全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-19
基金项目:国家自然科学基金(20776061)
作者简介:王瑾(1983-),女,硕士,主要从事酶工程研究
通讯作者:邬敏辰(1962-),男,教授,主要从事酶工程研究
纤维素酶是由外切葡聚糖酶(exo-celobiohydrolases,CBH)、内切葡聚糖酶(endoglucanases,EG)以及 β-
葡聚糖苷酶 (β-glucosidases,BG)组成复合酶系。绿色木霉 (Trichodermaviride)、里氏木霉(Trichoderma
reesei)和康宁木霉(Trichodermakoningi)等是近年来研究较多的产纤维素酶丝状真菌[1]。木霉所产的纤维素
酶系统包括 5种内切葡聚糖酶,即 EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、EGⅣ和 EGⅤ,而 EGⅡ是主要作用成分[2]。
大肠杆菌表达系统已被广泛用于外源蛋白的表达,其中 pET系统是大肠杆菌表达重组蛋白功能很强
大的系统,已用于木霉 egⅠ和 egⅢ等内切葡聚糖酶基因的表达[3,4],但未见有绿色木霉 egⅡ基因在 pET系
统中表达的相关报道。巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的真核表达系统,由于其具有甲醇调控
内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达
王瑾 1 邬敏辰 2 周晨妍 1
(1江南大学生物工程学院 江南大学生物技术教育部重点实验室,无锡 214122;
2江南大学医药学院,无锡 214122)
摘 要: 根据绿色木霉(Trichodermaviride)WL0422菌株内切葡聚糖酶基因 egⅡ的 cDNA序列,设计特异引物,
以重组质粒pTG19-T-egⅡ为模板,扩增得到全长1194bp的 egⅡ成熟肽cDNA片段。将该片段分别克隆到大肠杆菌
(Escherichiacoli)表达载体 pET-28a(+)和毕赤酵母(Pichiapastoris)表达载体pPIC9K中,并在大肠杆菌 Roset(DE3)和
毕赤酵母GS115中进行了表达。重组大肠杆菌表达蛋白占菌体总蛋白的15%,表达产物无内切葡聚糖酶活性。重组毕赤
酵母经甲醇诱导实现了分泌表达,在摇床水平上酶活性达到2788U/ml。酶学性质分析表明,该酶作用的最适pH为4.5,
pH3.5~6.0范围内酶活性保留在80%以上;最适温度为50℃,55℃以下酶的稳定性在90%以上。
关键词:绿色木霉 内切葡聚糖酶 大肠杆菌 毕赤酵母 表达 酶学性质
ExpressionsofEndoglucanaseⅡ Gene(egⅡ)inEscherichiacoli
andPichiapastoris
WangJin1 WuMinchen2 ZhouChenyan1
(1SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversityKeyLaboratoryofIndustryBiotechnologyUnderMinistryofEducation,
JiangnanUniversity,Wuxi214122;2SchoolofMedicineandPharmaceutics,JiangnanUniversity,Wuxi214122)
Abstract: ThematurepeptideofegⅡ(1194bp)wasamplifiedwithatemplateoftherecombinantplasmidpTG19-
T-egⅡ andspecificprimersdesignedaccordingtothepublishedcDNAsecqunceofegⅡ from TrichodermavirideWL
0422.ItwasinsertedintovectorsofpET-28a(+)andpPIC9K,whichweretransformedtoEscherichiacoliRoset(DE3)
andPichiapastorisGS115,respectively.ProductofexpresioninE.coliwas15%ofbacterialwholeprotein,anddidnot
haveanyactivityofendoglucanase.Withmethanolinduction,theproductofexpresioninP.pastorishadanactivityof
endoglucanase,andtheexpresionlevelexceeded2788U/mlinshakeculture.Theoptimum pH andtemperatureofthe
enzymesecretedbyP.pastoriswas4.5and50℃.TheenzymewasquitestablebetweenpH 3.5to6.0,andtherelative
activitieswereremainedover80%.Itwasalsostableatthetemperaturebelow 50℃,andtherelativeactivitieswere
remainedover90%.
Keywords: Trichodermaviride Endoglucanase EscherichiacoliPichiapastoris Expresion Characterization
2008年第3期
的 AOX1强启动子、能够高效稳定地表达外源蛋白而广受关注。2005年国内学者首次将该系统是用于里氏
木霉 egⅡ基因的表达[5],酶活比较后发现,相对于 egⅡ基因在酿酒酵母中的表达效果[6,7],毕赤酵母是表达
木霉内切葡聚糖酶较好的系统。在前期工作中从本实验室保藏的一株高产纤维素酶的绿色木霉 WL0422[8]
克隆到 egⅡ的成熟肽基因(GenBank登录号为 EF602036),全长 1194bp,该基因与登录号为 AB021657的绿
色木霉 egⅡ基因同源性为 94%。报道绿色木霉 egⅡ基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达,并对毕赤酵母
表达产物的酶学性质进行了初步分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株 大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株 Rosset(DE3)和 DH5α由本实验室保存;大肠杆菌表
达载体 pET-28a(+)由本实验室保存;含有 egⅡ成熟肽 cDNA序列的重组质粒 pTG19-T-egⅡ由本实验室构
建。巴氏毕赤酵母菌株 PichiapastorisGS115和分泌型表达载体 pPIC9K由 Invitrogen公司提供。
1.1.2 工具酶及主要试剂 DNA限制性内切酶,T4DNA连接酶,IPTG,HindⅢ、EcoRⅠ、NotⅠ、和 NcoⅠ等
限制性内切酶,TaqDNA聚合酶,G418均购自宝生物工程(大连)有限公司;蛋白质分子量标准购自华美生
物工程公司;DNA分子量标准购自 MBI公司;DNA胶回收试剂盒购自 BBI公司;酵母膏、蛋白胨、YNB等
培养基购自上海生工生物工程有限公司;SDS-PAGE所用试剂购自 Bio-Rad公司;SephadexG-25和
SephadexG-100购自 Pharmacia公司;羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购自 Sigama公司;其它常规材料和试剂均
为国产分析纯。
1.1.3 引物设计与合成 根据绿色木霉egⅡ成熟肽基因cDNA序列设计引物 pET28aN、pET28aC、pPIC9KN
和 pPIC9KC,根据质粒 pPIC9K设计引
物 5AOX1和 3AOX1(表 1),引物均由
上海生工生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 培养基和培养条件 大肠杆菌
LB培养基及培养条件见 pET系统手册,
酵 母 YPD、RDB、MM、MD、BMGY、BMMY
培养基及培养条件见 Invitrogen公司毕
赤酵母操作手册。
1.2.2 EGⅡ活性测定方法 采用 DNS法测定[9]。酶活测定缓体系为 pH4.6的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液,
底物为溶于该缓冲液的 0.5%(w/v)的羧甲基纤维素钠。在 2.4ml底物溶液中加入 0.1ml适当稀释的酶液,
50℃下反应 20min,加入 2.5mlDNS溶液终止反应,然后煮沸 7min显色,用去离子水定溶至 10ml后 540nm
处测定吸光度。在 50℃、pH4.6的条件下,每分钟产生 1μg还原糖所需的酶量为一个酶活单位。
1.2.3 重组载体的构建及大肠杆菌表达 以 pET28aN和 pET28aC为引物、重组质粒 pTG19-T-egⅡ为模
板,扩增得到 egⅡ成熟肽 cDNA序列。将其插入表达载体 pET-28a(+)中,构建重组表达质粒 pET-28a(+)-
egⅡ,并在大肠杆菌 Rosset(DE3)中诱导表达,重组菌株命名为 Rosset/pET-egⅡ,空质粒对照菌株命名为
Rosset/pET。37℃、220r/min振荡培养,当 OD600达到 0.6左右时加 IPTG至终浓度为 1mmol/L诱导表达,同
时将诱导温度降至 28℃。诱导培养一定时间后,5000r/min离心 5min收集菌体,超声破碎(功率 400W,工
作 5s,间歇 5s,破碎 100次)后 10000r/min离心 20min,取上清检测酶活。
1.2.4 毕赤酵母重组载体的构建与转化 以 pPIC9KN和 pPIC9KC为引物、重组质粒 pTG19-T-egⅡ为模
板,扩增得到 egⅡ成熟肽 cDNA序列。将其插入表达载体 pPIC9K中,构建重组质粒 pPIC9K-egⅡ。将
pPIC9K-egⅡ和 pPIC9K用 NcoⅠ线性化,电激(电压 1500V,电激时间 5ms)转化进入毕赤酵母 GS115感受
表 1 PCR引物序列及其酶切位点
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生物技术通报Biotechnology Bulletin2008年第3期
态细胞。电激后温育 1h,涂布于 RDB平板上,30℃培养 2~4d直至长出转化子。
1.2.5重组毕赤酵母的筛选与表达 挑取 RDB平板上的转化子分别点种于筛选培养基 MD和 MM平板
上,30℃培养 2d,在 MD平板上生长正常而在 MM平板上生长缓慢或者不生长的转化子为阳性转化子。挑
取阳性转化子,分别点种于含 250μg/ml、500μg/ml、1 000μg/ml、2 000μg/ml、3 000μg/ml G418的 YPD培养
基平板,以筛选转化子。为确定 G418抗性对基因表达的影响,随机挑取一定量的不同抗性阳性转化子,接
种于含 20ml BMGY生长培养基的 250ml摇瓶中,30℃下 220r/min培养 48h,5 000r/min离心 5min收集菌
体,将菌体转移至 30ml BMMY诱导培养基中,如上条件继续培养,每 24h补加 100%甲醇至终浓度为 5%。
每 12h取样,5 000r/min离心 5min,收集上清,即为粗酶液。依据该实验结果进一步筛选高表达菌株。
1.2.6重组毕赤酵母菌株的 PCR鉴定 毕赤酵母基因组 DNA抽提方法及 PCR反应条件参考 Invitrogen
公司毕赤酵母操作手册。以重组菌 DNA为模板,5′AOX1和 3′AOX1为引物进行 PCR。
1.2.7 EGⅡ的纯化[10]将含目的蛋白的 P. pastoris发酵液离心(5 000r/min,15min),所得上清液即为粗酶
液。粗酶液经硫酸铵分级沉淀后,经 SephadexG-25离子交换层析和 Sephadex G-100分子筛层析,用乙酸-
乙酸钠缓冲液洗脱收集,冷冻干燥浓缩后保存。
1.2.8 EGⅡ酶学性质的测定 在 pH 3.0、3.5、4.0、4.5、 .0、5.5、6.0、6.5和 7.0的条件下测定酶活性,确定
其作用最适 pH;在以上 pH条件下分别 50℃保温 1h测定酶活性,以确定该酶 pH稳定性。分别在 35℃、
40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和 70℃条件下测定酶活性,确定其最适作用温度;在以上温度下各保温 1h
后测酶活性,确定其温度稳定性。
2 结果与分析
2.1重组载体在大肠杆菌中的表达
将重组质粒 pET-28a(+)-egⅡ转化到大肠杆菌 Rosset(DE3),诱导培养 1h、3h和 5h,诱导后的菌体蛋
白经 15%SDS-PAGE分离后,出现一条分子量约为 42kD的特异性条带(图 1),且随着时间的递增蛋白浓度
增大。Gel-ProAnalyzer软件分析发现,5h诱导后目的蛋白含量占菌体总蛋白的 15%。表达产物无内切葡聚
糖酶活性。
2.2毕赤酵母重组载体的构建
将 egⅡ基因插入毕赤酵母表达载体 pPIC9K中,获得重组质粒 pPIC9K-egⅡ。用 EcoRⅠ和 NotⅠ双酶切
鉴定,得到的片段长度分别 9.3kb和 1 194bp(图 4);同时将质粒 pPIC9K-egⅡ作为模板,用引物 pPIC9KN
和 pPIC9KC进行 PCR鉴定,得到 1 194bp长度片段。以上结果说明 egⅡ基因已插入载体 pPIC9K。测序结果
表明插入片段在 pPIC9K中有正确的阅读框。
图 1 大肠杆菌表达重组蛋白的 SDS-PAGE分析 图 2 重组质粒 pPIC9K-EGⅡ的酶切和 PCR分析
M:1 kbp DNA marker 1: double restriction enzyme diges-
tion of pPIC9K-egⅡ with EcoRⅠand NotⅠ 2: PCR
product of pPIC9K-egⅡ
M:low molecular weight prtotein marker 1:E. coli with plasmid
pET-28a (+) 2:E. coli with recombinant plasmid contr l 3~5:
E. coli with recombinant plasmid induced for 1h, 3h and 5h.
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2.3重组毕赤酵母的筛选和鉴定
在 MD和 MM平板上筛选出 1 000个阳性转化子,点种于含不同浓度 G418的 YPD平板上。G418抗性
对表达量影响的实验表明,高抗菌株表达重组 egⅡ酶活较高。挑取 G418浓度为 3 000μg/ml的平板上筛得
的 20个阳性转化子,分别接种于 20ml BMGY培养基中,培养 48h后转入 30ml BMMY培养基诱导表达。每
12h取发酵液收集上清测酶活,选出一株酶活力最高的毕赤酵母重组工程菌 P205。
提取 P205菌株的基因组 DNA,用引物 5AOX1和 3AOX1进行 PCR鉴定(图 3),结果表明重组质粒
pPIC9K-egⅡ已整合到毕赤酵母染色体上。
2.4重组毕赤酵母的诱导表达和产物分析
重组毕赤酵母工程菌株 P205经甲醇诱导 12h就开始产内切葡聚糖酶,诱导 120h后,酶活力达到高
峰,为 2 788U/ml。将发酵所得的粗酶液通过纯化得到电泳级纯品,SDS-PAGE表明,表达产物的分子量约为
48kD(图 4)。
图 3 重组毕赤酵母的 PCR鉴定
M:1 kbp DNA marker 1: PCR product of Pichia pastoris
with pPIC9K 2:PCR product of Pichia pastoris GS115
3: PCR product of Pichia pastoris/P205.
图 4 毕赤酵母表达重组蛋白的 SDS-PAGE分析
M: low molecular weight prtotein marker
1: protein secreted by P. pastoris
2.5重组 EGⅡ的酶学性质
在 50℃、不同 pH缓冲体系下测酶活,该重组酶最适作用 pH为 4.5(图 5a)。在不同 pH条件下 50℃保
温 1h测定酶活,该重组酶在 pH 3.5~6.0范围内较稳定,酶活性保留在 90%以上,且偏酸性环境更利于酶
的稳定(图 5b)。
在 pH 4.6、不同温度条件下测定内切葡聚糖酶活力,该酶最适作用温度为 50℃(图 5c)。将酶液在不同
温度条件下保温 1h,检测剩余酶活力,发现 55℃以下该酶十分稳定,酶活性保留在 95%以上;当温度高于
55℃时,酶活下降较快(图 5d)。
图 5a pH值对酶活的影响 图 5b pH值对酶稳定性的影响
王瑾等:内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达 113
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
3 讨论
pET系统已用于表达某些木霉内切葡聚糖酶基因,表达产物大都形成了包涵体或活性很低的酶蛋白[3]。
包涵体的形成与外源基因脯氨酸的含量有很大关系[11]。真菌所产的纤维素酶基因大多具有一段富含脯氨
酸、丝氨酸和苏氨酸的连接桥[12]。因此,推测连接桥的存在是大肠杆菌表达真菌纤维素酶形成包涵体的重
要原因。通过 swissmodel分析 egⅡ序列的二级结构,发现同样存在连接桥,可以预测大肠杆菌表达绿色木
霉 WL0422egⅡ形成了包涵体。另外,由于大肠杆菌表达真核基因时,缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶
和辅助因子,常常导致表达的蛋白无活性。本研究的表达结果虽然不利于工业化生产,但由于大肠杆菌较
其他表达系统简单、快捷,所以为点突变等进一步理论研究奠定了基础。
毕赤酵母表达系统是一种极具潜力的表达系统,尤其具有对表达的蛋白进行翻译后的正确加工和修
饰(二硫键的形成、N-糖基化、O-糖基化)等其它系统所不可比拟的优点而得到越来越广泛的应用[13]。将毕
赤酵母分泌型表达质粒 pPIC9K作为载体、菌株 GS115作为宿主表达绿色木霉 egⅡ成熟肽 cDNA序列,表
达产物具有内切葡聚糖酶活性,酶活达 2788U/ml,略高于里氏木霉 egⅡ基因在毕赤酵母中表达的酶活(1
573.0U/ml,每分钟产生 1μg还原糖所需的酶量为一个酶活单位)[5]。粗酶液纯化后经 SDS-PAGE分析表明,
酵母表达的蛋白分子量约为 48kD,比大肠杆菌表达的高 6kD。对 egⅡ氨基酸序列分析发现存在一个的 N-
糖基化位点;由于 egⅡ基因的连接桥易于暴露于水相,为防止被蛋白酶水解,所以常常形成 O-糖基化[12]。
蛋白糖基化修饰使得毕赤酵母表达的蛋白分子量高于大肠杆菌表达的蛋白分子量。酶学性质的研究表明,
由毕赤酵母表达的 egⅡ作用的最适 pH为 4.5,最适温度为 50℃,在 pH3.5~6.0和 55℃以下较稳定,该酶
将在食品和饲料工业有广泛的应用。
目前本实验室正在进行毕赤酵母发酵条件的优化以进一步提高酶活,并对 EGⅡ各功能区域的结构和
作用进行研究,进而通过改造基因结构提高酶活。
参考 文献
1 BhatMK,BhatS.BiotechnologyAdvances,1997,15:583~620.
2 SaloheimoM,Nakari-SetalaT,TenkanenM,etal.EuropeanJournalofBiochemistry,1997,249:584~591.
3 KwonI,EkinoK,GotoM,etal.BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,1999,63(10):1714~1720.
4 OkadaH,TadaK,SekiyaT,etal.AppliedandEnvironmentMicrobiology,1998,64:555~563.
5 乔宇,毛爱军,何永志,等.菌物学报,2004,23(3):398~396.
6 PentilaME,AndrL,SaloheimoM,etal.Yeast,1987,3(3):175~185.
7 肖壮志,王婷,汪天虹,等.微生物学报,2001,41(4):391~396.
8 邬敏辰,方诗月,李剑芳,等.江苏食品与发酵,2006,1:1~3,6.
9 GhoseTK.PureandAppliedChemistry,1987,59(2):257~268.
10 宋金柱,杨谦,陈中祥,等.哈尔滨工业大学学报,2006,39(11):1923~1926.
11 WilkinsonDL,HarisonRG.Biotechnology,1991,9:443~448.
12 Cavaco-pauloA,MorgadoJ,AndreausJ,etal.EnzymeandMicrobialTechnology,1999,25:639~643.
13 韩雪清,刘湘涛,尹双辉.微生物学杂志,2003,23(4):35~40.
图 5c 温度对酶活的影响 图 5d 温度对酶稳定性的影响
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