全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１５， ４２（３）： ３４７ － ３５２ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１５􀆰 ０３􀆰 ０１０
基金项目： 国家质检总局科技计划项目（２００９ＩＫ２５４，２０１１ＩＫ２８６，２０１２ＩＫ２７８），国家“十二五”科技支撑计划（２０１２ＢＡＫ１１Ｂ０２）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｆｅｎｇｃｉｑ＠ １６３． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１４ － ０９ － ０９
玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温
扩增（ＬＡＭＰ）检测方法
封立平１∗　 倪　 新２ 　 吴兴海１ 　 伦才智２ 　 吴翠萍３ 　 栾　 晶１
（１．山东出入境检验检疫局， 青岛 ２６６００２； ２．临沂出入境检验检疫局综合技术服务中心，
山东 临沂 ２７６０３４； ３．江苏出入境检验检疫局， 南京 ２１０００１）
摘要： 为了提高口岸和基层实验室检疫和监测玉米细菌性枯萎病菌的准确性和工作效率，利用环
介导恒温扩增技术（ＬＡＭＰ），根据内切葡聚糖酶（ＥＧａｓｅ）基因前导序列，设计 ２ 个内引物和 ２ 个外
引物，对玉米细菌性枯萎病菌进行快速检测。 结果表明，使用玉米细菌性枯萎病菌的近缘种或引致
相似症状的病原菌菊欧文氏菌玉米致病变种 Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐｖ． ｚｅａｅ、玉米内州萎蔫病菌
Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｉｓ、燕麦假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ、杓兰欧文氏菌
Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ检测其特异性，仅玉米细菌性枯萎病菌有扩增。 ＬＡＭＰ 检测灵敏度达到 ２ ｐｇ
ＤＮＡ，为普通 ＰＣＲ的 １００ 倍；与其它检测方法相比，ＬＡＭＰ 方法检测时间短，效率高，不仅降低了设
备投入，易于操作，而且具有较高的灵敏度和特异性，适合玉米细菌性枯萎病菌的现场检疫和大规
模检测。
关键词： 玉米细菌性枯萎病菌； 内切葡聚糖酶； 环介导恒温扩增； 检测
Ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＬＡＭＰ） ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ
Ｆｅｎｇ Ｌｉｐｉｎｇ１∗ 　 Ｎｉ Ｘｉｎ２ 　 Ｗｕ Ｘｉｎｇｈａｉ１ 　 Ｌｕｎ Ｃａｉｚｈｉ２ 　 Ｗｕ Ｃｕｉｐｉｎｇ３ 　 Ｌｕａｎ Ｊｉｎｇ１
（１． Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｅｎｔｒｙ⁃Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６００２， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｌｉｎｙｉ Ｅｎｔｒｙ⁃Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｌｉｎｙｉ ２７６０３４， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
３． Ｊｉａｎｇｓｕ Ｅｎｔｒｙ⁃Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００１， Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ
ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｒｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ⁃ｌｅｖｅｌ ｔｅｓｔ ｌａｂｓ， ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ， ｔｈｅ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＬＡＭＰ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ （ＥＧａｓｅ） ｇｅｎｅ ｌｅａｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｔｗｏ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｗｏ ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ
ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｓｉｍｐｌｅ ＬＡＭＰ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐｖ． ｚｅａｅ， Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ
ｓｕｂｓｐ． ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｉｓ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ， ａｎｄ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ． Ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｐ．
ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ２ ｐｇ ＤＮＡ， １００ ｔｉｍｅｓ
ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｏｒｄｉｎａｒｙ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ， ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｒａｐｉｄ， ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ
ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｅａｓｙ ｔｏ ｃｏｎｄｕｃｔ， ａｎｄ ｈａｓ ｈｉｇｈ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｎ⁃ｓｉｔｅ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ａｎｄ ｌａｒｇｅ⁃ｓｃａｌｅ
ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ； ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ； ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
（ＬＡＭＰ）； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
　 　 玉米是我国农业的主要栽培作物，也是关系到
国家粮食安全的重要品种，在国民经济中占有重要
地位。 我国从 ２０１０ 年开始出现了玉米净进口态势，
并且进口数量逐年增加，进口国家主要是美国。 入
境美国玉米携带玉米细菌性枯萎病菌 Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗ⁃
ａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ （Ｓｍｉｔｈ） Ｍｅｒｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ． 传入传
播的风险极大，有效防控该病害的入侵是保护我国
农业生产的一项重要举措。 玉米细菌性枯萎病菌异
名为 Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ （Ｓｍｉｔｈ） Ｄｙｅ，是《中华人民共
和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》中的检
疫性有害生物，也是进境相关植物源性产品、饲料和
繁殖材料的必检项目。 该病菌主要通过病种子进行
远距离传播，其引起的玉米细菌性枯萎病是玉米上
的毁灭性病害，受害植株萎蔫、矮缩或干枯，是维管
束型病害。 该病最早发生于美国，后扩散到欧洲、大
洋洲等地（齐玲玲等，２０１０），我国目前尚无该病害
分布或发生的相关报道。 目前检疫该菌的方法主要
以传统的分离培养、生理生化鉴定和各类 ＰＣＲ分子
鉴定技术为主。 传统的检测方法主要是病原菌的分
离培养鉴定，如用黑色素选择性培养基分离、检验和
鉴定该细菌（郭翼奋等，１９８２），但该方法检测灵敏
度低、耗时长，已不能满足口岸快速检测的需求。
ＰＣＲ技术目前主要利用该病原的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 和 １６Ｓ⁃
２３Ｓ ｒＤＮＡ ＩＴＳ区域的序列差异设计引物，有时无法
实现完全特异性检测，存在假阴性和假阳性反应，在
实际工作中往往造成漏检和疫情逃逸等问题（吴琼
等，２００４）。 因此，急需建立玉米细菌性枯萎病菌的
快速、准确、高效、低成本的检测方法。
环介导恒温扩增（ ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍ⁃
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是 Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． （２０００）开发的一
种先进、灵敏的体外恒温核酸扩增技术，可在恒温条
件下和短时间内将目标 ＤＮＡ从几个拷贝扩增到 １０９
拷贝。 其特点是针对靶基因（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）的 ６ 个区
域，设计 ４ 条特异引物，利用一种链置换 ＤＮＡ 聚合
酶（ＢｓｔＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）在恒温中反应 １ ｈ，即可完
成核酸扩增反应。 与其它方法相比，ＬＡＭＰ 具有高
特异性、高灵敏度和高效扩增等优点，该方法成本
低，操作简单，不受样品中基因组 ＤＮＡ的影响，所需
样品少，且反应产物可以通过肉眼观测 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
Ⅰ染液的颜色变化来判断，因此该技术在快速检测
病原和诊断疾病方面已表现出极大的实用价值。 目
前许多学者利用 ＬＡＭＰ 技术对难以培养、生化反应
不明显及传统表型方法不能鉴定的细菌进行了快速
准确的鉴定（王丽等，２００６），如应用 ＬＡＭＰ 法已经
成功检测到单增李斯特菌 Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、空
肠弯曲菌 Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、阪崎肠杆菌 Ｅｎｔｅｒ⁃
ｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ等（林超等，２００９；高宏伟等，２０１０；
徐晓可等，２０１３）。 但该技术在植物病原细菌方面
的应用还较少。
本研究建立了一种利用环介导等温核酸扩增技
术（ＬＡＭＰ）检测玉米细菌性枯萎病菌 Ｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ的方法，对 ＬＡＭＰ反应体系进行了特
异性和灵敏性检测，同时与普通 ＰＣＲ检测技术进行
了灵敏度的比较，以期为口岸和基层实验室检疫和
监测玉米细菌性枯萎病菌提供新的技术手段，为制
定该病的防治策略、防止该病原菌的入侵风险提供
理论依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株：玉米细菌性枯萎病菌 Ｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ（保藏编号 ＡＴＣＣ２９２２７）、玉米内州萎
蔫病菌 Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｉｓ
（保藏编号 ＡＴＣＣ２７８２２）、菊欧文氏菌玉米致病变种
Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐｖ． ｚｅａｅ、燕麦假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏ⁃
ｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ，由中国检验检疫科学研究院提供；杓
兰欧文氏菌 Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ，由本试验室从进境韩
国大花惠兰中分离。
培养基：营养琼脂培养基（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍ，
ＮＡ）：牛肉浸膏 ３ ｇ、蛋白胨 １０ ｇ、氯化钠 ５ ｇ、琼脂粉
１５ ｇ，加蒸馏水溶解，调 ｐＨ 至 ７􀆰 ０，定容至 １ ０００
ｍＬ。 肉汤液体培养基（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ｍｅｄｉｕｍ，ＮＢ）：
牛肉浸膏 ０􀆰 ５ ｇ、蛋白胨 １􀆰 ０ ｇ、氯化钠 ０􀆰 ５ ｇ，加蒸馏
水溶解，调 ｐＨ至 ７􀆰 ２ ～ ７􀆰 ５，定容至 １ ０００ ｍＬ。
试剂：Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）公司；ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ，宝生物工
程（大连）有限公司；ｄＮＴＰｓ，生工生物工程（上海）股
份有限公司；琼脂糖，Ｐｒｏｍｅｇａ（北京）生物技术有限
公司；细菌 ＤＮＡ提取试剂盒，天根生化科技（北京）
有限公司；营养肉汤，北京陆桥技术有限责任公司；
８４３ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ，嘉美生物技术有限公司。
仪器：ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｐｌｕｓ 核酸蛋白测定仪，Ｅｐ⁃
ｐｅｎｄｏｒｆ中国有限公司；ＤＹＣＰ⁃３２Ｃ 型水平电泳仪，北
京六一仪器厂；Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ 凝胶成像系统，法国
ＶＩＬＢＥＲ ＬＯＵＲＭＡＴ公司；ＷＦＨ⁃２０１Ｂ 紫外透射反射
仪，上海沪粤明科学仪器有限公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 细菌培养及 ＤＮＡ提取
将目标菌株玉米细菌性枯萎病菌 Ｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ 与 ４ 种对照菌株包括玉米内州萎蔫
病菌 Ｃ． ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｉｓ、菊欧文氏
菌玉米致病变种 Ｅ． ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐｖ． ｚｅａｅ、燕麦假单
胞菌 Ｐ． ａｖｅｎａｅ、杓兰欧文氏菌 Ｅ． ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ 分别接
种于 ＮＡ 平板上，２８ ℃培养直至长出单菌落，挑取
单菌落上的菌体培养物于灭菌离心管中，加 ｄｄＨ２Ｏ
至 １􀆰 ５ ｍＬ，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １ ｍｉｎ，除去上清液，收
集菌体沉淀，根据细菌总 ＤＮＡ提取试剂盒说明书进
行各病原菌总 ＤＮＡ提取。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＬＡＭＰ反应引物设计及合成
根据玉米细菌性枯萎病菌特异性基因内切葡聚
糖酶 （ ＥＧａｓｅ） 基因前导序列 （ ＧｅｎＢａｎｋ 登录号：
ＺＰ０９８３０４０５􀆰 １）为靶标，利用在线设计软件 Ｐｒｉｍｅｒ
Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ３ 设计 ＬＡＭＰ 反应引物，通过考虑碱基组
成、ＧＣ 含量、二级结构的形成和 Ｔｍ 值等因素对备
选引物进行筛选以得到特异性的引物序列。 所得引
物序列由南京金斯瑞生物有限公司合成。 正向内侧
引 物 ＦＩＰ： ５′⁃ＴＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＴＣＡＴＣ⁃ＴＣＡＧＣＣ
ＡＴＡＣＣＧＡＡＧＧＧＣ⁃３′，反向内侧引物 ＢＩＰ： ５′⁃ＡＣ⁃
ＣＡＣＧＴＴＧＣＧＡＡＡＴＣＣＧＣＡＡ⁃ＧＣＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧ
ＣＴ⁃３′，正向外侧引物 Ｆ３： ５′⁃ＡＣＧＧＧＣＧＣＡＴＴＡＴＴ⁃
ＧＡＴＡＣＧ⁃３′，反向外侧引物 Ｂ３：５′⁃ＣＡＣＡＴＣＧＣＣＡＴ⁃
ＣＡＧＡＡＧＣＡＴ⁃３′。
１􀆰 ２􀆰 ３ ＬＡＭＰ方法的优化
根据反应体系条件对 ＬＡＭＰ 反应体系进行优
化，即依次对反应温度、镁离子浓度、内外引物浓度
进行单因素变化试验。 其中反应温度变化范围为
５９ ～ ６５ ℃，镁离子终浓度变化范围为 ０ ～ １２ ｍＭ，内
外引物比例范围为 １ ∶ １ ～ １ ∶ １２。
１􀆰 ２􀆰 ４ ＬＡＭＰ扩增结果的判断方法
将 １ 个玉米细菌性枯萎病菌阳性菌株和 １ 个不
添加玉米细菌性枯萎病菌模板 ＤＮＡ 的 ＬＡＭＰ 反应
溶液按设计的 ＬＡＭＰ 反应程序进行反应，反应前在
ＰＣＲ管内盖上加入 ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ荧光染料使其附
在管盖内侧，反应结束后瞬时离心将 ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ
加入 ＬＡＭＰ反应液中进行显色观察，肉眼可见阳性
菌株反应管颜色为绿色，未添加阳性菌株反应管颜
色为橙色；用 １􀆰 ５％琼脂糖凝胶电泳分析，阳性菌株
扩增产物出现梯形条带。 ２ 种方法的扩增产物判断
结果一致，即可将 ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ染色、凝胶电泳 ２
种方法作为 ＬＡＭＰ扩增结果判定的可信方法。
１􀆰 ２􀆰 ５ ＬＡＭＰ特异性检测
根据玉米细菌性枯萎病菌内切葡聚糖酶
（ＥＧａｓｅ）基因前导序列建立的 ＬＡＭＰ 方法分别扩增
玉米细菌性枯萎病菌和其对照菌株。 分别以玉米细
菌性枯萎病菌及其对照菌基因组 ＤＮＡ为模板，采用
已优化的反应体系进行 ＬＡＭＰ 方法特异性检测，检
测结果通过荧光染料法和 １􀆰 ５％琼脂糖凝胶电泳进
行分析。
１􀆰 ２􀆰 ６ ＬＡＭＰ灵敏度检测
按照 １􀆰 ２􀆰 １ 进行玉米细菌性枯萎病菌的培养
及 ＤＮＡ提取，将得到的 ＤＮＡ利用核酸蛋白测定仪
测定浓度，将 ＤＮＡ提取液浓度稀释为 １００ μｇ ／ μＬ，
然后对其进行 １０ 倍系列稀释，分别为： １００、１０ － １、
１０ － ２、１０ － ３、１０ － ４、１０ － ５、１０ － ６，对应的菌液 ＤＮＡ 浓
度分别为 １００、１０、１、０􀆰 １、０􀆰 ０１ μｇ ／ μＬ 及 １、０􀆰 １
ｐｇ ／ μＬ。 用 ＤＮＡ稀释液做模板进行 ＬＡＭＰ扩增，电
泳检测其灵敏度并计算 ＤＮＡ 含量。 ＤＮＡ 含量 ＝
ＤＮＡ提取液浓度 ×稀释度 ×模板 ＤＮＡ 体积，其中
ＤＮＡ提取液浓度为 １００ μｇ ／ μＬ，模板 ＤＮＡ 体积为
２ μＬ。
１􀆰 ２􀆰 ７ ＬＡＭＰ与 ＰＣＲ灵敏度的比较
使用 １􀆰 ２􀆰 ６ 中梯度稀释的模板同时进行 ＰＣＲ
检测，比较 ＰＣＲ 方法与 ＬＡＭＰ 方法灵敏度的差异。
ＰＣＲ 引物序列：ＥＧａｓｅＵＰ５′⁃ＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧ
ＴＴ⁃３′， ＥＧａｓｅＮＰ５′⁃ＧＡＴＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＡＡＡＣＡＡ⁃３′。
引物由华大基因公司合成。 ５０ μＬ反应体系各成分
为：５ Ｕ ／ μＬ Ｅｘ Ｔａｑ １ μＬ、２􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰ ２ μＬ、
１０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ上游引物 １ μＬ、１０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ下游引物 １ μＬ、模板 ＤＮＡ ２ μＬ，补 ｄｄＨ２Ｏ
至 ５０ μＬ。 ＰＣＲ反应条件为 ９４ ℃预变性 ５ ｍｉｎ；９４
℃变性 ４５ ｓ，６４ ℃退火 ４５ ｓ，７２ ℃延伸 １ ｍｉｎ，３０ 循
环；７２ ℃延伸 ７ ｍｉｎ，然后 ４ ℃保存。
２ 结果与分析
２􀆰 １ ＬＡＭＰ方法的优化结果
优化后的 ＬＡＭＰ反应体系为 ５０ μＬ，其中包含：
① 模板预处理反应液 １６ μＬ：１０ μｍｏｌ ／ Ｌ 内引物 ＦＩＰ
和 ＢＩＰ各 ２ μＬ、５ μｍｏｌ ／ Ｌ外引物 Ｆ３ 和 Ｂ３ 各 ２ μＬ、
９４３３ 期 封立平等： 玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法
１０ μｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰ ８ μＬ；② 溶液 Ｉ ３２ μＬ：基础反应液
２５ μＬ、８ Ｕ ／ μＬ Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ４ μＬ，补 ｄｄＨ２Ｏ
３ μＬ。 其中基础反应液成分为：１０ × Ｔｈｅｒｍｏｌ Ｂｕｆｆｅｒ、
２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ （ ｐＨ ８􀆰 ８，２５ ℃）、１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＫＣｌ、 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ （ ＮＨ４ ） ２ＳＯ４、 ８ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＳＯ４、
０􀆰 ０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ⁃１００；③ 模板 ２ μＬ。 其中各组分均
为工作液浓度。
提取的待检样品核酸纯度比值 ＤＮＡ ＯＤ２６０ ／
ＯＤ２８０在 １􀆰 ６ ～ ２􀆰 ０ 范围内，核酸浓度在 ４０ ～ １００ ｎｇ ／
μＬ范围内。 将装有 １６ μＬ 模板预处理反应液的反
应管加入 ２ μＬ待检模板 ＤＮＡ，９４ ℃水浴 ５ ｍｉｎ，５９
℃水浴 ４５ ｓ，共 ６ 个循环。 然后将上述模板预处理
混合溶液加入 ３２ μＬ 溶液Ⅰ中，６３ ℃ ６０ ｍｉｎ，反应
结束后 ８０ ℃１０ ｍｉｎ，降温至 ４ ℃。
２􀆰 ２ ＬＡＭＰ特异性检测
ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ染色结果表明，玉米细菌性枯萎
病菌菌株颜色为绿色，而对照菌株和空白对照均为
橙色（图 １⁃ａ）；凝胶电泳结果表明，玉米细菌性枯萎
病菌菌株有扩增，呈阳性反应，而对照菌株均无扩增
（图 １⁃ｂ）。
图 １ 玉米细菌性枯萎病菌 ＬＡＭＰ反应体系
特异性试验结果
Ｆｉｇ． １ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ
ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ
ａ： ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ染色检测； ｂ： 凝胶电泳检测； Ｍ：
ＤＬ ２０００ ｍａｒｋｅｒ； １： 玉米细菌性枯萎病菌； ２： 菊欧文氏
菌玉米致病变种； ３： 玉米内州萎蔫病菌； ４： 燕麦假单
胞菌； ５： 杓兰欧文氏菌； Ｂ： 空白对照。 ａ： ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
Ｉ ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ； ｂ： ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ； Ｍ： ＤＬ
２０００ ｍａｒｋｅｒ； １： Ｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ； ２： Ｅ． ｃｈｒｙ⁃
ｓａｎｔｈｅｍｉ ｐｖ． ｚｅａｅ； ３： Ｃ． ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｎｅｂｒａｓｋｅｎ⁃
ｓｉｓ； ４： Ｐ． ａｖｅｎａｅ； ５： Ｅ． ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｉ； Ｂ： ｂｌａｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌ．
　
２􀆰 ３ ＬＡＭＰ灵敏度检测
用建立的 ＬＡＭＰ检测方法扩增不同稀释度的模
板，凝胶电泳结果表明，随着模板浓度的降低，条带
逐渐变淡，至稀释度 １０ － ５时没有扩增产物（图 ２），即
本 ＬＡＭＰ方法的检测限为 ２ ｐｇ ＤＮＡ。
图 ２ 玉米细菌性枯萎病菌 ＬＡＭＰ反应体系
灵敏度试验结果
Ｆｉｇ． ２ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ
ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ
Ｍ： ＤＬ ２０００ ｍａｒｋｅｒ； １ ～ ７： 玉米细菌性枯萎病菌稀
释倍数分别为 １００、１０ － １、１０ － ２、１０ － ３、１０ － ４、１０ － ５、１０ － ６。
Ｍ： ＤＬ ２０００ ｍａｒｋｅｒ； １ － ７： ＤＮＡ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ ａｒｅ １００， １０ － １，
１０ － ２， １０ － ３， １０ － ４， １０ － ５， ａｎｄ １０ － ６， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． 　
２􀆰 ４ ＬＡＭＰ与 ＰＣＲ最低检测限比较
用普通 ＰＣＲ方法扩增不同稀释度的模板，结果
表明，灵敏度最低检测限为稀释度 １０ － ３（图 ３）。 通
过比较可以看出，ＬＡＭＰ 方法的灵敏度是普通 ＰＣＲ
的 １００ 倍。
图 ３ 玉米细菌性枯萎病菌的 ＰＣＲ灵敏度检测结果
Ｆｉｇ． ３ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ
Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２０００； １ ～ ５： 玉米细菌性枯萎病
菌稀释度分别为 １００、１０ － １、１０ － ２、１０ － ３、１０ － ４； Ｂ： 空白对
照。 Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２０００； １ － ５： ＤＮＡ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ ａｒｅ
１００， １０ － １， １０ － ２， １０ － ３， ａｎｄ １０ － ４， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； Ｂ： ｎｅｇａ⁃
ｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ． 　
３ 讨论
目前各类 ＰＣＲ 技术由于效率较高已成为病原
０５３ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
菌检测的重要手段。 如普通 ＰＣＲ检测方法（吴兴海
等，２００７；王赢等，２００９）、巢式 ＰＣＲ 检测方法（王茂
华等，２００５）、实时荧光 ＰＣＲ 检测方法（漆艳香等，
２００４）、多重 ＰＣＲ 检测方法等 （ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ，
２００１；Ｃｏｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ． ，２００２）。 但是这些 ＰＣＲ技术存在
会产生个别假阴性和假阳性反应的缺陷。 进一步排
除这些交叉反应需要使用限制性酶切片段反转脉冲
电场电泳，对技术和设备的要求都比较高。 而本研
究建立的玉米细菌性枯萎病菌 ＬＡＭＰ检测方法可以
弥补 ＰＣＲ检测技术的不足。 由于 ＬＡＭＰ技术采用 ４
条引物（其中 ２ 条超过 ４０ ｂｐ）来识别目的片段 ６ 个
特异性的区域，使得 ＬＡＭＰ检测方法比 ＰＣＲ方法具
有更好的特异性，而且灵敏性更高。 在本试验中，
ＬＡＭＰ检测限为 ２ ｐｇ ＤＮＡ，灵敏度可达到普通 ＰＣＲ
的 １００ 倍。 此外，ＬＡＭＰ 检测方法可实现恒温下反
应，只需要一台水浴锅或者培养箱即可，容易在田间
地头及货场进行检测。 而且，ＬＡＭＰ 检测结果可以
通过肉眼观察 ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ染料颜色变化来判断，
比 ＰＣＲ更早得到反应结果。
国内外鲜见玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温
扩增方法报道。 目前国内只有袁钧等（２０１３）报道
利用玉米细菌性枯萎病菌基因组 ＤＮＡ 特有的保守
区域设计 ＬＡＭＰ引物，通过优化其反应条件，建立了
玉米细菌性枯萎病菌的检测体系。 本研究与上述研
究相比，引物设计选取的靶标序列不同。 在袁钧等
（２０１３）研究中选取玉米细菌性枯萎病菌基因组中
的保守序列 ｐｓａｓ为靶标序列，而本研究是根据玉米
细菌性枯萎病菌产生的内切葡聚糖酶（ＥＧａｓｅ）基因
前导序列设计 ＬＡＭＰ引物。 内切葡聚糖酶 ＥＧａｓｅ基
因是近年来新发现的与玉米细菌性枯萎病菌的致病
力及传播密切相关的基因，可引起寄主细胞壁和木
质部基质中多糖成分的完全降解，其前导序列调控
ＥＧａｓｅ的启动和表达（Ｍｏｊｔａｂａ ｅｔ ａｌ． ，２０１２），是玉米
细菌性枯萎病菌的特异性基因，以该基因为靶标设
计 ＬＡＭＰ 引物保证了检测的高度特异性。 其次，
ＬＡＭＰ扩增结果的判断方法不同。 在袁钧等（２０１３）
的研究中 ＬＡＭＰ 检测结果的判断采用凝胶电泳方
法，而没有采用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料显色进行结果的
快速判定，也没有采用不开盖技术，仍停留在 ＬＡＭＰ
技术 ２０００ 年发展阶段的水平。 由于 ＬＡＭＰ 高温反
应后产生的气溶胶极易导致污染，因此假阳性率高。
而且用凝胶电泳方法判断 ＬＡＭＰ 检测结果耗时费
力，不能满足快速检测的要求。 而本研究采用了不
开盖检测，在 ＬＡＭＰ 反应前于 ＰＣＲ 管内盖上加入
ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ荧光染料使其附在管盖内侧，待反应
结束后瞬时离心将 ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ加入 ＬＡＭＰ 反应
液中进行显色观察，具有可视性、即时性的检测优
势；并且避免了开盖造成气溶胶污染。 因此检测的
准确性和灵敏度更有保证。
本研究建立的玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒
温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法是一种先进的即时检测技
术方法，将为入境植物产品中玉米细菌性枯萎病菌
的检疫提供新的技术保障。 这不仅能使工作效率得
到突破性的提高，同时可使检测成本大幅降低。 由
于条件所限，试验主要针对口岸检测工作进行，仅选
取了目前在玉米上能造成严重危害且与玉米细菌性
枯萎病菌近缘或症状相似的对照菌，引物的特异性
应该通过收集更多的菌株来进行进一步的检测。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
Ｃｏｐｌｉｎ ＤＬ， Ｍａｊｅｒｃｚａｋ ＤＲ， Ｚｈａｎｇ ＹＸ， Ｋｉｍ ＷＳ， Ｊｏｃｋ Ｓ， Ｇｅｉｄｅｒ
Ｋ． ２００２． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｂｙ
ＰＣＲ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＦＧＥ． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ， ８６
（３）： ３０４ － ３１１
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ＲＤ， Ａｈｍａｄ Ｍ， Ｍａｊｅｒｃｚａｋ ＤＲ， Ａｒｒｏｙｏ⁃Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＡＳ，
Ｍａｎｕｌｉｓ Ｓ． ２００１． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｈｒｐ ｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｒ⁃
ｐＡ， ｈｒｐＣ， ｈｒｐＮ ａｎｄ ｗｔｓＥ ｏｐｅｒｏｎｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ， １４（１０）： １２１３ － １２２２
Ｇａｏ ＨＷ， Ｘｕ Ｂ， Ｚｈｕ ＬＨ， Ｘｉａｏ ＸＺ， Ｚｈｅｎｇ ＸＬ， Ｌｉａｎｇ ＣＺ． ２０１０．
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｅａｔ ｂｙ ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ ＬＡＭＰ）． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ＆
Ｑｕａｌｉｔｙ， ２７（１）： １２ － １７ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［高宏伟， 徐彪， 朱来
华， 肖西志， 郑小龙， 梁成珠． ２０１０． 应用 ＬＡＭＰ检测方法
检测肉制品中的单增李斯特菌． 食品安全质量检测技术，
２７（１）： １２ － １７］
Ｇｕｏ ＹＦ， Ｌｉａｎｇ ＺＱ， Ｙｕ ＤＦ． １９８１． Ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏ⁃
ｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｍａｉｚｅ． Ｓｃｉ⁃
ｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， ２２（４）： ３３９ － ３４４ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［郭翼奋， 梁
再群， 俞大绂． １９８１． 从进口玉米分离玉米细菌性枯萎病菌
的选择性培养基． 科学通报， ２２（４）： ３３９ － ３４４］
Ｌｉｎ Ｃ， Ｌｉａｎｇ ＣＺ， Ｘｕ Ｂ， Ｓｕｎ Ｍ， Ｌｉｕ ＣＸ， Ｇａｏ ＨＷ． ２００９． Ｅｓｔａｂ⁃
ｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ ＬＡＭＰ）
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ３６
（６）： ９２３ － ９２８ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［林超， 梁成珠， 徐彪， 孙敏，
刘彩霞， 高宏伟． ２００９． 空肠弯曲菌 ＬＡＭＰ快速检测方法的
建立． 微生物学通报， ３６（６）： ９２３ － ９２８］
Ｍｏｈａｍｍａｄｉ Ｍ， Ｂｕｒｂａｎｋ Ｌ， Ｒｏｐｅｒ ＭＣ． ２０１２． Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ
ｆｕｌｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ｓｗｅｅｔｃｏｒｎ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃ⁃
ｔｉｏｎｓ， ２５（４）： ４６３ － ４７０
Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ， Ｏｋａｙａｍａ Ｈ， Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈ， Ｙｏｎｅｋａｗａ Ｔ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ，
１５３３ 期 封立平等： 玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法
Ａｍｉｎｏ Ｎ， Ｈａｓｅ Ｔ． ２０００． Ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａ⁃
ｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２８（１２）： ｅ６３
Ｑｉ ＬＬ， Ｊｉｎ Ｙ， Ｚｏｕ ＭＱ， Ｌｉａｎｇ ＣＺ， Ｔｉａｎ ＳＭ， Ｃｈｅｎ Ｙ， Ｌｉ ＷＨ．
２０１０． Ａ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ⁃ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｆｏｒ
ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ， ２０（１）： １ － ４ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［齐玲
玲， 金涌， 邹明强， 梁赤周， 田世民， 陈艳， 李卫华． ２０１０．
胶体金免疫层析试纸条快速检测玉米细菌性枯萎病菌． 检
验检疫学刊， ２０（１）： １ － ４］
Ｑｉ ＹＸ， Ｚｈｕ ＳＦ， Ｚｈａｏ ＷＪ， Ｘｉａｏ ＱＭ， Ｌｉａｏ ＸＬ． ２００４． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｕｓｉｎｇ
ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ３１ （１）： ５１ － ５６
（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［漆艳香， 朱水芳， 赵文军， 肖启明， 廖晓兰．
２００４． 玉米细菌性枯萎病菌 ＴａｑＭａｎ 探针实时荧光 ＰＣＲ 检
测方法的建立． 植物保护学报， ３１（１）： ５１ － ５６］
Ｗａｎｇ Ｌ， Ｓｈｉ Ｌ， Ｌｉ Ｌ． ２００６． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏ⁃
ｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ， ２６（５）： ４６２ － ４６５ （ ｉｎ Ｃｈｉ⁃
ｎｅｓｅ） ［王丽， 石磊， 李琳． ２００６． ＤＮＡ 环介导的恒温扩增
法在快速鉴定病原微生物中的应用． 生命的化学， ２６（５）：
４６２ － ４６５］
Ｗａｎｇ ＭＨ， Ｈｕ ＢＳ， Ｌｕ Ｌ， Ｌｉｕ ＦＱ， Ｘｕ ＺＧ， Ｃｈｅｎ ＪＤ． ２００５． Ｄｅｔｅｃ⁃
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｂｙ ｎｅｓｔｅｄ⁃ＰＣＲ． Ｊｏｕｒ⁃
ｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２８ （２）： ３７ － ４０ （ ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［王茂华， 胡白石， 卢玲， 刘凤权， 许志刚， 陈建
东． ２００５． 利用巢式 ＰＣＲ 检测玉米细菌性枯萎病菌． 南京
农业大学学报， ２８（２）： ３７ － ４０］
Ｗａｎｇ Ｙ， Ｚｈｏｕ ＧＬ， Ｙｉｎ ＬＰ， Ｙｕａｎ Ｐ， Ｗａｎｇ ＷＹ， Ｙｉ ＪＰ． ２００９．
　 　 　 　
　 　 ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ． Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏ⁃
ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ３９（４）： ３６８ － ３７６ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［王赢，
周国梁， 印丽萍， 袁平， 王文岳， 易建平． ２００９． 玉米细菌
性枯萎病菌 ＰＣＲ检测． 植物病理学报， ３９（４）： ３６８ － ３７６］
Ｗｕ Ｑ， Ｃｈｅｎ ＺＮ， Ｆａｎ ＨＺ， Ｊｉｎ ＸＺ． ２００４． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ ｏｆ ｍａｉｚｅ
ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ． Ｃｈｉｎａ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２４（１２）： ２２ － ３１ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［吴琼， 陈枝
楠， 范怀忠， 金显忠． ２００４． 玉米细菌性枯萎病及其病原菌
的检测技术． 中国生物工程杂志， ２４（１２）： ２２ － ３１］
Ｗｕ ＸＨ， Ｙａｎｇ ＷＫ， Ｄｅｎｇ ＭＪ， Ｃｈｅｎ ＣＦ， Ｓｈａｏ ＸＬ， Ｌｉａｎｇ ＣＺ， Ｆｅｎｇ
ＬＰ． ２００７． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ４２（５）： ８８ － ９１ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［吴兴海， 杨伟克，
邓明俊， 陈长法， 邵秀玲， 梁成珠， 封立平． ２００７． 利用
ＰＣＲ技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）． 甘肃农业大学学报， ４２（５）： ８８ － ９１］
Ｘｕ ＸＫ， Ｗｕ ＱＰ， Ｚｈａｎｇ ＳＨ， Ｚｈａｎｇ ＪＭ， Ｇｕｏ ＷＰ， Ｗｕ ＸＨ． ２０１３．
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＬＡＭＰ， ＰＣＲ ａｎｄ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｎ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ． Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ４０
（９）： １７１５ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［徐晓可， 吴清平， 张淑红， 张菊
梅， 郭伟鹏，吴秀华． ２０１３． 阪崎肠杆菌 ＬＡＭＰ、ＰＣＲ与传统
检测方法的比较． 现代预防医学， ４０（９）： １７１５］
Ｙｕａｎ Ｊ， Ｇａｏ ＷＮ， Ｗａｎｇ ＷＣ， Ｌｉａｏ ＸＬ． ２０１３． ＬＡＭＰ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃ⁃
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｔｅｗａｒｔｉｉ． Ｐｌａｎｔ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ， ２７
（５）： ６１ － ６５ （ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［袁钧， 高文娜， 汪万春， 廖晓
兰． ２０１３． 玉米细菌性枯萎病菌 ＬＡＭＰ检测方法的建立． 植
物检疫， ２７（５）： ６１ － ６５］
（责任编辑：高　 峰）
２５３ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷