玉米灰斑病菌； 简单序列重复区间； 遗传多样性； 聚类分析
Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ． ｂｙ ＩＳＳＲ ｉｎ Ｃｈｉｎａ
Ｚｈａｎｇ Ｘｉａｏｆｅｉ１ 　 Ｌｉ Ｘｉａｏ１∗ 　 Ｃｕｉ Ｌｉｎａ１ 　 Ｚｏｕ Ｃｈｅｎｇｊｉａ１ 　 Ｌｉ Ｊｉｎｇ２ 　 Ｌｏｎｇ Ｙｏｎｇｃｈａｎｇ３
（１． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｃｒｏｐｓ ｉｎ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ； Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００６６， Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｘｉ’ａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉ’ａｎ ７１００６５， Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｘｉｃｈａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｘｉｃｈａｎｇ ６１５０００， Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ
ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｃａｕｓｉｎｇ ｍａｉｚｅ ｇｒａｙ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａ， ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ２９ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ，
ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ， ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒ⁃ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ
（ ＩＳＳＲ）． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ８１ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ １０ ｐｒｉｍｅｒｓ， ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ２００ －
２ ０００ ｂｐ， ａｎｄ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ０􀆰 １９ － １􀆰 ００． Ａｔ ｓｉｍｉｌａｒ
ｌｅｖｅｌ ｏｆ ０􀆰 １９， ａｌｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｒｏｕｐｓ． Ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｍａｉｚｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ
ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ ａｎｄ ｎｏｒｔｈｅａｓｔ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｔｗｏ Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃａｕｓｉｎｇ ｇｒａｙ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ． Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １６ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒａｙ
ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅｉｎａ． ＩＳＳＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ａｎｄ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｔｅｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ａｎｄ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ａｂｕｎｄａｎｔ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ； ＩＳＳＲ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ； ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ
　 　 灰斑病是由尾孢菌 Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ 侵染引起的一种
世界性玉米叶部病害，该病于 １９２４ 年在美国伊利诺
伊州首次被发现（Ｔｅｈｏｎ，１９２４），随后逐步蔓延至世
界主要玉米种植区（Ｌａｔｔｅｒｅｌｌ ＆ Ｒｏｓｓｉ，１９８３；Ｎｕｔｔｅｒ ＆
Ｊｅｎｃｏ，１９９２）。 我国于 １９９１ 年在辽宁丹东地区首次
发现该病（陈刚和张铁一，１９９３），至今在辽宁、吉林
和黑龙江等北方春玉米区普遍发生 （王晓鸣等，
２００６），在云南、四川、湖北等西南玉米区的发生呈
快速上升趋势，已成为玉米生产中最重要的叶部病
害 （黄必华等， ２００９；王黎明等， ２００９；李晓等，
２０１１）。 特别是在山区和高海拔玉米种植区，低温、
高湿等条件更促进了灰斑病的流行和迅速蔓延，对
玉米生产造成了很大威胁。 目前，对玉米灰斑病的
病原学（张益先等，２００３；崔丽娜等，２０１２）、发生流
行规律（高增贵等，２０００；Ｃｒｏｕｓ ｅｔ ａｌ． ，２００６）已有较
多研究和报道，而对玉米灰斑病菌遗传多样性研究
较少，且局限于局部地区的病原菌研究（任智惠等，
２０１１）。
目前简单序列重复区间（ ｉｎｔｅｒ⁃ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔｓ，ＩＳＳＲ）分子标记技术在作物遗传多样性研
究、遗传图谱构建、分子标记辅助育种及品种纯度鉴
定方面得到了广泛应用（Ｐｒｅｖｏｓｔ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，１９９９；
Ｍａｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ． ，２００３），在植物病原菌研究方面也有
相关报道，尤其在对病原菌遗传背景了解较少的情
况下，该技术是研究病原菌群体遗传多样性较理想
的分子标记方法，已应用于玉米大斑病菌 Ｅｘｓｅｒｏｈｉ⁃
ｌｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ （谷守芹等，２００８）、玉米丝黑穗病菌
Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ ｒｅｉｌｉａｎａ（张小飞等，２０１０）、小麦白粉病
菌 Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ（贾少锋等，２００７）和镰孢菌 Ｆｕ⁃
ｓａｒｉｕｍ（李蕊倩等，２００９）等植物病原菌遗传多样性
的研究，但利用 ＩＳＳＲ技术研究玉米灰斑病菌遗传多
样性尚未见报道。 因此，本研究采用 ＩＳＳＲ分子标记
技术，从 ＤＮＡ水平上分析我国不同来源的玉米灰斑
病菌群体内遗传变异的情况，并采用尾孢菌特异引
物对西南地区的灰斑病致病种进行鉴定，以期为了
解我国各玉米产区灰斑病菌的遗传结构，明确不同
地域种群间的遗传关系，研究该病害流行与发生规
律提供信息。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株：２０１１—２０１３ 年采集玉米灰斑病普遍
发生的四川、云南、湖北、贵州等西南地区与辽宁、吉
林、黑龙江等东北地区的玉米灰斑病标样，采用单孢
分离法获得 ２９ 个分离物，编号 １ ～ １６ 的菌株来自西
南地区，编号 １７ ～ ２９ 的菌株来自东北地区。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂 （ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基：马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、琼脂
２０ ｇ，水 １ ０００ ｍＬ；菌株扩繁用马铃薯葡萄糖（ｐｏｔａｔｏ
ｄｅｘｔｒｏｓｅ，ＰＤ）液体培养基：即 ＰＤＡ中不添加琼脂粉。
试剂及仪器：ＤＮＡ 提取试剂盒，天根生物技术
（北京）有限公司；Ｔａｑ 酶、ｄＮＴＰ，北京康为世纪科技
有限公司；供试引物由生工生物工程（上海）股份有
限公司合成。 Ｐｒｉｍｅ基因扩增仪，英国 Ｔｅｃｈｎｅ公司；
Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ Ｓｙｓｔｅｍ 凝胶成像系统、水平电泳系统
Ｗｉｄｅ Ｍｉｎｉ⁃ｓｕｂ ＧＴ电泳槽，美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 玉米灰斑病菌基因组 ＤＮＡ的提取
供试 ２９ 个菌株分别接种于 ＰＤ 液体培养基中，
２５℃振荡培养 ７ ｄ，收集菌丝后烘干，加液氮研磨成
干粉。 采用 ＤＮＡ 提取试剂盒提取基因组 ＤＮＡ，具
体操作参照试剂盒说明书进行。 供试菌株 ＤＮＡ 统
一稀释到 ３０ ｎｇ ／ μＬ备用。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＩＳＳＲ引物筛选及 ＰＣＲ扩增
ＩＳＳＲ引物是根据植物病原真菌基因组 ＤＮＡ 重
复序列的特征，从加拿大哥伦比亚大学提供的 ＩＳＳＲ
引物中选出。 通过对 ２０ 个供试引物进行梯度优化，
获得最适退火温度，筛选扩增条带清晰并且多态性
高的引物。 尾孢菌 Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ 的鉴定根据 Ｃｒｏｕｓ ｅｔ
ａｌ． （２００６）所采用的特异性引物组合，引物名称和序
列如下：ＣＹＬＨ３Ｆ：５′⁃ＡＧＧＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧ⁃３′；
ＣＹＬＨ３Ｒ：５′⁃ＡＧＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＴＴＧＧＡＣＴＧ⁃３′；Ｃｚｅａｅ⁃
ＨＩＳＴ：５′⁃ＴＣＧＡＣＴＣＧＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＧ⁃３′；ＣｚｅｉｎａＨＩＳＴ：
５′⁃ＴＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＧＴ⁃３′；ＣｍａｉｚｅＨＩＳＴ：５′⁃ＴＣ⁃
ＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＣ⁃３′。
ＩＳＳＲ反应体系：１０ × Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ （Ｍｇ２ ＋ ）、１０
μｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰ ０􀆰 ６ μＬ、５ Ｕ ／ μＬ Ｔａｑ 酶 ０􀆰 ２ μＬ、１０
μｍｏｌ ／ Ｌ 引物 １􀆰 ５ μＬ、 ＤＮＡ 模板 １ μＬ （ ３０ ｎｇ）、
ｄｄＨ２Ｏ补足至 ２０ μＬ。 反应程序：９４℃ ２ ｍｉｎ；５５℃
４０ ｓ，７２℃ ３０ ｓ，１ 个循环；９２℃ ２０ ｓ，５２ ～ ６０℃ ４０ ｓ，
７２℃ ３０ ｓ，２９ 个循环；７２℃ ２ ｍｉｎ，１ 个循环。
特异引物扩增体系：１０ × Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ（Ｍｇ２ ＋ ）、１０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰ ０􀆰 ５ μＬ、５ Ｕ ／ μＬ Ｔａｑ 酶 ０􀆰 ２ μＬ、１０
μｍｏｌ ／ Ｌ 引物 ＣｙｌＨ３Ｆ １􀆰 ４ μＬ、 １０ μｍｏｌ ／ Ｌ 引物
ＣｙｌＨ３Ｒ ０􀆰 ６ μＬ、特异引物 ＣｚｅａｅＨＩＳＴ、ＣｚｅｉｎａＨＩＳＴ、
ＣｍａｉｚｅＨＩＳＴ分别为 ０􀆰 ８ μＬ（１０ μｍｏｌ ／ Ｌ）、ＤＮＡ 模板
１ μＬ （３０ ｎｇ）， ｄｄＨ２Ｏ 补足至 ２０ μＬ。 反应程序：
９４℃ ４ ｍｉｎ；９４℃ ２０ ｓ，５８℃ ３０ ｓ，７２℃ ４０ ｓ，１５ 个循
环；９４℃，２０ ｓ，５５℃ ３０ ｓ，７２℃ ４０ ｓ，２５ 个循环；
７２℃ ５ ｍｉｎ。 ＰＣＲ 结束后，取 ５ μＬ ＰＣＲ 产物进行
电泳检测，凝胶成像系统分析扩增效果，并拍照、
记录条带。
９０９６ 期 张小飞等： 我国玉米灰斑病菌遗传多样性的 ＩＳＳＲ分析
１􀆰 ２􀆰 ３ 供试菌株 ＩＳＳＲ扩增聚类分析
对清晰可辨的电泳条带按扩增条带有无记数，
当某一扩增带出现时，赋值为“１”，不存在时赋值为
“０”，从而把图形资料转换成数据资料。 根据 Ｎｅｉ⁃Ｌｉ
相似系数法求得菌株 ｉ 和 ｊ 之间的相似系数 ＧＳｉｊ，
ＧＳｉｊ ＝ ２Ｎｉｊ ／ （Ｎｉ ＋ Ｎ ｊ），其中，Ｎｉ表示菌株 ｉ 的条带数
目，Ｎ ｊ表示菌株 ｊ 的条带数目，Ｎｉｊ表示菌株 ｉ、 ｊ 共有
的条带数目。 利用 ＮＴＳＹＳ ２􀆰 １ 软件计算菌株间的
Ｄｉｃｅ相似系数，以 ＵＰＧＭＡ法进行聚类分析。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 基因组 ＤＮＡ提取
采用基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒提取了供试菌株
的基因组 ＤＮＡ，其 Ａ２６０ ／ Ａ２８０在 １􀆰 ８ ～ ２􀆰 ０ 之间，纯度
较好，适合进行 ＩＳＳＲ分析。
２􀆰 ２ ＩＳＳＲ引物筛选及 ＰＣＲ扩增结果
通过对 ２０ 个引物进行梯度优化，有 １０ 个引物
能找到理想的退火温度，分布于 ４２ ～ ６０℃之间，扩
增条带清晰且多态性高（表 １），其余引物扩增产物
都有较强的弥散背景，扩增条带较弱。
用筛选获得的 １０ 个通用引物分别对 ２９ 株玉米
灰斑病菌进行 ＩＳＳＲ 扩增，共产生 ８１ 条 ＤＮＡ 条带，
片段大小分布于 ２００ ～ ２ ０００ ｂｐ之间，并呈现出不同
程度的多态性。 同一引物扩增的玉米灰斑病菌
ＤＮＡ图谱带较相似，但也存在一定的差异，不同引
物扩增的病菌 ＤＮＡ遗传图谱差异较大，反映出玉米
灰斑病菌存在较丰富的遗传多样性，表明 ＩＳＳＲ标记
可以很好地揭示供试菌株间的遗传差异和亲缘关
系。 根据扩增图谱可以将东北地区和西南地区的菌
株完全区别开来，采自云南、贵州、四川、湖北的菌株
与采自黑龙江、吉林、辽宁的菌株在较多的遗传位点
存在差异，在２ ０００ ｂｐ处来自东北地区的菌株有明
显特异性条带（图 １），反映出不同区域灰斑病菌之
间的差异。
表 １ ＩＳＳＲ扩增引物筛选结果
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
核苷酸碱基序列 ５′⁃３′
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５′⁃３′
退火温度 （℃）
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒ
ＩＳＳＲ标记
Ｓｃｏｒｅｄ
ｂａｎｄｓ
多态性标记数
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性位点频率 （％ ）
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｏｈｉｘ ｌｏｃｉ
ＩＳＳＲ１ （ＡＧ） ８Ｔ ５２ ８ ８ １００
ＩＳＳＲ２ （ＡＧ） ８Ｃ ４２ ８ ８ １００
ＩＳＳＲ４ （ＴＣ） ８Ｃ ５５ ９ ９ １００
ＩＳＳＲ５ （ＡＣ） ８Ｔ ５２ ５ ５ １００
ＩＳＳＲ８ （ＧＡ） ８ＣＴＴ ５５ ９ ９ １００
ＩＳＳＲ９ （ＧＡ） ８ＣＴＣ ５７ １０ １０ １００
ＩＳＳＲ１２ ＡＣＴＣＧＴ（ＧＡ） ７ ６０ ７ ７ １００
ＩＳＳＲ１３ ＣＧＴＡＣＴＣＧＴ（ＧＡ） ７ ５６ ４ ４ １００
ＩＳＳＲ１４ ＡＧＴＡＣＧＡＧＴ（ＴＣ） ７ ６０ １１ １１ １００
ＩＳＳＲ１５ ＣＧＴＡＧＴ（ＣＡ） ７ ６０ １０ １０ １００
合计 Ｔｏｔａｌ ８１ ８１ １００
图 １ 引物 ＩＳＳＲ２ 对供试菌株的扩增图谱
Ｆｉｇ． １ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ＩＳＳＲ２ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｔｅｓｔｅｄ
Ｍ： ＤＬ２０００； １ ～ １６：西南地区菌株； １７ ～ ２９：东北地区菌株。 Ｍ： ＤＬ２０００； １ － １６： ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ； １７ － ２９：
ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ． 　
０１９ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
　 　 利用尾孢菌特异引物对分离自四川、云南、湖北
等西南地区的灰斑病致病种基因组 ＤＮＡ 进行 ＰＣＲ
扩增，供试引物均产生特异性条带，不同特异性引物
组合的扩增条带数有差异，玉米尾孢菌的特异性引
物 ＣｚｅｉｎａＨＩＳＴ对所有供试菌株不仅能扩增出 ３８９
ｂｐ的条带，还能扩增出 ２８４ ｂｐ的特异条带。 玉蜀黍
尾孢菌特异性引物 ＣｚｅａｅＨＩＳＴ和未定种尾孢菌 Ｃｅｒ⁃
ｃｏｓｐｏｒａ ｓｐ．的特异性引物 ＣｍａｉｚｅＨＩＳＴ组合对每个样
品均能扩增出 ３８９ ｂｐ的条带，而扩增不出 ２８４ ｂｐ的
特异条带，表明采集自西南地区的供试菌株均为玉
米尾孢菌 Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅｉｎａ。
２􀆰 ３ 供试菌株 ＩＳＳＲ扩增聚类分析结果
供试 ２９ 个玉米灰斑病菌菌株 ＩＳＳＲ扩增结果的
聚类分析表明（图 ２），供试菌株间的相似系数在
０􀆰 １９ ～ １􀆰 ００ 之间，不同菌株间相似程度明显不同。
相似系数最高的几对菌株分别是编号 ４ 和 ８、１０ 和
１４、１３ 和 １６、１７ 和 ２４、２１ 和 ２７，相似系数均高达
１􀆰 ００，包括了来自云南、湖北、四川、贵州的菌株，菌
株间同源性强，无显著的遗传变异；相似系数最低的
菌株分别是来自西南地区和东北地区的菌株，如 ６
和 ２０，为 ０􀆰 １６，来自云南德宏和黑龙江哈尔滨，在
ＤＮＡ水平上存在明显差异。 当遗传相似系数在
０􀆰 １９ 时，可将供试玉米灰斑病菌分为 ２ 大类群，来
自西南地区与东北地区的菌株各自聚为 １ 组，表明
不同地理来源的灰斑病菌在遗传上存在很大差异。
遗传相似系数为 ０􀆰 ９６ 时，第 １ 大类群又可划分为 ４
个小亚群，亚群内不同菌株表现出了一定的遗传多
样性；第 ２ 大类群又可划分 ３ 个亚群。 ２ 大类群分
别包含了来自不同省份的菌株，亚群内遗传多样性
与地理来源之间无明显的相关性。
图 ２ 供试菌株在 ＤＮＡ水平上的聚类分析图
Ｆｉｇ． ２ Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｔｅｓｔｅｄ ａｔ ＤＮＡ ｌｅｖｅｌ
　
３ 讨论
近年来，随着分子生物学的迅速发展，ＤＮＡ 分
子标记技术已被广泛地应用于生物群体遗传多样性
研究，如 ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、 ＳＳＲ、ＡＦＬＰ 等 （ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ． ，
１９９５；Ｂａｉ ｅｔ ａｌ． ，１９９７；Ｂｅｒｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ． ，２０００）。 ＩＳＳＲ
是一种基于微卫星序列发展起来的新的分子标记
（Ｍａｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ． ，２００３），具有简便迅速、稳定高效、
ＤＮＡ多态性高等优点，与 ＲＡＰＤ 相比有更好的可重
复性和稳定性，且扩增时退火温度比较高，可保证
ＰＣＲ扩增的可重复性（徐玉梅等，２０１１），不足的是
ＩＳＳＲ标记 ＰＣＲ扩增反应的最适条件需要一定时间
的摸索，本研究通过对 ＩＳＳＲ标记引物退火温度进行
梯度优化，确定了每个引物的最适退火温度，达到了
１１９６ 期 张小飞等： 我国玉米灰斑病菌遗传多样性的 ＩＳＳＲ分析
理想的效果。
本研究应用 ＩＳＳＲ 分子标记对我国不同地区采
集分离的玉米灰斑病菌遗传多样性进行了聚类分
析，结果显示玉米灰斑病菌表现出了明显的遗传分
化，分离自西南地区与东北地区的菌株明显分为 ２
个类群，遗传变异区域性非常明显，而分别在 ２ 个大
类群下不同亚群间的菌株还没有发生大量的分化现
象，并且遗传变异区域性不是很明显，说明 ＩＳＳＲ 技
术可用于玉米灰斑病菌亲缘关系的分析。 Ｗａｎｇ ｅｔ
ａｌ． （１９９８）采用 ＡＦＬＰ 方法将来自美国不同地区的
９１ 个玉米灰斑病菌菌株分成Ⅰ和Ⅱ组，Ｃｒｏｕｓ ｅｔ ａｌ．
（２００６）等经过系统的形态学、培养特征和分子特征
研究，认为Ⅰ组的菌株为玉蜀黍尾孢菌，而Ⅱ组为玉
米尾孢菌。 本研究采用 ＩＳＳＲ 标记对我国玉米灰斑
病的聚类结果与其有类似之处。 任智惠等（２０１１）
曾用 ＲＡＰＤ标记对玉米灰斑病菌的遗传多样性进行
研究，表明灰斑病菌存在一定的遗传分化。 不过相
对于 ＲＡＰＤ标记而言，由于 ＩＳＳＲ引物核苷酸链的延
长，退火温度较高，扩增的稳定性也得到增强。
关于我国玉米灰斑病的病原菌，长期以来国内
研究者认为是玉蜀黍尾孢菌 Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚｅａｅ⁃ｍａｙｄｉｓ，
刘可杰等（２０１３）报道云南地区发生的玉米灰斑病
病原菌与北方地区玉米灰斑病病原菌—玉蜀黍尾孢
菌明显不同，分属于不同的致病种；刘庆奎等
（２０１３）报道我国玉米灰斑病的病原菌有 ２ 个种，即
玉蜀黍尾孢菌和玉米尾孢菌，前者存在于东北地区
的黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和山东，后者分布在西
南地区的云南、湖北。 本研究利用 ＩＳＳＲ标记从遗传
多样性的角度上证实了这一结论，初步认为我国玉
米灰斑病菌分为 ２ 个大的类群；同时采用特异性引
物对西南地区采集的玉米灰斑病菌种属鉴定发现，
在四川、湖北、云南、贵州发生的玉米灰斑病病原菌
是玉米尾孢菌 Ｃ． ｚｅｉｎａ，而不是玉蜀黍尾孢菌 Ｃ． ｚｅ⁃
ａｅ⁃ｍａｙｄｉｓ，并且从云南地区分离的灰斑病菌鉴定结
果与刘可杰等（２０１３）一致。 本课题组研究认为在
西南地区和东北地区发生的灰斑病病害症状虽然相
似，但病菌的致病力有所不同，如在北方表现抗病的
自交系在西南地区表现感病，说明品种的抗性反应
会因病原菌致病种的不同而有所差异（张小飞等，
２０１４）。 近几年，玉米尾孢菌侵染引起的玉米灰斑
病已经成为我国西南地区玉米上继玉米大、小斑病
之后的又一种重要叶部病害，危害极为严重，应尽快
对该病病原菌的生物特性、发生规律以及抗病品种
培育等防治措施开展系统深入的研究，以有效控制
玉米灰斑病的危害。 由于本研究中采集到的病菌数
量有限，只能对玉米灰斑病菌作初步划分，若对其进
一步更细致地划分，尚需进行相关的鉴定工作和更
全面的比较研究。
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（责任编辑：李美娟）
３１９６ 期 张小飞等： 我国玉米灰斑病菌遗传多样性的 ＩＳＳＲ分析