全 文 ：第 源员 卷摇 第 源 期
圆园员源 年 愿 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 源
粤怎早援 摇 圆园员源
摇
基金项目院 转基因生物新品种培育科技重大专项渊圆园园愿在载园愿园园源鄄园园源冤袁国家自然科学基金渊猿员员苑员缘苑源袁猿员猿苑员远源远袁猿员员园员员远源冤袁农业部大豆
产业技术体系渊悦粤砸杂鄄园园源冤
作者简介院 高乐袁男袁员怨愿苑年生袁博士研究生袁研究方向为转基因大豆抗病品种培育袁 耘鄄皂葬蚤造院 圆园员园员园员员远园岳 灶躁葬怎援 藻凿怎援 糟灶
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 扎澡躁岳 灶躁葬怎援 藻凿怎援 糟灶
收稿日期院 圆园员猿 原 员圆 原 猿园
大豆花叶病毒 悦孕基因 砸晕粤蚤载体的
构建及大豆遗传转化
高摇 乐摇 翟摇 锐摇 丁雪妮摇 李摇 凯摇 廖文林摇 智海剑鄢
渊南京农业大学国家大豆改良中心袁 作物遗传与种质创新国家重点实验室袁 农业部大豆
生物学与遗传育种重点实验室袁 南京 圆员园园怨缘冤
摘要院 为获得含有大豆花叶病毒渊杂燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁 杂酝灾冤悦孕 基因干扰片段的转基因大豆新材
料袁对 员员 个 杂酝灾流行株系的 悦孕基因进行了核苷酸序列比对袁采用 郧粤栽耘宰粤再技术构建了 砸晕粤干
扰渊砸晕粤 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻袁 砸晕粤蚤冤载体 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤 鄄悦孕蚤袁对重组载体测序比对袁通过酶切以及 孕悦砸
方法鉴定载体袁并利用农杆菌介导的转基因体系进行大豆遗传转化遥 克隆出 圆远源 遭责 高度保守的
悦孕蚤干扰片段袁通过测序证实其与目标序列的匹配度达到 员园园豫 曰重组质粒经过 载遭葬玉单酶切后出
现 苑愿猿 遭责和 员园 愿员愿 遭责两条带袁经过 耘糟燥砸玉尧匀蚤灶凿 芋双酶切后出现 圆 圆缘远 遭责和 怨 猿源远 遭责两条带袁说明
圆 个 糟糟凿月结合位点均被 悦孕蚤取代曰孕悦砸反应得到 源苑源 遭责 和 源远园 遭责 两条带袁说明 悦孕蚤 以反向重复形
式与 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤组合遥 共获得 员园 棵 栽园 代转基因幼苗袁经除草剂涂抹尧孕悦砸尧孕粤栽 辕 遭葬则转基因
检测试纸检测后袁远 株为阳性袁表明该方法可筛选出对大豆花叶病毒具有抗性的转基因大豆新种
质袁为 杂酝灾抗病育种工程提供良好的亲本材料遥
关键词院 大豆花叶病毒曰 悦孕基因曰 砸晕粤蚤曰 郧粤栽耘宰粤再技术曰 农杆菌介导大豆转基因
砸晕粤蚤 增藻糟贼燥则 糟燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 燥枣 杂燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽 悦孕 早藻灶藻
葬灶凿 泽燥赠遭藻葬灶 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
郧葬燥 蕴藻摇 在澡葬蚤 砸怎蚤摇 阅蚤灶早 载怎藻灶蚤摇 蕴蚤 运葬蚤摇 蕴蚤葬燥 宰藻灶造蚤灶摇 在澡蚤 匀葬蚤躁蚤葬灶鄢
渊杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 枣燥则 悦则燥责 郧藻灶藻贼蚤糟泽 葬灶凿 郧藻则皂责造葬泽皂 耘灶澡葬灶糟藻皂藻灶贼袁 晕葬贼蚤燥灶葬造 悦藻灶贼藻则 枣燥则 杂燥赠遭藻葬灶 陨皂责则燥增藻皂藻灶贼袁
晕葬灶躁蚤灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠曰 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 月蚤燥造燥早赠 葬灶凿 郧藻灶藻贼蚤糟 陨皂责则燥增藻皂藻灶贼 燥枣 杂燥赠遭藻葬灶袁
酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 晕葬灶躁蚤灶早 圆员园园怨缘袁 允蚤葬灶早泽怎 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 燥遭贼葬蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽燥赠遭藻葬灶 责造葬灶贼泽 糟葬则则赠蚤灶早 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 杂燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟
增蚤则怎泽 渊杂酝灾冤 悦孕 早藻灶藻袁 泽藻择怎藻灶糟藻 葬造蚤早灶皂藻灶贼 燥枣 悦孕 早藻灶藻泽 燥枣 员员 责燥责怎造葬则 杂酝灾 泽贼则葬蚤灶泽 憎葬泽 糟燥灶凿怎糟贼藻凿 葬灶凿
贼澡藻 砸晕粤 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻 渊 砸晕粤蚤 冤 增藻糟贼燥则 责月苑郧宰陨宰郧圆 渊 域冤鄄悦孕蚤 憎葬泽 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿 怎泽蚤灶早 郧粤栽耘宰粤再
贼藻糟澡灶燥造燥早赠援 栽澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 增藻糟贼燥则 憎葬泽 泽藻择怎藻灶糟藻凿 葬灶凿 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 遭赠 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 藻灶扎赠皂藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 葬灶凿
孕悦砸援 杂燥赠遭藻葬灶 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 憎葬泽 糟燥灶凿怎糟贼藻凿 贼澡则燥怎早澡 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 泽赠泽贼藻皂援 栽澡藻 皂燥泽贼 糟燥灶泽藻则增藻凿
蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻 枣则葬早皂藻灶贼 灶葬皂藻凿 悦孕蚤 憎葬泽 糟造燥灶藻凿袁 憎澡蚤糟澡 憎葬泽 圆远源 遭责 蚤灶 造藻灶早贼澡袁 葬灶凿 贼澡藻 泽藻择怎藻灶糟蚤灶早 则藻泽怎造贼泽
泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 皂葬贼糟澡蚤灶早 则葬贼藻 憎葬泽 员园园豫 曰 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 增藻糟贼燥则 憎葬泽 凿蚤早藻泽贼藻凿 蚤灶贼燥 贼憎燥 遭葬灶凿泽 燥枣 苑愿猿 遭责
葬灶凿 员园 愿员愿 遭责 憎蚤贼澡 载遭葬玉袁 葬灶凿 圆 圆缘远 遭责 葬灶凿 怨 猿源远 遭责 憎蚤贼澡 耘糟燥砸玉 皂蚤曾藻凿 憎蚤贼澡 匀蚤灶凿 芋袁 蚤灶凿蚤糟葬贼蚤灶早 贼澡葬贼
贼澡藻 贼憎燥 糟糟凿月 泽蚤贼藻泽 憎藻则藻 遭燥贼澡 则藻责造葬糟藻凿 遭赠 悦孕蚤曰 贼憎燥 遭葬灶凿泽 燥枣 源苑源 遭责 葬灶凿 源远园 遭责 憎藻则藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿 葬枣贼藻则 孕悦砸
葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶袁 蚤灶凿蚤糟葬贼蚤灶早 贼澡葬贼 贼澡藻 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 悦孕蚤 枣燥则皂藻凿 贼澡藻 蚤灶增藻则贼藻凿 则藻责藻葬贼 泽贼则怎糟贼怎则藻 蚤灶
责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤援 栽藻灶 栽园 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽藻藻凿造蚤灶早泽 憎藻则藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿 贼澡则燥怎早澡 泽燥赠遭藻葬灶 早藻灶藻贼蚤糟 藻灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 葬灶凿泽蚤曾 责造葬灶贼泽 憎藻则藻 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 贼燥 遭藻 责燥泽蚤贼蚤增藻 贼澡则燥怎早澡 澡藻则遭蚤糟蚤凿藻 责葬蚤灶贼蚤灶早袁 孕悦砸 葬灶凿 匝怎蚤糟噪杂贼蚤曾 运蚤贼 枣燥则 蕴蚤遭藻则贼赠
蕴蚤灶噪 渊遭葬则冤袁 凿藻皂燥灶泽贼则葬贼蚤灶早 贼澡葬贼 贼澡藻 皂藻贼澡燥凿 糟燥怎造凿 遭藻 葬责责造蚤藻凿 枣燥则 泽糟则藻藻灶蚤灶早 灶藻憎 早藻则皂责造葬泽皂 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟
泽燥赠遭藻葬灶泽 则藻泽蚤泽贼葬灶贼 贼燥 杂酝灾袁 憎澡蚤糟澡 责则燥增蚤凿藻泽 贼澡藻 责葬则藻灶贼 皂葬贼藻则蚤葬造泽 枣燥则 杂酝灾 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 遭则藻藻凿蚤灶早援
运藻赠 憎燥则凿泽院 杂燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽曰 悦孕 早藻灶藻曰 砸晕粤蚤曰 郧粤栽耘宰粤再 贼藻糟澡灶燥造燥早赠曰 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿
泽燥赠遭藻葬灶 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
摇 摇 大豆起源于中国袁在我国有五千多年的栽培历
史袁不仅是重要的油料作物袁也是人类主要的植物性
蛋白来源遥 大豆在其生长过程中受到多种病虫害的
影响袁而大豆花叶病毒渊杂燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁 杂酝灾冤
引致的病毒病危害最大袁在世界各大豆产区均有发
生袁严重影响大豆的产量和品质咱员暂 遥
由于 杂酝灾 存在复杂的株系分化咱圆暂 袁大豆对
杂酝灾的抗性又具有株系专化性咱猿暂 袁因此很难培育出
对 杂酝灾 具有广谱抗性的品种袁而且 杂酝灾 具有较强
的变异性袁传统方法培育的抗病品种容易因株系的
突变而丧失抗性遥 据报道韩国和日本曾发生抗病品
种抗性丧失的现象咱源 原 缘暂 遥 田间大豆发病往往是由
杂酝灾多株系混合侵染造成咱远暂 袁因此应用大豆转基因
技术快速培育具有广谱尧持久抗性的品种对大豆花
叶病毒的防治具有现实意义遥
员怨愿远 年袁粤遭藻造 等咱苑暂将烟草花叶病毒 渊 栽燥遭葬糟糟燥
皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁 栽酝灾冤的 悦孕基因导入烟草并首次获得
了对 栽酝灾具有抗性的转基因烟草袁这为利用病毒自
身基因创制抗病材料提供了新的思路遥 匀蚤灶糟澡藻藻
等咱愿暂和 酝糟悦葬遭藻等咱怨暂分别利用农杆菌介导大豆子叶
节和基因枪轰击大豆未成熟胚的方法首次获得了转
基因大豆植株袁在大豆遗传转化领域取得了突破性
进展袁使得通过转基因手段培育具有广谱抗性的大
豆新种质成为可能遥 在前人研究的基础上袁宰葬灶早
等咱员园暂和 云怎则怎贼葬灶蚤 等咱员员暂将携带有大豆花叶病毒 悦孕
基因的过量表达载体转入大豆体内袁并且在后代筛
选得到了高抗 杂酝灾 的大豆品系袁但随着研究的深
入袁他们均在高世代转基因大豆中发现了 砸晕粤介导
的抗性 渊 砸晕粤鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻冤 咱员园袁员圆暂 遥 员怨怨园 年袁
晕葬责燥造蚤等咱员猿暂将色素基因 悦匀杂 导入紫色牵牛花中以
期加深花色袁结果颜色非但没有加深袁反而变成了白
色或者白紫相间袁这种现象当时被称为共抑制渊 糟燥鄄
泽怎责责则藻泽泽蚤燥灶冤袁直到 员怨怨愿 年袁云蚤则藻 等咱员源暂通过一系列线
虫试验才解释了这种现象袁并称之为 砸晕粤 干扰遥
砸晕粤 干扰 渊 砸晕粤 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻袁 砸晕粤蚤冤是指在双链
砸晕粤渊凿燥怎遭造藻鄄泽贼则葬灶凿藻凿 砸晕粤袁 凿泽砸晕粤冤作用下袁抑制同
源 皂砸晕粤的表达袁即转录后基因沉默渊责燥泽贼 贼则葬灶泽糟则蚤责鄄
贼蚤燥灶葬造 早藻灶藻 泽蚤造藻灶糟蚤灶早袁 孕栽郧杂冤 咱员缘暂 遥 砸晕粤 干扰技术的
快速发展为抗病毒转基因植物的研究提供了新的策
略袁将病毒的某一基因片段构建到干扰载体中并导
入植株体内诱发 砸晕粤蚤袁沉默病毒同源基因从而获得
对该病毒的抗性遥
借助转基因手段培育抗病毒作物时袁利用病毒
自身的基因片段构建成干扰载体比抗病基因或是
悦孕基因所构建的表达载体对病毒更加具有针对性
和高效性遥 因此袁本研究旨在通过大豆遗传转化技
术袁获得含有 杂酝灾 悦孕 基因干扰片段的转基因大豆
新材料袁以期在后续的研究中袁从高世代转基因后代
中筛选得到稳定遗传的高抗 杂酝灾 的转基因大豆纯
合家系袁为大豆花叶病毒抗病育种工程提供具有广
谱尧持久抗性的亲本材料遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试 杂酝灾株系与转化受体院大豆花叶病毒 杂悦猿
株系由南京农业大学国家大豆改良中心提供遥 转化
受体品种 匀远 由华南农业大学年海教授惠赠遥
供试菌株和质粒院大肠杆菌 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤
阅匀缘琢袁北京 栽陨粤晕郧耘晕 公司曰中间载体 责阅韵晕砸圆圆员袁
美国 陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司曰根癌农杆菌 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂鄄
藻枣葬糟蚤藻灶泽 耘匀粤员园缘尧干扰表达载体 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤
由本实验室保存遥
试剂院郧粤栽耘宰粤再试剂盒购于美国 陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公
司曰阅晕粤 分子量标准尧阅晕粤 提取试剂盒尧砸晕粤 提取
试剂盒购自北京 栽陨粤晕郧耘晕 公司曰阅晕粤 凝胶回收试
剂盒尧质粒提取试剂盒购自美国 粤载再郧耘晕 公司曰孕则蚤鄄
皂藻杂糟则蚤责反转录试剂盒尧孕则藻皂蚤曾 栽葬择 聚合酶购自日本
栽葬运葬砸葬公司曰运韵阅 云载高保真酶购自日本 栽韵再韵月韵
公司曰限制性内切酶 载遭葬玉尧耘糟燥砸玉尧匀蚤灶凿 芋购自美
国 栽澡藻则皂燥公司曰月葬泽贼葬渊除草剂冤购自南京鼎国生物
公司曰匝怎蚤糟噪杂贼蚤曾 孕粤栽 辕 遭葬则 转基因检测试纸购于美国
耘灶增蚤则燥蕴燥早蚤曾公司曰大豆转化试验中所用的培养基基
源缘源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
础成分尧抗生素尧植物激素尧添加剂等均购自美国
孕澡赠贼燥 栽藻糟澡和 杂蚤早皂葬公司曰测序与引物合成委托北京
华大基因公司完成遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 悦孕基因保守序列的确定及克隆
分别取接种不同大豆花叶病毒株系的感病品种
南农 员员猿愿鄄圆 的发病嫩叶于液氮中研磨袁根据 栽陨粤晕鄄
郧耘晕试剂盒说明书提取大豆总 砸晕粤袁利用 孕则蚤皂藻鄄
杂糟则蚤责反转录试剂盒合成反转录第一链袁糟阅晕粤 产物
在 原圆园益保存遥 利用 悦造怎泽贼葬造载 员援 愿软件对 郧员尧郧猿尧郧源尧
郧远匀尧郧苑粤尧宰杂猿圆尧杂悦猿尧杂悦远尧远远园苑鄄员尧远圆园圆鄄圆尧匀匀缘 等
杂酝灾株系的 悦孕基因进行核苷酸序列比对袁确定保
守区域为 愿 苑猿圆 耀 愿 怨怨缘 灶贼遥 利用 孕则蚤皂藻则 缘援 园 软件设
计 杂悦猿 株系保守序列的正尧反向引物袁引物序列如
下渊小写英文字母为特异性重组序列 葬贼贼月冤院正向引
物 葬贼贼月员鄄悦孕蚤鄄云院缘忆鄄早早早早葬糟葬葬早贼贼贼早贼葬糟葬葬葬葬葬葬早糟葬早早糟贼粤悦悦粤
悦栽栽郧悦栽栽郧粤郧栽粤栽粤粤粤悦悦栽鄄猿忆曰反向引物 葬贼贼月圆鄄悦孕蚤鄄
砸院缘忆鄄早早早早葬糟糟葬糟贼贼贼早贼葬糟葬葬早葬葬葬早糟贼早早早贼粤粤郧栽栽郧郧栽栽栽栽郧悦
粤栽栽栽栽悦郧粤悦粤粤鄄猿忆袁用该对引物和 运韵阅 云载 高保真
酶袁以反转录后的 糟阅晕粤 为模板进行 孕悦砸 反应遥
孕悦砸产物进行 员豫琼脂糖凝胶电泳检测袁用 粤载再鄄
郧耘晕试剂盒对目标条带进行胶回收后得到干扰片
段 葬贼贼月鄄悦孕蚤袁送交北京华大基因公司测序遥
员援 圆援 圆 砸晕粤蚤载体的构建与鉴定
根据 郧粤栽耘宰粤再 试剂盒说明书进行 月孕 反应袁
使目的片段连接到入门载体 责阅韵晕砸圆圆员袁反应体系
为院葬贼贼月鄄悦孕蚤 源 滋蕴尧入门载体 员 滋蕴尧栽耘 月怎枣枣藻则 猿 滋蕴尧月孕
酶 圆 滋蕴袁圆缘 益水浴过夜后加入 员 滋蕴 蛋白酶 运袁猿苑 益
温浴 员园 皂蚤灶遥 取 员园 滋蕴 月孕 反应产物转化 阅匀缘琢袁
猿苑 益于含有 缘园 皂早 辕 蕴 卡那霉素 蕴月 平板上培养过
夜遥 次日袁对长出的单克隆扩繁并进行 孕悦砸 扩增袁
提取阳性克隆菌液的质粒 责阅韵晕砸圆圆员鄄悦孕蚤遥 然后进
行 蕴砸 反应袁反应体系为院入门克隆 源 滋蕴尧终端质粒
圆 滋蕴尧栽耘 月怎枣枣藻则 圆 滋蕴尧蕴砸酶 圆 滋蕴袁反应过程与 月孕 反
应相同遥 蕴砸 反应产物转化 阅匀缘琢 后袁在含有
员园园 皂早 辕 蕴壮观霉素的 蕴月 平板上培养过夜袁孕悦砸 鉴
定为阳性的单克隆菌液提取质粒 责月苑郧宰陨宰郧圆
渊域冤鄄悦孕蚤遥 每一步反应产物均送北京华大基因公司
测序遥
对重组质粒进行 载遭葬玉单酶切和 耘糟燥砸玉尧匀蚤灶凿
芋双酶切袁验证在表达质粒的 圆 个位点是否均插入
了 悦孕蚤干扰片段遥 设计 猿缘杂启动子和终止子序列区
间的引物 猿缘杂鄄孕院缘忆鄄郧粤悦郧悦粤悦粤粤栽悦悦悦粤悦栽粤栽悦悦鄄猿忆
和 猿缘杂鄄栽院缘忆鄄郧悦栽悦粤粤悦粤悦粤栽郧粤郧悦郧粤粤粤悦鄄猿忆袁分别
与 葬贼贼月圆鄄悦孕蚤鄄砸组合对重组质粒进行 孕悦砸 反应袁鉴
定 悦孕蚤片段的插入方向遥 将鉴定正确的重组质粒采
用冻融法转入到农杆菌 耘匀粤员园缘 感受态细胞中袁于
含有 圆缘 皂早 辕 蕴 利福平和 员园园 皂早 辕 蕴 壮观霉素的 再耘月
平板培养单克隆袁孕悦砸 鉴定为阳性的单克隆菌液加
入适量的甘油于 原愿园 益保存遥
员援 圆援 猿 农杆菌介导大豆子叶节遗传转化
转化方法参照 韵造澡燥枣贼等咱员远暂大豆转基因体系袁略
有改动遥 挑取发育饱满尧无病斑的成熟大豆种子平
铺于培养皿中袁置于密闭干燥器中进行氯气消毒
圆源 澡咱员苑暂 遥 消毒后种于萌发培养基渊早藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 皂藻凿蚤鄄
怎皂袁 郧酝冤中萌发 缘 耀 苑 凿袁留取子叶及 猿 耀 缘 皂皂 的下
胚轴并将 圆 片子叶分开袁切去顶芽及侧芽袁顺着下胚
轴的方向在子叶节处用刀片划伤 员园 次遥 将上述
原愿园 益保存的农杆菌在 再耘月平板上划线袁挑取含有
目的基因的单克隆于 愿园园 滋蕴 再耘月 液体培养基中活
化袁圆愿 益尧圆园园 则 辕 皂蚤灶振荡过夜后转入 圆园园 皂蕴 再耘月液
体培养基中进行扩大培养至 韵阅远园园 越 员援 园 耀 员援 圆袁培养
好的菌液室温下 源 园园园 则 辕 皂蚤灶 离心 员园 皂蚤灶 后弃去上
清袁用液体共培养基渊 造蚤择怎蚤凿 糟燥鄄糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁
蕴悦悦酝冤重悬菌落至 韵阅远园园 越 园援 愿遥
将划伤的外植体在上述悬浮液中侵染 猿园 皂蚤灶袁
于共培养基渊糟燥鄄糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁 悦悦酝冤中暗培养
缘 凿遥 将共培养后的外植体用液体芽诱导培养基
渊造蚤择怎蚤凿 泽澡燥燥贼 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁 蕴杂陨酝冤清洗干净并
在灭菌滤纸上吸干袁之后转入芽诱导培养基渊 泽澡燥燥贼
蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁 杂陨酝冤选择培养 源 周袁圆 周继代 员
次遥 切除子叶袁将诱导出的丛生芽转移至芽伸长培
养基渊 泽澡燥燥贼 藻造燥灶早葬贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁 杂耘酝冤中培养 远 耀 愿
周袁每 圆 周继代 员 次袁每次继代时均在外植体底部制
造新的伤口遥 切下伸长的芽渊 跃 源 糟皂冤插入生根培养
基渊则燥燥贼蚤灶早 皂藻凿蚤怎皂袁 砸酝冤生根袁根系健壮后袁打开瓶
盖炼苗袁猿 凿 后将苗根部培养基冲洗干净袁转入营养
土中驯化 员 耀 圆 周袁待幼苗成活后转入温室并进行鉴
定遥 大豆转化试验中所用培养基配方如表 员 所示遥
员援 圆援 源 栽园 代转基因植株的鉴定
除草剂法院将 月葬泽贼葬 原液稀释至 圆园园 皂早 辕 蕴 并加
入 园援 员豫的 栽憎藻藻灶鄄圆园袁用毛笔蘸取除草剂涂抹植株
的半片叶子袁另半片叶子作为对照并用记号笔标记袁
缘 耀 苑 凿后观察叶片的症状曰孕悦砸 法院用 栽陨粤晕郧耘晕 快
捷型 阅晕粤提取试剂盒提取植株叶片的基因组袁分别
用 葬贼贼月员鄄悦孕蚤鄄云 和 葬贼贼月圆鄄悦孕蚤鄄砸尧遭葬则鄄云院缘忆鄄悦郧粤郧粤悦粤鄄
粤郧悦粤悦郧郧栽悦粤粤悦栽栽鄄猿忆和 遭葬则鄄砸院缘忆鄄粤粤粤悦悦悦粤悦郧栽鄄
悦粤栽郧悦悦粤郧栽栽悦鄄猿 忆尧猿缘杂鄄孕和葬贼贼月圆 鄄悦孕蚤 鄄砸三对引物
缘缘源源 期 高摇 乐等院 大豆花叶病毒 悦孕基因 砸晕粤蚤载体的构建及大豆遗传转化
表 员 大豆转化所用的培养基配方
栽葬遭造藻 员 悦燥皂责燥灶藻灶贼泽 燥枣 贼澡藻 皂藻凿蚤怎皂 怎泽藻凿 枣燥则 泽燥赠遭藻葬灶 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
成份 悦燥皂责燥灶藻灶贼 郧酝 蕴悦悦酝 悦悦酝 蕴杂陨酝 杂陨酝 杂耘酝 砸酝
月缘 盐 月缘 泽葬造贼泽 员 伊 员 辕 员园 伊 员 辕 员园 伊 员 伊 员 伊 要 要
酝杂盐 酝杂 泽葬造贼泽 要 要 要 要 要 员 伊 员 辕 圆 伊
酝杂铁盐 酝杂 蚤则燥灶 泽贼燥糟噪 员 伊 员 辕 员园 伊 员 辕 员园 伊 员 伊 员 伊 员 伊 员 辕 圆 伊
月缘 有机物 月缘 增蚤贼葬皂蚤灶泽 员 伊 员 伊 员 伊 员 伊 员 伊 员 伊 员 辕 圆 伊
吗啉乙磺酸 酝耘杂 猿 皂酝 圆园 皂酝 圆园 皂酝 猿 皂酝 猿 皂酝 猿 皂酝 猿 皂酝
蔗糖 杂怎糟则燥泽藻 圆豫 猿豫 猿豫 猿豫 猿豫 猿豫 圆豫
琼脂 粤早葬则 园援 愿豫 要 园援 缘豫 要 园援 愿豫 园援 愿豫 园援 愿豫
责匀 缘援 愿 缘援 源 缘援 源 缘援 苑 缘援 苑 缘援 苑 缘援 远
远鄄苄基腺嘌呤 远鄄月粤 要 员援 远苑 皂早 辕 蕴 员援 远苑 皂早 辕 蕴 要 要 要 要
赤霉素 郧粤猿 要 园援 圆缘 皂早 辕 蕴 园援 圆缘 皂早 辕 蕴 要 要 园援 缘 皂早 辕 蕴 要
乙酰丁香酮 粤泽 要 园援 圆 皂酝 园援 圆 皂酝 要 要 要 要
半胱氨酸 蕴鄄糟赠泽 要 要 猿援 猿 皂酝 要 要 要 要
二硫苏糖醇 阅栽栽 要 要 员皂酝 要 要 要 要
草丁膦 郧造怎枣燥泽蚤灶葬贼藻 要 要 要 要 缘皂早 辕 蕴 缘 皂早 辕 蕴 要
特美汀 栽蚤皂藻灶贼蚤灶 要 要 要 圆缘园 皂早 辕 蕴 圆缘园 皂早 辕 蕴 圆缘园 皂早 辕 蕴 要
头孢霉素 悦藻枣燥贼葬曾蚤皂藻 要 要 要 员园园 皂早 辕 蕴 员园园 皂早 辕 蕴 员园园 皂早 辕 蕴 员园园 皂早 辕 蕴
天冬酰胺 粤泽责葬则葬早蚤灶藻 要 要 要 要 要 缘园 皂早 辕 蕴 要
谷氨酰胺 郧造怎贼葬皂蚤灶藻 要 要 要 要 要 缘园 皂早 辕 蕴 要
吲哚乙酸 陨粤粤 要 要 要 要 要 园援 员 皂早 辕 蕴 要
玉米素 在藻葬贼蚤灶鄄则蚤遭燥泽蚤凿藻 要 要 要 要 要 员皂早 辕 蕴 要
吲哚丁酸 陨月粤 要 要 要 要 要 要 员皂早 辕 蕴
摇 摇 郧酝尧蕴悦悦酝尧悦悦酝尧蕴杂陨酝尧杂陨酝尧杂耘酝尧砸酝分别表示萌发培养基尧液体共培养基尧共培养基尧液体芽诱导培养基尧芽诱导培养基尧芽伸长
培养基尧生根培养基遥 伊表示相应母液的稀释倍数曰要表示未添加该成分遥 郧酝袁 蕴悦悦酝袁 悦悦酝袁 蕴杂陨酝袁 杂陨酝袁 杂耘酝 葬灶凿 砸酝 蚤灶凿蚤糟葬贼藻 早藻则皂蚤鄄
灶葬贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁 造蚤择怎蚤凿 糟燥鄄糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁 糟燥鄄糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁 造蚤择怎蚤凿 泽澡燥燥贼 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁 泽澡燥燥贼 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂袁 泽澡燥燥贼 藻造燥灶早葬贼蚤燥灶
皂藻凿蚤怎皂 葬灶凿 则燥燥贼蚤灶早 皂藻凿蚤怎皂袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 伊 蚤灶凿蚤糟葬贼藻泽 凿蚤造怎贼蚤燥灶 贼蚤皂藻泽 燥枣 贼澡藻 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 皂燥贼澡藻则 造蚤择怎燥则曰 要 蚤灶凿蚤糟葬贼藻泽 贼澡藻 糟燥皂责燥灶藻灶贼 憎葬泽 灶燥贼
葬凿凿藻凿 蚤灶 贼澡藻 皂藻凿蚤怎皂援
检测 葬贼贼月鄄悦孕蚤尧遭葬则基因以及 猿缘杂 启动子是否导入大
豆基因组中袁采用 员豫琼脂糖凝胶电泳检测 孕悦砸 产
物的扩增情况曰孕粤栽 辕 遭葬则转基因检测试纸法院将适量
叶片组织置于一次性 员援 缘 皂蕴离心管中袁将叶片研碎
后加入 园援 缘 皂蕴抽提缓冲液袁使样品与缓冲液混合均
匀遥 将试纸条按箭头指示方向插入反应管袁员园 皂蚤灶
后读取结果遥 如果检测线显色袁判定为阳性曰如果仅
显示控制线渊糟燥灶贼则燥造 造蚤灶藻冤袁判定为阴性曰控制线未显
色的试纸为失效产品袁需更换试纸条遥
圆 结果与分析
圆援 员 砸晕粤蚤载体的鉴定与工程菌的获得
通过多个株系的核苷酸序列比对袁确定大豆花
叶病毒 悦孕基因保守区间为 愿 苑猿圆 耀愿 怨怨缘 灶贼渊圆远源 遭责冤遥
用引物 葬贼贼月员鄄悦孕蚤鄄云 和 葬贼贼月圆鄄悦孕蚤鄄砸 对 杂酝灾 的 糟阅晕粤
进行 孕悦砸 扩增袁电泳检测后割胶回收得到目标基
因袁并通过 月孕反应和 蕴砸反应袁将 悦孕基因保守区间
成功插入 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤渊图 员冤遥 目标区段的获
得尧入门克隆与终端载体的构建均经过 孕悦砸鉴定和
测序验证袁通过 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤鄄悦孕蚤 菌液 孕悦砸 鉴
定出的片段长度为 猿圆圆 遭责渊含 缘愿 遭责特异性重组序列
葬贼贼月冤袁与预期目标一致渊图 圆冤遥 测序所得序列在
晕悦月陨进行 月蕴粤杂栽 比对袁结果显示与 杂悦猿 序列匹配
度为 员园园豫 遥 重组质粒经过 载遭葬玉单酶切后出现
苑愿猿 遭责和 员园 愿员愿 遭责两条带曰经过 耘糟燥砸玉尧匀蚤灶凿 芋双
酶切后出现 圆 圆缘远 遭责 和 怨 猿源远 遭责 两条带袁与预期相
符袁证明重组质粒的 圆 个位点均插入了 悦孕蚤 干扰片
段渊图 员袁图 猿 冤遥 用引物 猿缘杂鄄孕 和 猿缘杂鄄栽 分别与
葬贼贼月圆鄄悦孕蚤鄄砸组合对重组质粒进行 孕悦砸扩增袁结果显
示 圆 对引物分别扩增出了长度为 源苑源 遭责 和 源远园 遭责
的条带渊图 源冤袁说明 悦孕蚤干扰片段在重组质粒中形成
了反向重复结构遥 综上说明 悦孕蚤 干扰片段在载体构
建过程中未发生变异袁以反向重复形式取代 圆个 糟糟凿月
位点与 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤组合袁砸晕粤蚤载体构建成功遥
远缘源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
图 员 重组质粒 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤 鄄悦孕蚤结构图
云蚤早援 员 悦燥灶泽贼则怎糟贼 皂葬责 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤鄄悦孕蚤
图 圆 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤 鄄悦孕蚤菌液 孕悦砸扩增图
云蚤早援 圆 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责月苑郧宰陨宰郧圆渊域冤鄄悦孕蚤
蚤灶 遭葬糟贼藻则蚤葬造 造蚤择怎蚤凿
摇 摇 酝院 酝葬则噪藻则 阅圆园园园曰 员 耀 源院 葬贼贼月鄄悦孕蚤干扰片段遥 酝院 酝燥造藻糟怎造葬则
皂葬则噪藻则 燥枣 阅圆园园园曰 员 原 源院 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 葬贼贼月鄄悦孕蚤援
图 猿 重组质粒酶切鉴定
云蚤早援 猿 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 增藻糟贼燥则 遭赠 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶
藻灶扎赠皂藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶
摇 摇 酝院 酝葬则噪藻则 阅员缘园园园曰 员院 载遭葬玉单酶切曰 圆院 耘糟燥砸玉尧匀蚤灶凿 芋
双酶切遥 酝院 酝燥造藻糟怎造葬则 皂葬则噪藻则 燥枣 阅员缘园园园曰 员院 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 藻灶扎赠皂藻
凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 遭赠 载遭葬玉曰 圆院 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 藻灶扎赠皂藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 遭赠 耘糟燥砸玉 葬灶凿
匀蚤灶凿 芋援
圆援 圆 栽园 代大豆转基因植株的获得
大豆种子于 郧酝中萌发 缘 耀 苑 凿 后袁此时的侧根
已经长出而子叶并未展开渊图 缘鄄葬冤袁该组织将用于
外植体的制备和农杆菌侵染遥 完成侵染后袁大豆子
叶近轴面向下放置于铺有灭菌滤纸的悦悦酝中暗
图 源 悦孕蚤干扰片段插入方向鉴定
云蚤早援 源 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 凿蚤则藻糟贼蚤燥灶 燥枣
悦孕蚤 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻 枣则葬早皂藻灶贼
摇 摇 酝院 酝葬则噪藻则 阅圆园园园曰 员院 葬贼贼月鄄悦孕蚤干扰片段曰 圆院 猿缘杂鄄栽和 葬贼贼月圆鄄
悦孕蚤鄄砸扩增片段曰 猿院 猿缘杂鄄孕和 葬贼贼月圆鄄悦孕蚤鄄砸扩增片段遥 酝院 酝葬则噪藻则
阅圆园园园曰 员院 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 葬贼贼月鄄悦孕蚤曰 圆院 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 枣则葬早鄄
皂藻灶贼 燥枣 猿缘杂鄄栽 葬灶凿 葬贼贼月圆鄄悦孕蚤鄄砸曰 猿院 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 猿缘杂鄄孕
葬灶凿 葬贼贼月圆鄄悦孕蚤鄄砸援
培养 缘 凿渊图 缘鄄遭冤遥 在 杂陨酝筛选培养 源周后渊含 缘皂早 辕
蕴草丁膦冤袁子叶节节点部位长出了大量的丛生芽
渊图 缘鄄糟冤袁未长出丛生芽的外植体将被舍弃遥 之后
将丛生芽切下袁以相同的筛选压力在 杂耘酝中进一步
筛选袁每 圆 周继代 员 次遥 由于草丁膦的存在袁大部分
丛生芽组织褐化死亡袁只有个别幼芽伸长到了 源 糟皂
以上渊图 缘鄄凿冤遥 将伸长的幼芽插入 砸酝中袁员 周后幼
苗便可长出根系渊图 缘鄄藻冤遥 最后转入土培袁驯化幼
苗成活后渊图 缘鄄枣冤进行检测遥
圆援 猿 栽园 代转基因大豆的检测
通过农杆菌介导大豆子叶节转化试验共获得
栽园 代幼苗 员园 株袁经过 圆园园 皂早 辕 蕴除草剂涂抹后袁有 远
株幼苗涂抹除草剂的半片叶子与未涂抹的另半片无
明显差异袁其余 源 株均因受到除草剂的伤害而呈现
出症状 渊图 远鄄粤冤遥 对抗除草剂的植株进行 葬贼贼月鄄
悦孕蚤尧遭葬则基因以及猿缘 杂启动子的孕悦砸电泳检测袁样
苑缘源源 期 高摇 乐等院 大豆花叶病毒 悦孕基因 砸晕粤蚤载体的构建及大豆遗传转化
图 缘 农杆菌介导大豆子叶节遗传转化流程
云蚤早援 缘 孕则燥糟藻泽泽 燥枣 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 泽燥赠遭藻葬灶 糟燥贼赠造藻凿燥灶葬则赠鄄灶燥凿藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
摇 摇 葬院 种子萌发曰 遭院 共培养曰 糟院 丛生芽诱导曰 凿院 芽伸长曰 藻院 生根曰 枣院 幼苗成活遥 葬院 杂藻藻凿 早藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶曰 遭院 糟燥鄄糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶曰 糟院 泽澡燥燥贼 蚤灶鄄
凿怎糟贼蚤燥灶曰 凿院 泽澡燥燥贼 藻造燥灶早葬贼蚤燥灶曰 藻院 则燥燥贼蚤灶早曰 枣院 泽藻藻凿造蚤灶早 泽怎则增蚤增葬造援
图 远 栽园 代转基因大豆鉴定
云蚤早援 远 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 栽园 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽燥赠遭藻葬灶 责造葬灶贼泽
摇 摇 粤院 栽园 代转基因大豆除草剂涂抹鉴定袁 员院 野生型 匀远曰 圆 耀 缘院 假阳性转基因植株曰 远 耀 员员院 阳性转基因植株曰 月院 栽园 代转基因植株
孕悦砸鉴定袁 酝院 酝葬则噪藻则 阅圆园园园曰 增院 质粒阳性对照曰 憎院 野生型 匀远阴性对照曰 凿院 凿凿匀圆韵空白对照曰 员 耀 远院 阳性转基因植株曰 悦院 栽园 代转基
因植株 孕粤栽 辕 遭葬则转基因检测试纸检测袁 憎院野生型匀远阴性对照曰 员 耀 远院阳性转基因植株遥 粤院 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 栽园 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽燥赠遭藻葬灶 责造葬灶贼泽
遭赠 澡藻则遭蚤糟蚤凿藻 责葬蚤灶贼蚤灶早袁 员院 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 匀远曰 圆 原 缘院 枣葬造泽藻 责燥泽蚤贼蚤增藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽曰 远 原 员员院 责燥泽蚤贼蚤增藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽曰 月院 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 栽园 贼则葬灶泽鄄
早藻灶蚤糟 泽燥赠遭藻葬灶 责造葬灶贼泽 遭赠 孕悦砸袁 酝院 酝葬则噪藻则 阅圆园园园曰 增院 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 燥枣 责造葬泽皂蚤凿曰 憎院 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 燥枣 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 匀远曰 凿院 遭造葬灶噪 糟燥灶贼则燥造 燥枣
凿凿匀圆韵曰 员 原 远院 责燥泽蚤贼蚤增藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽曰 悦院 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 栽园 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽燥赠遭藻葬灶 责造葬灶贼泽 遭赠 匝怎蚤糟噪杂贼蚤曾 运蚤贼 枣燥则 蕴蚤遭藻则贼赠 蕴蚤灶噪 渊遭葬则冤袁 憎院 灶藻早葬贼蚤增藻
糟燥灶贼则燥造 燥枣 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 匀远曰 员 原 远院 责燥泽蚤贼蚤增藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽援
本均在正确位置出现了条带渊图 远鄄月冤袁说明农杆菌
栽鄄阅晕粤区域已整合到植物基因组中遥 孕粤栽 辕 遭葬则 转基
因检测试纸进一步检测后均出现 圆 条带袁表现为阳
性渊图 远鄄悦冤袁说明 遭葬则基因已经表达为蛋白质袁暗示
悦孕蚤干扰片段在植物体内发生转录并且形成了含有
内含子的发夹结构 渊 蚤灶贼则燥灶 泽责造蚤糟蚤灶早 澡责砸晕粤袁 蚤澡责砸鄄
晕粤冤遥
猿 讨论
砸晕粤干扰机制是一种普遍存在于生物界中的
愿缘源 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
古老现象袁自该技术发现以来已被广泛应用到植物
抗病毒研究领域中咱员愿暂 遥 砸晕粤蚤已在抗黄瓜花叶病毒
渊悦怎糟怎皂遭藻则 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁 悦酝灾冤咱员怨暂 尧马铃薯 载 病毒
渊孕燥贼葬贼燥 增蚤则怎泽 载袁 孕灾载冤咱圆园暂 尧水稻黄斑驳病毒 渊砸蚤糟藻
赠藻造造燥憎 皂燥贼贼造藻 增蚤则怎泽袁 砸再酝灾冤咱圆员暂等多种作物抗病毒研
究中取得了成功遥 在澡葬灶早等咱圆圆暂将串联的 猿 个反向重
复序列渊蚤灶增藻则贼藻凿 则藻责藻葬贼袁 陨砸冤导入到大豆中袁获得的
转基因株系能够抵御多种病毒的同时侵染袁展现出
了高强度的系统抗性遥 宰葬灶早等咱员园暂和 云怎则怎贼葬灶蚤等咱员员暂
虽然将 悦孕基因的过量表达载体导入大豆中袁但在
后代中均发现了 砸晕粤 介导的抗性渊砸晕粤鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿
则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻冤袁即 砸晕粤 干扰遥 本研究选取大豆花叶病
毒不同株系间最为保守的外壳蛋白基因为研究对
象袁通过 悦孕基因核苷酸序列的比对袁进一步克隆出
高度保守区域袁并采用 郧粤栽耘宰粤再 重组技术快速构
建了干扰载体袁省去了传统的酶切连接等步骤以及
繁琐的筛选工作袁减少了转基因试验开展前的准备
工作遥 相对于表达载体而言袁本试验构建了对病毒
针对性更强的 砸晕粤蚤载体袁为通过基于 砸晕粤蚤原理的
大豆转基因技术培育出对 杂酝灾 具广谱抗性新种质
提供了一种新的方法袁这对大豆花叶病毒抗病育种
工作具有重要意义遥
自从第 员 株转基因大豆问世以来袁科学家们已
经通过多种手段提高其转化效率院在 悦悦酝中添加硫
醇类化物以及金属螯合剂咱圆猿 原 圆源暂可以有效减少大豆
组培过程中的褐化和坏死现象袁并显著提高大豆子
叶节的侵染效率曰韵造澡燥枣贼 等咱员远暂利用 澡责贼 做为筛选标
记基因袁通过在培养基中添加潮霉素可将平均转化
率提高到 员远援 源豫 曰孕葬扎 等咱圆缘暂通过对新型外植体的转
化要野半粒法冶袁可将转化率最高提升至 愿援 苑豫 曰卢涛
等咱圆远暂以 遭葬则 为筛选标记基因袁通过在 悦悦酝 中添加
琢鄄硫辛酸袁可将平均转化率提高至 猿豫 左右曰杂燥灶早
等咱圆苑暂在中国大豆品种中筛选出平均转化率为 源援 缘怨豫
的易感基因型天隆 员 号遥 本试验以易感基因型 匀远
为转化受体袁采用草丁膦作为筛选剂袁通过农杆菌介
导大豆子叶节转化方法成功获得了 远 株阳性转基因
大豆袁但转化率仍然偏低袁现正在从农杆菌菌株尧受
体基因型尧外植体尧筛选剂尧暗培养条件等多方面优
化转基因体系袁以期进一步提高转化效率遥
由于野芽逃离冶现象普遍存在于转基因试验当
中咱员远暂 袁使得假阳性植株经历了培养基中草丁膦的驯
化而对除草剂反应不敏感遥 所以袁本试验中的 源 株
假阳性转基因植株对除草剂存在一定的抗性袁并没
有出现非转基因植株典型的药害症状遥 因此袁应当
进一步优化除草剂涂抹的次数尧浓度尧叶片的选择以
及涂抹后光照强度的控制等因素袁从而在不伤害阳
性植株的同时去除假阳性植株遥 农杆菌污染问题则
对研究人员进行 孕悦砸鉴定时提出了更高的要求袁注
意操作的同时还要设置阳性尧阴性和空白对照遥 虽
然 孕悦砸可以鉴定出植株中是否存在目的基因袁但是
无法识别植株是否为野嵌合体冶袁因此可以结合除草
剂涂抹多片叶子方法来解决袁如果某一 孕悦砸阳性植
株上只有部分叶片呈现出除草剂抗性袁则可以认定
其为野嵌合体冶袁从而减少后代不能稳定遗传的现
象遥 孕粤栽 辕 遭葬则 转基因检测试纸是从蛋白水平检测
遭葬则基因袁因此污染来源少袁比除草剂涂抹尧孕悦砸 鉴
定更为可靠袁但其费用较高袁可在除草剂涂抹以及
孕悦砸鉴定都为阳性的植株中随机抽取部分样品进
行测定遥
本试验所获得的阳性转基因大豆将在后续研究
中进一步鉴定其后代的 杂酝灾抗性袁并通过 栽员尧栽圆 代
杂燥怎贼澡藻则灶 印迹杂交深入了解其整合遗传方式袁寻找
低拷贝插入的转基因后代袁筛选出能够稳定遗传
悦孕蚤干扰片段的纯合体家系袁最终通过 杂酝灾 抗病鉴
定筛选出对 杂酝灾具有抗性的转基因大豆新种质袁从
而为 杂酝灾抗病育种工程提供良好的亲本材料遥
参 考 文 献 渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 李尉民袁 濮祖芹援 南京地区夏大豆田蚜虫的消长与大豆花
叶病毒渊 杂酝灾冤病的流行援 植物保护学报袁 员怨怨员袁 员愿 渊圆冤院
员圆猿 原 员圆远
咱圆暂 濮祖芹袁 曹琦袁 房德纯袁 等援 大豆花叶病毒的株系鉴定援 植
物保护学报袁 员怨愿圆袁 怨渊员冤院 员缘 原 员怨
咱猿暂 李延华袁 吕文清援 大豆花叶病毒的显症率与大豆品种及病
毒株系的关系研究援 植物保护学报袁 员怨怨员袁 员愿渊源冤院 猿猿源 原
猿猿源
咱源暂 运燥燥 允 酝袁 悦澡燥蚤 月 运袁 粤澡灶 匀 允袁 藻贼 葬造援 云蚤则泽贼 则藻责燥则贼 燥枣 葬灶 砸泽增 则藻鄄
泽蚤泽贼葬灶糟藻鄄遭则藻葬噪蚤灶早 蚤泽燥造葬贼藻 燥枣 杂燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽 蚤灶 运燥则藻葬援 孕造葬灶贼
孕葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园园缘袁 缘源渊源冤院 缘苑猿
咱缘暂 杂葬则怎贼葬 酝袁 运蚤噪怎糟澡蚤 粤袁 韵噪葬遭藻 粤袁 藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬鄄
贼蚤燥灶 燥枣 粤圆 葬灶凿 阅 泽贼则葬蚤灶泽 燥枣 杂燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁 憎澡蚤糟澡 糟葬怎泽藻凿 葬
则藻糟藻灶贼 增蚤则怎泽 燥怎贼遭则藻葬噪 蚤灶 泽燥赠遭藻葬灶 糟怎造贼蚤增葬则 杂葬糟澡蚤赠怎贼葬噪葬 蚤灶 悦澡鄄
怎早燥噪怎 葬灶凿 杂澡蚤噪燥噪怎 则藻早蚤燥灶泽 燥枣 允葬责葬灶援 允燥怎则灶葬造 燥枣 郧藻灶藻则葬造 孕造葬灶贼
孕葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园园缘袁 苑员渊远冤院 源猿员 原 源猿缘
咱远暂 陈永萱袁 薛宝娣袁 胡蕴珠袁 等援 大豆花叶病毒渊杂酝灾冤两个新
株系的鉴定援 植物保护学报袁 员怨愿远袁 员猿渊源冤院 圆圆员 原 圆圆远
咱苑暂 粤遭藻造 孕 孕袁 晕藻造泽燥灶 砸 杂袁 阅藻 月袁 藻贼 葬造援 阅藻造葬赠 燥枣 凿蚤泽藻葬泽藻 凿藻增藻造燥责鄄
皂藻灶贼 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 贼澡葬贼 藻曾责则藻泽泽 贼澡藻 贼燥遭葬糟糟燥 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽
糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 早藻灶藻援 杂糟蚤藻灶糟藻袁 员怨愿远袁 圆猿圆渊源苑缘员冤院 苑猿愿 原 苑源猿
怨缘源源 期 高摇 乐等院 大豆花叶病毒 悦孕基因 砸晕粤蚤载体的构建及大豆遗传转化
咱愿暂 匀蚤灶糟澡藻藻 酝 粤 宰袁 悦燥灶灶燥则鄄宰葬则凿 阅 灾袁 晕藻憎藻造造 悦 粤袁 藻贼 葬造援 孕则燥鄄
凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽燥赠遭藻葬灶 责造葬灶贼泽 怎泽蚤灶早 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄皂藻凿蚤葬鄄
贼藻凿 阅晕粤 贼则葬灶泽枣藻则援 月蚤燥 辕 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员怨愿愿袁 远院 怨员缘 原 怨圆圆
咱怨暂 酝糟悦葬遭藻 阅 耘袁 杂憎葬蚤灶 宰 云袁 酝葬则贼蚤灶藻造造 月 允袁 藻贼 葬造援 杂贼葬遭造藻 贼则葬灶泽枣燥则鄄
皂葬贼蚤燥灶 燥枣 泽燥赠遭藻葬灶 渊郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾冤 遭赠 责葬则贼蚤糟造藻 葬糟糟藻造藻则葬贼蚤燥灶援 月蚤燥 辕
栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员怨愿愿袁 远院 怨圆猿 原 怨圆远
咱员园暂 宰葬灶早 载袁 耘早早藻灶遭藻则早藻则 粤 蕴袁 晕怎贼贼藻则 云 宰袁 藻贼 葬造援 孕葬贼澡燥早藻灶鄄凿藻鄄
则蚤增藻凿 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 泽燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽 蚤灶 泽燥赠遭藻葬灶援
酝燥造藻糟怎造葬则 月则藻藻凿蚤灶早袁 圆园园员袁 愿渊圆冤院 员员怨 原 员圆苑
咱员员暂 云怎则怎贼葬灶蚤 晕袁 匀蚤凿葬噪葬 杂袁 运燥泽葬噪葬 再袁 藻贼 葬造援 悦燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 早藻灶藻鄄
皂藻凿蚤葬贼藻凿 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 泽燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽燥赠鄄
遭藻葬灶援 月则藻藻凿蚤灶早 杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园园远袁 缘远渊圆冤院 员员怨 原 员圆源
咱员圆暂 云怎则怎贼葬灶蚤 晕袁 再葬皂葬早蚤泽澡蚤 晕袁 匀蚤凿葬噪葬 杂袁 藻贼 葬造援 杂燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟
增蚤则怎泽 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽燥赠遭藻葬灶 糟葬怎泽藻凿 遭赠 责燥泽贼鄄贼则葬灶泽糟则蚤责鄄
贼蚤燥灶葬造 早藻灶藻 泽蚤造藻灶糟蚤灶早援 月则藻藻凿蚤灶早 杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园园苑袁 缘苑院 员圆猿 原 员圆愿
咱员猿暂 晕葬责燥造蚤 悦袁 蕴藻皂蚤藻怎曾 悦袁 允燥则早藻灶泽藻灶 砸援 陨灶贼则燥凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 葬 糟澡蚤皂藻则蚤糟
糟澡葬造糟燥灶藻 泽赠灶贼澡葬泽藻 早藻灶藻 蚤灶贼燥 责藻贼怎灶蚤葬 则藻泽怎造贼泽 蚤灶 则藻增藻则泽蚤遭造藻 糟燥鄄
泽怎责责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 澡燥皂燥造燥早燥怎泽 早藻灶藻泽 蚤灶 贼则葬灶泽援 孕造葬灶贼 悦藻造造袁 员怨怨园袁
圆院 圆苑怨 原 圆愿怨
咱员源暂 云蚤则藻 粤袁 载怎 杂袁 酝燥灶贼早燥皂藻则赠 酝 运援 藻贼 葬员援 孕燥贼藻灶贼 葬灶凿 泽责藻糟蚤枣蚤糟
早藻灶藻贼蚤糟 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻 遭赠 凿燥怎遭造藻鄄泽贼则葬灶凿藻凿 砸晕粤 蚤灶 悦葬藻灶燥则澡葬遭凿蚤贼蚤泽
藻造藻早葬灶泽援 晕葬贼怎则藻袁 员怨怨愿袁 猿怨员院 愿园远 原 愿员员
咱员缘暂 杂皂蚤贼澡 晕 粤袁 杂蚤灶早澡 杂 孕袁 宰葬灶早 酝 月袁 藻贼 葬员援 栽燥贼葬造 泽蚤造藻灶糟蚤灶早 遭赠
蚤灶贼则燥灶鄄泽责造蚤糟藻凿 澡葬蚤则责蚤灶 砸晕粤泽援 晕葬贼怎则藻袁 圆园园园袁 源园苑院 猿员怨 原 猿圆园
咱员远暂 韵造澡燥枣贼 孕 酝袁 云造葬早藻造 蕴 耘袁 阅燥灶燥增葬灶 悦 酝袁 藻贼 葬员援 耘枣枣蚤糟蚤藻灶贼 泽燥赠鄄
遭藻葬灶 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 怎泽蚤灶早 澡赠早则燥皂赠糟蚤灶 月 泽藻造藻糟贼蚤燥灶 蚤灶 贼澡藻 糟燥贼赠造藻鄄
凿燥灶葬则赠鄄灶燥凿藻 皂藻贼澡燥凿援 孕造葬灶贼葬袁 圆园园猿袁 圆员远院 苑圆猿 原 苑猿缘
咱员苑暂 阅蚤 砸袁 孕怎则糟藻造造 灾袁 悦燥造造蚤灶泽 郧 月袁 藻贼 葬员援 孕则燥凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟
泽燥赠遭藻葬灶 造蚤灶藻泽 藻曾责则藻泽泽蚤灶早 贼澡藻 遭藻葬灶 责燥凿 皂燥贼贼造藻 增蚤则怎泽 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶
责则藻糟怎则泽燥则 早藻灶藻援 孕造葬灶贼 悦藻造造 砸藻责燥则贼泽袁 员怨怨远袁 员缘院 苑源远 原 苑缘园
咱员愿暂 王志坤袁 李文滨袁 刘珊珊援 砸晕粤干扰技术及在植物抗病研
究中的应用援 大豆科学袁 圆园园愿袁 圆苑渊猿冤院 缘圆员 原 缘圆远
咱员怨暂 运葬造葬灶贼蚤凿蚤泽 运袁 孕泽葬则葬凿葬噪蚤泽 杂袁 栽葬遭造藻则 酝袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 燥糟糟怎则则藻灶糟藻
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