全 文 ：细菌磁颗粒实时荧光 砸栽鄄孕悦砸检测菜豆荚斑驳病毒
月葬糟贼藻则蚤葬造 皂葬早灶藻贼蚤糟 责葬则贼蚤糟造藻泽 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 砸栽鄄孕悦砸 枣燥则
凿藻贼藻糟贼蚤灶早 月藻葬灶 责燥凿 皂燥贼贼造藻 增蚤则怎泽
邓丛良员 摇 赵晓丽员 摇 双龙海员 摇 孙摇 宁员袁 圆 摇 陈继峰猿
渊员援北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心袁 北京 员园员猿员圆曰 圆援东南大学生物科学与医学工程学院袁
南京 圆员园园怨远曰 猿援郑州大学生物工程系袁 郑州 源缘园园园员冤
阅藻灶早 悦燥灶早造蚤葬灶早员 摇 在澡葬燥 载蚤葬燥造蚤员 摇 杂澡怎葬灶早 蕴燥灶早澡葬蚤员 摇 杂怎灶 晕蚤灶早员袁 圆 摇 悦澡藻灶 允蚤枣藻灶早猿
渊员援 孕造葬灶贼 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 月藻蚤躁蚤灶早 陨灶泽责藻糟贼蚤燥灶 葬灶凿 匝怎葬则葬灶贼蚤灶藻 栽藻泽贼蚤灶早 悦藻灶贼藻则袁 月藻蚤躁蚤灶早 员园员猿员圆袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 杂糟澡燥燥造 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造
杂糟蚤藻灶糟藻泽 葬灶凿 酝藻凿蚤糟葬造 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 杂燥怎贼澡藻葬泽贼 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 晕葬灶躁蚤灶早 圆员园园怨远袁 允蚤葬灶早泽怎 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰
猿援 月蚤燥藻灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 阅藻责葬则贼皂藻灶贼袁 在澡藻灶早扎澡燥怎 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 在澡藻灶早扎澡燥怎 源缘园园园员袁 匀藻灶葬灶 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
摇 摇 菜豆荚斑驳病毒渊月藻葬灶 责燥凿 皂燥贼贼造藻 增蚤则怎泽袁月孕酝灾冤
属豇豆花叶病毒科 悦燥皂燥增蚤则蚤凿葬藻豇豆花叶病毒属 悦燥鄄
皂燥增蚤则怎泽成员袁主要侵染大豆尧菜豆等豆科植物袁可通
过种子远距离传播袁造成大豆产量和品质下降咱员暂 遥
目前袁该病毒主要分布于美国尧巴西等国家袁在我国
属禁止进境的检疫性有害生物遥 因此袁建立一种简
便尧快捷尧灵敏的植物病毒检测方法袁对于提高口岸
检疫工作效率具有十分重要的意义遥
近年来袁生物大分子的固相提取技术取得了很
大的进步袁尤其是磁性纳米材料的应用袁极大地简化
了操作和缩短了提取时间咱圆暂 遥 此外袁实时荧光 砸栽鄄
孕悦砸技术已广泛地应用于病毒的检测与鉴定咱猿猿暂 遥
本实验室已利用细菌磁颗粒渊遭葬糟贼藻则蚤葬造 皂葬早灶藻贼蚤糟 责葬则鄄
贼蚤糟造藻泽袁月酝孕泽冤从南瓜叶片组织提取出病毒核酸袁并进
行了实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 检测咱源暂 遥 为了建立一种快
速尧经济尧灵敏的植物病毒检测方法袁本研究以携带
月孕酝灾的大豆种子为试验材料袁利用 月酝孕泽 方法提
取 月孕酝灾 砸晕粤 进行实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 检测袁并与传
统的 栽则蚤扎燥造方法进行比较遥
员 材料与方法
员援 员 材料院 感染 月孕酝灾 的大豆种子袁以及感染南芥
菜花叶病毒渊粤则葬遭蚤泽 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁粤则酝灾冤尧黄瓜花叶病
毒渊 悦怎糟怎皂遭藻则 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁 悦酝灾冤尧大豆花叶病毒
渊杂燥赠遭藻葬灶 皂燥泽葬蚤糟 增蚤则怎泽袁杂酝灾冤尧烟草环斑病毒渊栽燥遭葬糟糟燥
则蚤灶早泽责燥贼 增蚤则怎泽袁栽砸杂灾冤和番茄环斑病毒渊栽燥皂葬贼燥 则蚤灶早鄄
泽责燥贼 增蚤则怎泽袁栽燥砸杂灾冤的阳性材料均由北京出入境检验
检疫局植物实验室保存遥 月酝孕泽 由郑州大学陈继峰
博士提供遥 酝鄄酝蕴灾 反转录酶和实时荧光 砸栽鄄孕悦砸
试剂盒购自 栽葬运葬砸葬公司曰栽则蚤扎燥造 试剂购自 陨灶增蚤贼则燥早藻灶
公司遥
员援 圆 病毒 砸晕粤提取院栽则蚤扎燥造院取携带 月孕酝灾的大豆种
子和健康的大豆种子若干袁放入研磨仪中袁磨成均匀
粉末状袁称取 员园园 皂早袁按照 栽则蚤扎燥造试剂使用说明提取
总 砸晕粤袁溶于 缘园园 滋蕴无 砸晕粤酶的去离子水中袁测定
其纯度遥 月酝孕泽院称取 员园园 皂早粉末状样品袁加入 员 皂蕴
抽提缓冲液袁放置 缘 皂蚤灶袁愿 园园园 早 离心 缘 皂蚤灶遥 取 员园园
滋蕴离心后的上清液于 员园园 滋早 月酝孕泽之中袁室温孵育
缘 皂蚤灶袁置于磁力架上吸附 月酝孕泽袁去除上清液袁加入
缘园 滋蕴无 砸晕葬泽藻的去离子水袁怨缘益加热 员皂蚤灶袁置于磁
力架上吸附 月酝孕泽袁并转移上清液至新的离心管中进
行反转录反应遥
员援 猿 引物和探针的设计与合成院根据 郧藻灶月葬灶噪 中已
发表的 月孕酝灾 外壳蛋白基因保守序列设计引物及
探针袁探针 缘忆端标记荧光基团渊远鄄糟葬则遭燥曾赠 枣造怎燥则藻泽糟藻灶贼袁
云粤酝冤袁猿忆端标记猝灭基团渊 遭造葬糟噪 澡燥造藻 择怎藻灶糟澡藻则 员袁
月匀匝员冤袁引物和探针均由 栽葬运葬砸葬 公司合成袁引物与
探针序列院月孕酝灾鄄悦孕鄄云院缘忆鄄悦栽悦栽悦悦栽栽粤悦粤栽栽粤粤粤栽鄄
郧栽粤悦粤郧栽郧栽悦栽栽鄄猿忆曰 月孕酝灾鄄悦孕鄄砸院 缘忆鄄粤粤悦栽栽粤栽栽悦鄄
悦栽郧粤粤栽栽栽悦栽悦悦粤粤粤悦栽鄄猿忆曰 月孕酝灾 探针院 缘忆鄄云粤酝鄄
栽栽悦粤栽粤郧悦粤栽栽栽郧郧粤粤粤栽栽栽郧郧悦栽郧粤栽郧粤鄄月匀匝员鄄猿忆遥
员援 源 糟阅晕粤 合成和实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 检测院在 园援 圆
皂蕴离心管中加入 砸晕粤 圆 滋蕴尧员园 滋皂燥造 辕 蕴下游引物 员
基金项目院 公益性行业渊质检冤科研专项渊圆园员员员园园猿缘冤袁国家质检总局科技计划项目渊圆园员员陨运员缘苑冤
作者简介院 邓丛良袁男袁员怨远怨年生袁高级农艺师袁研究方向为植物病毒学袁 耘鄄皂葬蚤造院 凿藻灶早糟造岳 遭躁糟蚤择援 早燥增援 糟灶
收稿日期院 圆园员圆 原 园愿 原 员远
第 源园 卷摇 第 员 期
圆园员猿 年摇 圆 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源园摇 晕燥援 员
云藻遭援 摇 圆园员猿
滋蕴尧无 砸晕葬泽藻的去离子水 猿 滋蕴袁苑园 益加热 员园 皂蚤灶袁立
即置冰上 圆 皂蚤灶袁然后依次加入 缘 伊 酝鄄酝蕴灾 缓冲液 圆
滋蕴尧员园 滋皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕泽 各 园援 缘 滋蕴尧圆园园 哉 辕 滋蕴 酝鄄酝蕴灾
园援 圆 滋蕴尧源园 哉 辕 滋蕴 砸晕葬泽藻 抑制剂 园援 圆 滋蕴袁补水至 员园
滋蕴袁源圆 益温育 远园 皂蚤灶袁苑园 益加热 员缘 皂蚤灶袁在冰上放置
圆 皂蚤灶袁反应产物直接用于实时荧光 孕悦砸遥 应用
月酝孕泽提取病毒核酸袁按照上述条件合成 糟阅晕粤遥 利
用引物 月孕酝灾鄄悦孕鄄云尧月孕酝灾鄄悦孕鄄砸 和 月孕酝灾 探针对
月孕酝灾进行实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 检测袁猿 次重复袁以健
康大豆种子和携带 悦酝灾尧栽砸杂灾尧栽燥砸杂灾尧粤则酝灾 和
栽月砸灾的阳性材料为对照遥 反应体系院糟阅晕粤 圆 滋蕴尧
孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬择 渊圆 伊 冤 员园 滋蕴尧员园 滋皂燥造 辕 蕴 月孕酝灾鄄悦孕鄄云
和 员园 滋皂燥造 辕 蕴 月孕酝灾鄄悦孕鄄砸 各 园援 源 滋蕴尧 员园 滋皂燥造 辕 蕴
月孕酝灾探针 园援 圆 滋蕴袁补足去离子水至 圆园 滋蕴遥 扩增程
序院怨缘 益 员园 泽曰怨缘 益 缘 泽袁远园 益 圆园 泽袁源园 个循环遥
员援 缘 灵敏度比较院栽则蚤扎燥造 试剂提取携带 月孕酝灾 大豆
种子的总 砸晕粤袁用健康大豆种子的总 砸晕粤 梯度稀
释袁每个梯度 猿 次重复曰取 月孕酝灾大豆种子离心上清
液 圆园 滋蕴袁用健康大豆种子的离心上清液梯度稀释袁
利用 月酝孕泽 方法提取 月孕酝灾 砸晕粤袁每个梯度重复 猿
次遥 各取 圆 滋蕴进行 糟阅晕粤合成袁取 圆 滋蕴 糟阅晕粤 进行
实时荧光 孕悦砸检测遥
圆 结果与分析
圆援 员 月酝孕泽实时荧光 砸栽鄄孕悦砸检测
携带 月孕酝灾 大豆种子的荧光强度渊驻砸灶冤随循
环数的增加而增加袁而健康大豆种子渊阴性对照冤和
携带 粤则酝灾尧悦酝灾尧杂酝灾尧栽砸杂灾和 栽燥砸杂灾阳性材料的
驻砸灶均未增加遥 表明所设计的引物与探针仅对
月孕酝灾具有特异性反应遥
圆援 圆 灵敏度比较
栽则蚤扎燥造试剂提取 砸晕粤 方法检测结果显示袁当阳
性材料总 砸晕粤稀释倍数达到 员园缘 时袁驻砸灶 未超过阈
值渊图 员鄄葬冤曰 而 月酝孕泽 提取 砸晕粤 方法检测结果显
示袁当阳性材料离心上清液稀释倍数达 员园源 时袁驻砸灶
未超过阈值渊图 员鄄遭冤遥 因此袁栽则蚤扎燥造 实时荧光 砸栽鄄
孕悦砸稀释限点为 员园源袁而 月酝孕泽实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 稀
释限点为 员园猿袁栽则蚤扎燥造 方法的灵敏度比 月酝孕泽 方法高
员园 倍遥
图 员 栽则蚤扎燥造 渊葬冤 和 月酝孕泽 渊遭冤 实时荧光 砸栽鄄孕悦砸检测灵敏度比较
云蚤早援 员 杂藻灶泽蚤遭蚤造蚤贼赠 燥枣 凿藻贼藻糟贼蚤灶早 月孕酝灾 遭赠 贼澡藻 栽则蚤扎燥造 渊葬冤 葬灶凿 月酝孕泽 渊遭冤 遭葬泽藻凿 燥灶 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 砸栽鄄孕悦砸
摇 摇 注 院粤员 耀 猿至云员 耀 猿院员园员 耀 员园远倍梯度稀释曰郧员 耀 猿院阴性对照遥晕燥贼藻院粤员 原 猿 贼燥云员 原 猿院阅蚤造怎贼蚤燥灶贼蚤皂藻泽枣则燥皂员园员 原 员园远 袁则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠曰
郧员 原猿院 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造援
猿 讨论
本研究结果表明袁月酝孕泽实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 检测
灵敏度比 栽则蚤扎燥造 试剂检测灵敏度低 员园 倍袁与孙宁
等咱源暂检测西葫芦叶片中南瓜花叶病毒的结果不一
致遥 这可能是由于大豆种子中蛋白质和油脂的含量
较叶片高袁影响了细菌磁颗粒对 月孕酝灾 粒子的吸
附遥 但是袁与 栽则蚤扎燥造 试剂提取方法相比袁月酝孕泽 提取
病毒 砸晕粤方法在操作和时间上更具优势遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 郧蚤藻泽造藻则 蕴 允袁 郧澡葬遭则蚤葬造 杂 粤袁 匀怎灶贼 栽 耘袁 藻贼 葬造援 月藻葬灶 责燥凿 皂燥贼贼造藻 增蚤鄄
则怎泽院 粤 贼澡则藻葬贼 贼燥 哉援 杂援 泽燥赠遭藻葬灶 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶援 孕造葬灶贼 阅蚤泽藻葬泽藻袁
圆园园圆袁 愿远 渊员圆冤院 员圆愿园 原 员圆愿怨
咱圆暂 邓丛良袁江明袁汪万春袁等 援 应用酝晕孕鄄砸栽鄄孕悦砸方法检测
黄瓜绿斑驳花叶病毒 援 植物病理学报 袁圆园园愿 袁猿愿 渊 源 冤 院
源猿远 原 源源园
咱猿暂 酝葬糟噪葬赠 陨 酝袁 粤则凿藻灶 运 耘袁 晕蚤贼泽糟澡藻 粤援 砸藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 蚤灶 增蚤则燥造燥鄄
早赠援 晕怎糟造藻蚤糟 粤糟蚤凿泽 砸藻泽藻葬则糟澡袁 圆园园圆袁 猿园渊远冤院 员圆怨圆 原 员猿园缘
咱源暂 孙宁袁邓丛良袁么磊袁等 援 应用细菌磁颗粒实时荧光砸栽鄄
孕悦砸检测南瓜花叶病毒 援 植物病理学报袁圆园员园 袁源园 渊 远 冤 院
远猿圆 原 远猿缘
渊责任编辑院吴竟一冤
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