全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（４）： ５２９ － ５３６ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０４􀆰 ００１
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３０２８，２０１４０３０３２），浙江省农业科学院科技创新能力提升工程项目
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｊｐｃｈｅｎ２００１＠ １２６． ｃｏｍ， ｙａｎｆｅｉ＠ ｙｅａｈ． ｎｅｔ
收稿日期： ２０１４ － １２ － １７
黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析
及病害的田间调查
肖彩利１，２ 　 郑红英２ 　 吴晓花３ 　 李国景３ 　 燕　 飞２∗　 陈剑平２∗
（１．浙江师范大学化学与生命科学学院， 金华 ３２１００４； ２．浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，
杭州 ３１００２１； ３．浙江省农业科学院蔬菜研究所， 杭州 ３１００２１）
摘要： 为明确近年来在浙江省葫芦科作物上发生的黄瓜绿斑驳花叶病毒（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＣＧＭＭＶ）基因组特征及其发生分布情况，从浙江省及上海地区的甜瓜、西瓜和瓠瓜上
采集疑似样品进行 ＲＴ⁃ＰＣＲ鉴定，通过分段扩增测序的方法拼接获得基因组全序列并进行系统进
化分析，利用特异性引物扩增获得 ＣＧＭＭＶ外壳蛋白（ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＰ）基因序列，制备 ＣＧＭＭＶ ＣＰ
抗血清进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ和 Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ检测。 结果显示，来自甜瓜、西瓜和瓠瓜的 ３ 个 ＣＧＭＭＶ 分
离物基因组全序列均具有烟草花叶病毒属典型基因组结构特征，全部由 ６ ４２３ ｎｔ 构成；３ 个全序列
间的核苷酸同源性高达 ９９􀆰 １１％ ～ ９９􀆰 ６７％ ，编码的 ＣＰ 氨基酸同源性为 １００％ 。 系统进化分析发
现，ＣＧＭＭＶ不同分离物形成 ２ 个进化相关群体，３ 个浙江的 ＣＧＭＭＶ 分离物均位于第 Ｉ 组内，与已
报道的中国 ＣＧＭＭＶ分离物和韩国 ＣＧＭＭＶ 分离物亲缘性较高。 Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ 检测表明 ＣＧＭＭＶ
ＣＰ抗血清可以与感病植株中的病毒发生特异性反应，可用于 ＣＧＭＭＶ 鉴定；Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ 检测发现
ＣＧＭＭＶ在浙江省和上海市的葫芦科作物上普遍存在。
关键词： 黄瓜绿斑驳花叶病毒； 全序列； 系统进化分析； 原核表达； 抗血清制备
Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ
ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
Ｘｉａｏ Ｃａｉｌｉ１，２ 　 Ｚｈｅｎｇ Ｈｏｎｇｙｉｎｇ２ 　 Ｗｕ Ｘｉａｏｈｕａ３ 　 Ｌｉ Ｇｕｏｊｉｎｇ３ 　 Ｙａｎ Ｆｅｉ２∗ 　 Ｃｈｅｎ Ｊｉａｎｐｉｎｇ２∗
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｈｕａ ３２１００４， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２１，
Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２１， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ ＣＧＭＭＶ）
ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ｔｈｒｅｅ ＣＧＭＭＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｍｏｔｔｌｅ， ｍｏｓａｉｃ ａｎｄ ｄｉｓｔｏｒｔ
ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｎ ｌｅａｆ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｅｌｏｎ， ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ａｎｄ ｂｏｔｔｌｅ ｇｏｕｒｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ＣＧＭＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｔｗｏ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｗｈｉｃｈ ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ＣＧＭＭＶ ｇｅｎｏｍｅ． Ｆｏｒ ｓｕｒｖｅｙｉｎｇ ｔｈｅ
ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＧＭＭＶ ｉｎ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｎｇｈａｉ， ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＣＧＭＭＶ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｗｉｔｈ Ｅ． ｃｏｌｉ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ
ｅａｃｈ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ＣＧＭＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ６ ４２３ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ
ｇｅｎｕｓ Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ９９􀆰 １１％ － ９９􀆰 ６７％ ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ
ｉｄｅｎｔｉｃａｌ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ＣＧＭＭＶ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ
ｔｈａｔ ＣＧＭＭＶ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ． Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ
ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｉ， ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｔｈｅｓｅ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗａｓ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ
Ｋｏｒｅａｎ ＣＧＭＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ． Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ＣＧＭＭＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ． Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ＣＧＭＭＶ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｃｕｒｂｉｔ
ｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｆｉｅｌｄｓ， ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ＣＧＭＭＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｃｒｏｐｓ ｗａｓ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｆｉｅｌｄｓ ｉｎ Ｚｈｅｊｉａｎｇ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｉｔｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ＣＧＭＭＶ）； ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ； ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ；
ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
　 　 黄瓜绿斑驳花叶病毒 （Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，ＣＧＭＭＶ）是严重危害葫芦科作物生产
的重要种传病毒之一，目前在多个国家和地区分布
危害（Ｕｇａｋｉ ｅｔ ａｌ． ，１９９１；Ｐｏｌｉｓｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ． ，２００７）。 自
１９９０ 年开始，该病毒在我国口岸不断被截获（陈京
和李明福，２００７；文朝慧等，２００９），目前在我国辽宁
（陈红运等，２００６）、广西（秦碧霞等，２００８）、广东（李
小妮等，２００９）、北京（田永蕾等，２００９）、湖北（汤少
云等，２０１１）等地均有发生。 在浙江省，该病害自
２０１１ 年开始在慈溪、温岭、建德、金华、台州、三门、
余姚等地陆续暴发，对大田瓜类作物生产造成严重
危害，导致巨大的经济损失（林燚等，２０１２）。
鉴于 ＣＧＭＭＶ一旦侵染将对作物生产造成巨大
的经济损失，我国农业部于 ２００６ 年将 ＣＧＭＭＶ确定
为全国农业植物检疫性有害生物。 为避免该病毒的
大面积危害和扩散，ＣＧＭＭＶ 的鉴定显得尤为重要。
目前已建立了一系列快速、准确、高灵敏度的检疫检
测方法，如 ＴａｑＭａｎ 荧光定量 ＰＣＲ （ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． ，
２００８）、免疫斑点法（尚海丽等，２０１０）和免疫捕获
ＲＴ⁃ＰＣＲ（尚海丽等，２０１１）等。 基于特异性抗体的
免疫学检测方法适用于大批量样品的快速检测，广
泛应用于病毒病害田间样品的检测；而基于分子生
物学的检测方法对于 ＣＧＭＭＶ 的鉴定更加灵敏准
确，并且可通过序列分析提供更多的病毒基因变异
信息，对于了解 ＣＧＭＭＶ 的扩散来源及其传播途径
具有重要意义。 目前我国辽宁、北京、山东等地发生
的 ＣＧＭＭＶ分离物全序列已有报道，序列分析的结
果表明 ＣＧＭＭＶ分离物之间的差异并不明显，推测
可能具有共同的侵染来源（田永蕾等，２００９）。
本实验室在前期工作中，从浙江省慈溪市、嘉善
县等地发现了表现斑驳、花叶或畸形的甜瓜、西瓜和
瓠瓜样品，通过电子显微镜观察和 ＲＴ⁃ＰＣＲ 方法明
确 ３ 个样品均感染 ＣＧＭＭＶ。 但目前尚不清楚这些
ＣＧＭＭＶ分离物的全序列。 因此，本研究在前期工
作的基础上进一步对 ３ 种不同寄主上的 ＣＧＭＭＶ基
因组全序列进行测定，并与国内外报道的 ＣＧＭＭＶ
全序列进行同源性比较，以期明确浙江省内不同地
区、不同寄主上发生的 ＣＧＭＭＶ 的来源及分子变异
情况。 鉴于 ＣＧＭＭＶ的发生和流行具有暴发性和随
机性，为了解该病毒在浙江省及上海地区的发生分
布情况，应用原核表达制备的 ＣＧＭＭＶ ＣＰ抗血清检
测该地区葫芦科作物上 ＣＧＭＭＶ 的发生情况，以期
为控制病害发生、预防病毒扩散提供指导依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试植物样品：表现皱缩、斑驳、花叶或畸形并
已鉴定感染 ＣＧＭＭＶ 的瓠瓜叶片和果实样品于
２０１３ 年 ４ 月采自浙江省嘉善县，甜瓜、西瓜病叶样
品于 ２０１３ 年 ４ 月采自浙江省慈溪市。 共收集葫芦
科疑似感病样品 ５３９ 份，其中 ２０１２—２０１４ 年采集自
浙江省嘉善、海宁、绍兴、临安、慈溪等地表现病毒病
症状的瓠瓜、西瓜、黄瓜、甜瓜等大棚栽培或露天栽
培的葫芦科作物样品共 １０８ 份；２０１３ 年 ７ 月—１１ 月
采集自上海市奉贤区、松江区、宝山区、嘉定区、浦东
新区、金山区、青浦区和崇明县露天栽培的葫芦科作
物样本共 ４３１ 份。 所有样品均保存于 － ７０℃超低温
冰箱。
培养基：ＬＢ（Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ）培养基：酵母提取物
５ ｇ、胰化蛋白胨 １０ ｇ、氯化钠 １０ ｇ，用 ＮａＯＨ 调 ｐＨ
至 ７􀆰 ０，１２１℃高压灭菌 ２０ ｍｉｎ。
试剂：ＴＲｉｚｏｌ ＲＮＡ 抽提试剂盒，美国 Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ⁃
ｎｏｌｏｇｉｅｓ公司；ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 试剂盒，德国
ＱＩＡＧＥＮ公司；ＮＴＡ Ｈｉｓ·Ｂｉｎｄ 树脂及相关蛋白纯化
试剂，德国 ＭＥＲＣＫ 公司；Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶，日本
ＴａＫａＲａ公司；Ｍ⁃ＭＬＶ 逆转录酶、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ 聚合
０３５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
酶和 Ｔ４ ＤＮＡ连接酶，日本 ＴｏＹｏＢｏ 公司；碱性磷酸
酶标羊抗兔 ＩｇＧ、５⁃溴⁃４⁃氯 ３⁃吲哚磷酸和氮蓝四唑，
美国 Ｓｉｇｍａ 公司；ｐＥａｓｙ⁃Ｂｌｕｎｔ Ｚｅｒｏ 载体、大肠杆菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）表达菌株，北京全式金生物技术有限公
司；硝酸纤维素膜 ＲＰＮ３０３Ｃ，美国通用电气医疗集
团；ＳＵＰＥＲＳＷＩＴＣＨＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ，杭
州索莱尔博奥生物技术有限公司；其余试剂均为国
产分析纯；ｐＥＴ⁃２８ａ 原核表达载体由浙江省农业科
学院植物病毒学实验室保存。
仪器：ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｍｏｄｅｌ ２５０ 电泳仪，美国 Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 公司；Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｕｍ® ＡＣ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ
凝胶成像系统，美国 ＵＶＰ公司；ＥＤＣ⁃８１０ ＰＣＲ仪，东
胜创新生物科技有限公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 总 ＲＮＡ提取和 ｃＤＮＡ合成
取表现症状的甜瓜、西瓜、瓠瓜叶片各 ０􀆰 １ ｇ，按
照 ＴＲｉｚｏｌ 试剂盒说明书提取植物总 ＲＮＡ，以Ｍ４⁃Ｔ
５′⁃ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ （ Ｔ） １５⁃３′为起始引物
（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． ，２００１），用 Ｍ⁃ＭＬＶ 逆转录酶参照说明
书合成病毒 ＲＮＡ第一链 ｃＤＮＡ。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＣＧＭＭＶ ５′和 ３′端序列及全序列扩增
根据 ＧｅｎＢａｎｋ上发表的 ＣＧＭＭＶ基因组全序列
（登录号 ＮＣ＿００１８０１）设计引物（表 １）。 以 ３ＡＰ ／
ＣＧＭＭＶＣＰ（ ＋ ）为引物进行扩增获得完整 ３′端序
列，５′端序列的获得首先以 ５ＡＰ ／ ＣＧＭＭＶ１２１８（ － ）
为引物进行第 １ 轮扩增（３ＡＰ 和 ５ＡＰ 为试剂盒特异
性引物），然后以该 ＰＣＲ 扩增产物为模板，以 ５ＡＰ ／
ＣＧＭＭＶ６８２（ － ）为引物作巢式 ＰＣＲ 进行第 ２ 轮扩
增，获得完整的 ５′端序列。 以引物对 ＣＧＭＭＶＣＯＭ
（ ＋ ） ／ ＣＧＭＭＶ３５２６（ － ）和 ＣＧＭＭＶ２２５１（ ＋ ） ／ ＣＧＭ⁃
ＭＶＣＯＭ（ － ）分 ２ 段扩增 ＣＧＭＭＶ序列，测序结果拼
接获得 ＣＧＭＭＶ全序列。 ５０ μＬ 的 ＰＣＲ 扩增体系：
无 ＲＮＡ 酶灭菌去离子水 ９ μＬ、２ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ
ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ ２５ μＬ、 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰｓ １０ μＬ、１０
μｍｏｌ ／ Ｌ 上下游引物各 １􀆰 ５ μＬ、ｃＤＮＡ 模板 ２ μＬ、
ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ 聚合酶 １ μＬ。 反应条件：９４℃ ２ ｍｉｎ；
９４℃ １５ ｓ，６０℃ ３０ ｓ，６８℃ １ ～６ ｍｉｎ（１ ｋｂ ／ ｍｉｎ，根据
不同长短模板调节），３５ 个循环；６８℃ １０ ｍｉｎ。
表 １ 用于 ＣＧＭＭＶ ｃＤＮＡ的 ５′和 ３′端的快速扩增、全序列扩增及原核表达的引物序列及其在基因组上的位置
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ５′⁃ＲＡＣＥ ａｎｄ ３′⁃ＲＡＣＥ ｏｆ ＣＧＭＭＶ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列 （５′⁃３′）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′⁃３′）
位置　 　 　
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ （ｎｔ） 　 　 　
ＣＧＭＭＶ６８２（ － ） ＣＣＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＴＡＴＣ ６８２ ～ ７０４
ＣＧＭＭＶ１２１８（ － ） ＧＣＴＡＡＴＧＴＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＡＴＧＧ １ ２１８ ～ １ ２４２
ＣＧＭＭＶＣＰ（ ＋ ） ＡＴＧＧＣＴＴＡＣＡＡＴＣＣＧＡＴＣＡＣ ５ ７６３ ～ ５ ７８２
ＣＧＭＭＶＣＯＭ（ ＋ ） ＧＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＣＭＡＡＣＡＡＣ 　 １ ～ １９
ＣＧＭＭＶ３５２６（ － ） ＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＧ ３ ５２６ ～ ３ ５４５
ＣＧＭＭＶ２２５１９（ ＋ ） ＧＧＧＡＣＣＡＴＴＣＧＡＧＡＧＡＧＧ ２ ２５１ ～ ２ ２６８
ＣＧＭＭＶＣＯＭ（ － ） ＴＧＧＧＣＣＣＣＴＡＣＣＣＧＧＧＧ ６ ４０８ ～ ６ ４２４
ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰｅ（ ＋ ） ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＴＡＣＡＡＴＣＣＧＡＴＣＡＣ 　 　 —
ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰｅ（ － ） ＧＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＧＣＴＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＴＡＧ 　 　 —
　 　 下划线表示 ＢａｍＨ Ｉ酶切位点（ＧＧＡＴＣＣ）和 Ｓａｌ Ｉ酶切位点（ＧＴＣＧＡＣ）。 ＢａｍＨ Ｉ（ＧＧＡＴＣＣ） ａｎｄ Ｓａｌ Ｉ（ＧＴＣＧＡＣ） ｓｉｔｅ ｗｅｒｅ
ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ．
１􀆰 ２􀆰 ３ ＣＧＭＭＶ全序列克隆、测序和分析
ＰＣＲ产物经 １％琼脂糖凝胶电泳分离，切下预
期大小条带，用 ＱＩＡｑｕｉｃｋ 胶纯化试剂盒回收，纯化
产物直接插入 ｐＥａｓｙ⁃Ｂｌｕｎｔ Ｚｅｒｏ载体，由铂尚生物技
术（上海）有限公司进行测序并拼接获得全序列。
采用 ＤＮＡＭＡＮ软件将获得的序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中已
提交的相似 ＣＧＭＭＶ序列进行比较分析，采用 Ｃｌｕｓｔ⁃
ａｌ Ｗ软件对所有已登录的 ＣＧＭＭＶ 全序列进行多
重序列比对，采用 ＭＥＧＡ ６􀆰 ０ 软件构建包含所有相
关 ＣＧＭＭＶ全序列的系统进化树。
１􀆰 ２􀆰 ４ 原核表达载体的构建及诱导表达
根据测定的 ＣＧＭＭＶ分离物序列设计表达引物
ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰｅ（ ＋ ）和 ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰｅ（ － ）（表 １），引物
ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰｅ（ ＋ ）和 ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰｅ（ － ）的 ５′端分别
引入 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｓａｌ Ｉ识别位点序列。 以感病瓠瓜合
成的第一链 ｃＤＮＡ 为模板，ＰＣＲ 扩增全长 ＣＰ 基因，
预期大小的扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳分离后
用 ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 试剂盒回收。 纯化产物
用 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｓａｌ Ｉ双酶切后插入到同样双酶切的原
核表达载体 ｐＥＴ⁃２８ａ中，在大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）菌
１３５４ 期 肖彩利等： 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查
株中用 ＩＰＴＧ诱导表达目的基因，ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 分离后
用考马斯亮蓝 Ｒ⁃２５０ 染色检测蛋白表达情况（孟媛
等，２０１３）。
１􀆰 ２􀆰 ５ 抗血清制备及 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析检测
选取正确表达外源基因的大肠杆菌，在 ５００ ｍＬ
ＬＢ培养基中大量诱导表达包含 ｐＥＴ⁃ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰ 质
粒的 ＢＬ２１ （ ＤＥ３）菌株，收集菌体。 经 ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ裂解后检测蛋白主要以包涵体形式存
在。 经超声波裂解后提取高纯度包涵体，在变性条
件下将蛋白溶液与 Ｎｉ⁃ＮＴＡ Ｈｉｓ·Ｂｉｎｄ 树脂结合，过
Ｈｉｓ亲和柱分离提纯 ＣＧＭＭＶ 的 ＣＰ 蛋白。 提纯目
的蛋白由杭州华安生物技术有限公司分 ４ 次免疫新
西兰大白兔制备抗血清，最后 １ 次免疫后 １ 周采血。
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测抗血清特异性，一抗为原核表达制
备的抗血清，二抗为羊抗兔 ＩｇＧ（碱性磷酸酶共价结
合），５⁃溴⁃４⁃氯 ３⁃吲哚磷酸 ／氮蓝四唑显色并拍照记
录结果（萨姆布鲁克等，１９９６）。
１􀆰 ２􀆰 ６ 疑似样品的 Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ法检测
对采集的 ５３９ 份浙江和上海大棚栽培或露天栽
培的葫芦科作物样品取叶片汁液进行 Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ检
测。 植物叶片称重后，按重量体积比 １ ∶ １０ ～ １ ∶ ５０
加入 ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＰＢＳ研磨，８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ３ ｍｉｎ，
取 ２ μＬ上清液点至硝酸纤维素膜上进行检测。 检
测所用一抗为原核表达制备的抗血清，二抗为羊抗
兔 ＩｇＧ（碱性磷酸酶共价结合），５⁃溴⁃４⁃氯 ３⁃吲哚磷
酸 ／氮蓝四唑显色后观察拍照，根据显色情况检测植
株是否感染 ＣＧＭＭＶ，并分析病毒的分布情况。
２ 结果与分析
２􀆰 １ ＣＧＭＭＶ分离物基因组结构分析
从浙江省甜瓜、西瓜和瓠瓜上扩增到的 ＣＧＭ⁃
ＭＶ分离物分别命名为 ＣＧＭＭＶ⁃ＴＧ、ＣＧＭＭＶ⁃ＸＧ 和
ＣＧＭＭＶ⁃ＨＧ。 序列分析表明，这 ３ 个分离物的基因
组全序列均由 ６ ４２３ 个核苷酸构成（不包含 ｐｏｌｙ（Ａ）
尾），基因组都具有相同长度的 ５′端非编码区、３′端
非编码区和 ４ 个开放阅读框（图 １）。 靠近 ５′端的
１２９ ｋＤ 和 １８６ ｋＤ 蛋白与病毒复制相关，其中 １８６
ｋＤ蛋白是由 １２９ ｋＤ 蛋白终止子通读产生的，另外
还包括由 ２６４ 个氨基酸组成的分子量为 ２９ ｋＤ的运
动蛋白（ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＰ）和由 １６１ 个氨基酸组
成的分子量为 １７􀆰 ４ ｋＤ 的外壳蛋白（ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，
ＣＰ）。 在 ＲＮＡ 依赖 ＲＮＡ 聚合酶 （ ＲＮＡ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＲｄＲＰ）与 ＭＰ 及 ＭＰ 与 ＣＰ 编码区
均存在基因重叠（图 １）。
图 １ ＣＧＭＭＶ浙江分离物基因组的结构示意图
Ｆｉｇ． １ Ｇｅｎｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＧＭＭＶ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ
　
２􀆰 ２ 全序列同源性及系统进化树分析
这 ３ 个 ＣＧＭＭＶ分离物三者之间的核苷酸全序
列同源性高达 ９９􀆰 ６７％ ；３ 个 ＣＧＭＭＶ分离物两两之
间 ＣＧＭＭＶ⁃ＴＧ 与 ＣＧＭＭＶ⁃ＨＧ 序 列 同 源 性 为
９９􀆰 ３９％ ，ＣＧＭＭＶ⁃ＴＧ与 ＣＧＭＭＶ⁃ＸＧ 序列同源性为
９９􀆰 ５０％ ，ＣＧＭＭＶ⁃ＸＧ与 ＣＧＭＭＶ⁃ＨＧ序列同源性为
９９􀆰 １１％ 。 这 ３ 个分离物之间的非编码区或各编码
区核苷酸与氨基酸同源性比对结果显示，ＣＧＭＭＶ⁃
ＴＧ、ＣＧＭＭＶ⁃ＨＧ 与 ＣＧＭＭＶ⁃ＸＧ 的非编码区仅在
５′⁃ＵＴＲ存在 １ 个核苷酸差异，其 ３′⁃ＵＴＲ 序列完全
一致；在蛋白编码区，三者的 ＭＰ 和 ＣＰ 的氨基酸之
间同源性均为 １００％ ，仅在复制酶区域存在较小的
差异（表 ２）。
　 　 将分离的 ＣＧＭＭＶ 分离物与已报道的其它
ＣＧＭＭＶ全基因序列进行同源性分析表明，ＣＧＭＭＶ
各分离物之间的同源性在 ８９􀆰 ４９％ ～ １００􀆰 ００％ 之
间。 系统进化树显示，ＣＧＭＭＶ 分离物可归为 ２ 个
进化相关群体（图 ２）。 Ｉ 组主要包括来自中国、日
本、韩国、印度、美国以及以色列的 ２３ 个分离物，同
源性为 ８９􀆰 ６３％ ～１００􀆰 ００％ ；３ 个浙江 ＣＧＭＭＶ 分离
物均位于第 Ｉ组内，且这 ３ 个分离物与已报道的中
国 ＣＧＭＭＶ分离物及韩国 ＣＧＭＭＶ分离物全序列亲
缘性较高。 ＩＩ组包括来自以色列、西班牙、俄罗斯的
５ 个欧洲分离物，同源性为 ９２􀆰 ９６％ ～９９􀆰 ９１％ 。 Ｉ组
与 ＩＩ组的同源性为 ８９􀆰 ４９％ ～ ９５􀆰 ２５％ ，且 Ｉ 组和 ＩＩ
组间不同 ＣＧＭＭＶ分离物的基因组变异存在一定的
地域相关性。 但在组 Ｉ内也有部分欧洲和北美洲的
ＣＧＭＭＶ分离物与亚洲分离物形成一簇。 而以色列
ＣＧＭＭＶ分离物在 ２ 个组中均有分布。 进化分析没
有发现这些分离物间存在明显的寄主分化性。
２３５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
表 ２ 三个浙江 ＣＧＭＭＶ分离物序列的同源性比较
Ｔａｂｌｅ ２ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ＣＧＭＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ％
分离物
Ｉｓｏｌａｔｅ
５′⁃非编
码区
５′⁃ＵＴＲ
１２９ ｋＤ复制酶
１２９ ｋＤ ｐｒｏｔｅｉｎ
１８６ ｋＤ复制酶
１８６ ｋＤ ｐｒｏｔｅｉｎ
运动蛋白
Ｍｏｖｅｍｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ
外壳蛋白
Ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
３′⁃非编
码区
３′⁃ＵＴＲ
全序列
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＣＧＭＭＶ⁃ＴＧ ∶
ＣＧＭＭＶ⁃ＸＧ
９８􀆰 ３３ ９９􀆰 ６２（９９􀆰 ８３） ９９􀆰 ４５（９９􀆰 ７０） ９９􀆰 ７５（１００􀆰 ００） ９９􀆰 ３８（１００􀆰 ００） １００􀆰 ００ ９９􀆰 ５０
ＣＧＭＭＶ⁃ＴＧ ∶
ＣＧＭＭＶ⁃ＨＧ
１００􀆰 ００ ９８􀆰 ９８（９９􀆰 ３９） ９９􀆰 ２３（９９􀆰 ４５） １００􀆰 ００（１００􀆰 ００） １００􀆰 ００（１００􀆰 ００） １００􀆰 ００ ９９􀆰 ３９
ＣＧＭＭＶ⁃ＨＧ ∶
ＣＧＭＭＶ⁃ＸＧ
９８􀆰 ３３ ９８􀆰 ８４（９９􀆰 ３９） ９９􀆰 ８７（９９􀆰 ５１） ９９􀆰 ７５（１００􀆰 ００） ９９􀆰 ３８（１００􀆰 ００） １００􀆰 ００ ９９􀆰 １１
　 　 括号外为核苷酸同源性百分比，括号内为氨基酸同源性百分比。 Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｃｋｅｔｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｂｒａｃｋｅｔｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ．
图 ２ 基于 ＣＧＭＭＶ基因组核苷酸全序列同源性构建的浙江分离物及其相关分离物的系统进化树
Ｆｉｇ． ２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａｌｌ ＣＧＭＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ
下划线标示的为 ３ 个浙江 ＣＧＭＭＶ分离物。 Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ＣＧＭＭＶ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ．
　
２􀆰 ３ ＣＧＭＭＶ ＣＰ基因的原核表达和Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ检测
从表现花叶症状的瓠瓜病样中扩增全长 ＣＰ 基
因，大小为 ４８３ ｂｐ。 对 ＣＰ 基因进行原核表达蛋白
检测，诱导产生大小约为 ２２􀆰 ７ ｋＤ 的特异性表达条
带（图 ３⁃Ａ），这与通过氨基酸序列预测的 ＣＧＭＭＶ
ＣＰ蛋白（１７􀆰 ４ ｋＤ）融合 Ｈｉｓ蛋白标签后总蛋白大小
一致。 对制备的抗血清进行Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ分析，发现
兔抗 ＣＰ抗血清与 ＣＧＭＭＶ 侵染的瓠瓜叶片总蛋白
在 １７􀆰 ４ ｋＤ处有特异性显色反应，而与健康的瓠瓜
叶片总蛋白反应则检测不到该特异性条带；与诱导
表达菌的 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 凝胶 ２２􀆰 ７ ｋＤ 条带处有反应，
与其它条带均无反应（图 ３⁃Ｂ）。 表明制备的抗血清
能与 ＣＧＭＭＶ的 ＣＰ起特异性反应。
２􀆰 ４ ＣＧＭＭＶ ＣＰ抗血清的 Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ检测
浙江省 ５６ 份瓠瓜病毒病害疑似病样的 Ｄｏｔ⁃
ＥＬＩＳＡ检测结果表明（表 ３），５４ 个样品与 ＣＧＭＭＶ
抗血清均有强烈反应，检出率高达 ９６􀆰 ４３％ 。 表皮
呈现褪绿凹陷或凹凸不平的 １２ 份瓠瓜果实样品检
３３５４ 期 肖彩利等： 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查
图 ３ ＣＧＭＭＶ ＣＰ基因的原核表达（Ａ）与Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ检测（Ｂ）
Ｆｉｇ． ３ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＧＭＭＶ ＣＰ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （Ａ） ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （Ｂ）
Ａ： ＣＧＭＭＶ ＣＰ基因的原核表达； Ｍ： 蛋白质分子量标准； １： 经 ＩＰＴＧ诱导的含 ｐＥＴ⁃２８ａ载体的 ＢＬ２１（ＤＥ３）菌裂解物；
２ ～ ３： 分别为未经 ＩＰＴＧ诱导、经 ＩＰＴＧ诱导的含 ｐＥＴ⁃ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰ载体的 ＢＬ２１（ＤＥ３）菌裂解物； ４ ～ ５： 分别为含 ｐＥＴ⁃ＣＧＭ⁃
ＭＶ⁃ＣＰ载体的 ＢＬ２１（ＤＥ３）菌裂解液沉淀、上清； ６： 纯化的 ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰ 蛋白。 Ｂ： Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ 检测； Ｍ： 蛋白质分子量标
准； １： ＣＧＭＭＶ 侵染的瓠瓜叶片总蛋白； ２： 健康瓠瓜叶片总蛋白； ３： 经 ＩＰＴＧ 诱导的转化有 ｐＥＴ⁃ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰ 的 ＢＬ２１
（ＤＥ３）菌裂解物。 Ａ： ＣＧＭＭＶ ＣＰ ｇｅｎｅ； Ｍ： ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ； １： ｐＥＴ⁃２８ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＢＬ２１（ＤＥ３） ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ， ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ； ２ － ３： ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐＥＴ⁃ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＢＬ２１（ＤＥ３） ｎｏｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ４ － ５： ｐｒｅｃｉｐ⁃
ｉｔａｔｅ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｐＥＴ⁃ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＢＬ２１（ＤＥ３） ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ６： ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰ ｐｒｏ⁃
ｔｅｉｎ． Ｂ： Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ； Ｍ： ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ； １： ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ＣＧＭＭＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｌａｇｅｎａｒｉａ ｓｉｃｅｒａｒｉａ ｌｅａｖｅｓ； ２：
ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｈｅａｔｈｙ Ｌａｇｅｎａｒｉａ ｓｉｃｅｒａｒｉａ ｌｅａｖｅｓ； ３： ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐＥＴ⁃ＣＧＭＭＶ⁃ＣＰ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ
ＩＰＴＧ．
　
测中发现 １０ 份样品均被 ＣＧＭＭＶ侵染，检出率高达
８３􀆰 ３３％ 。 ２６ 份瓠瓜种子进行 Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ 检测发现
带毒率高达 ８４􀆰 ６２％ 。 此外对慈溪西瓜、甜瓜上的
病毒进行检测，均发现 ＣＧＭＭＶ具有较高的发生率。
上海市 ７ 区 １ 县则仅在少量黄瓜和瓠瓜样品上检测
到 ＣＧＭＭＶ，发生率为 ６􀆰 ７３％ 。 ＣＧＭＭＶ在上海地区
崇明县、松江区、嘉定区、浦东新区均有发生。 应用
该抗血清对感染 ＣＧＭＭＶ的瓠瓜不同组织进行 Ｄｏｔ⁃
ＥＬＩＳＡ检测，结果表明在根、茎、叶、花、种子中都能
观察到强烈的显色反应（图 ４）。
表 ３ 浙沪地区葫芦科作物上发生的 ＣＧＭＭＶ疑似样品检测
Ｔａｂｌｅ ３ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＧＭＭＶ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｏｎ ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｃｒｏｐｓ ｉｎ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｎｇｈａｉ
地区
Ｒｅｇｉｏｎ
作物
Ｃｒｏｐ
检测数量
Ａｍｏｕｎｔ
Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ检测
Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ＲＴ⁃ＰＣＲ检测
ＲＴ⁃ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
浙江嘉善 Ｊｉａｓｈａｎ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ 瓠瓜 Ｌａｇｅｎａｒｉａ ｓｉｃｅｒａｒｉａ １３ １３ １３
浙江海宁 Ｈａｉｎｉｎｇ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ 瓠瓜 Ｌ． ｓｉｃｅｒａｒｉａ ３２ ３０ ３０
　 种子 Ｓｅｅｄ ２６ ２２ ２２
　 果实 Ｆｒｕｉｔ １２ １０ １０
浙江绍兴 Ｓｈａｏｘｉｎｇ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ 瓠瓜 Ｌ． ｓｉｃｅｒａｒｉａ ８ ８ ８
浙江临安 Ｌｉｎ’ａｎ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ 瓠瓜 Ｌ． ｓｉｃｅｒａｒｉａ ３ ３ ３
浙江慈溪 Ｃｉｘｉ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ 西瓜 Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ ７ ５ ５
甜瓜 Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ ７ ６ ６
上海 Ｓｈａｎｇｈａｉ 瓠瓜 Ｌ． ｓｉｃｅｒａｒｉａ ７ １ ＮＤ
黄瓜 Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ １２５ ２８ ＮＤ
丝瓜 Ｌｕｆｆａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ ４６ ０ ＮＤ
西葫芦 Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ １１ ０ ＮＤ
冬瓜 Ｂｅｎｉｎｃａｓａ ｈｉｓｐｉｄａ １６ ０ ＮＤ
南瓜 Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ １６８ ０ ＮＤ
菜瓜 Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ ｖａｒ． ｃｏｎｏｍｏｎ １９ ０ ＮＤ
甜瓜 Ｃ． ｍｅｌｏ ３９ ０ ＮＤ
总计 Ｔｏｔａｌ ５３９ １２６ ９７
　 　 ＮＤ： 未检测到。 ＮＤ： Ｎｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．
４３５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
图 ４ 应用 Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ检测瓠瓜不同组织中的 ＣＧＭＭＶ
Ｆｉｇ． ４ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＧＭＭＶ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｓｓｕｅ ｏｆ
ｂｏｔｔｌｅ ｇｏｕｒｄ ｂｙ Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ
１： 阳性对照； ２： 阴性对照； ３： 根； ４： 茎； ５： 叶；
６： 花； ７： 种子。 １： Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ； ２： ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；
３： ｒｏｏｔ； ４： ｓｔｅｍ； ５： ｌｅａｆ； ６： ｆｌｏｗｅｒ； ７： ｓｅｅｄ．
　
３ 讨论
近年来，ＣＧＭＭＶ在我国各地均有发生，目前较
为普遍的看法是认为该病毒病在我国的发生主要由
来自日本、韩国等疫区引进的带病毒种子引起，同时
也会经嫁接的带病砧木传播扩散（种焱，１９９３；陈红
运等，２００９）。 本研究从浙江 ３ 种不同葫芦科作物上
分离的 ＣＧＭＭＶ经测序比较，发现其核苷酸全序列
差异很小，这种高度保守性表明这些 ＣＧＭＭＶ 分离
物可能具有共同的侵染来源。 鉴于 ＣＧＭＭＶ可以通
过种子传播、又可在苗期感染植物，因而这 ３ 种葫芦
科作物上的病害是由种子本身带毒引起还是在苗期
感染所致仍需要进一步取证研究。
李艳敏等（２０１３）对浙江省 ２０１２—２０１３ 年送检
的疑似带毒西瓜、甜瓜、葫芦、南瓜样品中 ＣＧＭＭＶ
的发生情况进行检测，２０１２ 年 ＣＧＭＭＶ 检出率为
４９􀆰 ８％ ，２０１３ 年 ＣＧＭＭＶ 检出率为 ３７􀆰 ８％ ，对检测
结果进一步分析表明嫁接西瓜植株发病主要由砧木
种子带毒引起，而发病田不换茬轮作，继续种植葫芦
科作物，ＣＧＭＭＶ 的发病概率将会提高。 本研究对
浙江大棚种植的瓠瓜上发生的疑似病毒侵染样品进
行检测，尽管检测到 ＣＧＭＭＶ 发生的大棚是零星分
布的，但在发病大棚的病样中可全部检出 ＣＧＭＭＶ，
暗示了 ＣＧＭＭＶ 在瓠瓜上发生的高风险性。 由于
ＣＧＭＭＶ 稳定易于传播，而瓠瓜经常作为西瓜的嫁
接砧木，因此该病害存在着巨大的扩散风险。 胡亚
萍等（２０１３）报道了上海市浦东新区孙桥蔬菜基地
温室内黄瓜上发生的 ＣＧＭＭＶ，其发病率达 ５０％以
上，但本研究检测结果表明上海地区葫芦科作物上
发生的 ＣＧＭＭＶ发病率相对较低，这可能与上海地
区的样品采集主要以露地种植的葫芦科作物为主有
关，因为相对于大棚发生的病毒病害，露地种植的葫
芦科作物病毒发病大多为局部发生且种类更多。 但
露地作物上 ＣＧＭＭＶ多点发生更易于该病毒的扩散
传播，潜在风险更大。 对浙江和上海地区发生的
ＣＧＭＭＶ检测结果表明，带毒瓠瓜、西瓜、甜瓜和黄
瓜有可能成为当前葫芦科作物生产中 ＣＧＭＭＶ进一
步扩散的重要来源。
鉴于 ＣＧＭＭＶ 在葫芦科作物上流行的风险，有
必要对我国 ＣＧＭＭＶ 发生情况加以监测：一方面尽
快普及该病毒的快速检测技术，在生产中一旦发现，
应及时拔除病株并集中焚毁深埋，对栽培设施进行
消毒处理，防止该病害的扩散蔓延。 另一方面需要
加强对葫芦科作物引种监管，在引进品种时应加强
对该病毒的检疫，对葫芦科种子生产需进行 ＣＧＭ⁃
ＭＶ灭活处理，防止该病毒扩散蔓延。 本研究制备
的抗血清能有效用于 ＣＧＭＭＶ 检测，可为进一步开
展病害检测和防治工作奠定基础，并将有助于进一
步研究该病毒与其它相关病毒的血清学关系。
致谢：浙江大学谢艳副教授提供植物病毒 Ｄｏｔ⁃ＥＬＩＳＡ 检测方
法，特此致谢！
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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ｎｏｍｉｃ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉ⁃
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５３５４ 期 肖彩利等： 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查
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（责任编辑：李美娟）
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