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The complete genomic sequence analysis of three isolates of Cucumber green mottle mosaic virus in Zhejiang and the application of prepared antiserum

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查



全 文 :植物保护学报 Journal of Plant Protection, 2016, 43(4): 529 - 536 DOI: 10􀆰 13802 / j. cnki. zwbhxb. 2016􀆰 04􀆰 001
基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(201303028,201403032),浙江省农业科学院科技创新能力提升工程项目
∗通讯作者(Authors for correspondence), E⁃mail: jpchen2001@ 126. com, yanfei@ yeah. net
收稿日期: 2014 - 12 - 17
黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析
及病害的田间调查
肖彩利1,2   郑红英2   吴晓花3   李国景3   燕  飞2∗  陈剑平2∗
(1.浙江师范大学化学与生命科学学院, 金华 321004; 2.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,
杭州 310021; 3.浙江省农业科学院蔬菜研究所, 杭州 310021)
摘要: 为明确近年来在浙江省葫芦科作物上发生的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle
mosaic virus,CGMMV)基因组特征及其发生分布情况,从浙江省及上海地区的甜瓜、西瓜和瓠瓜上
采集疑似样品进行 RT⁃PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得基因组全序列并进行系统进
化分析,利用特异性引物扩增获得 CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,制备 CGMMV CP
抗血清进行 Western⁃blot和 Dot⁃ELISA检测。 结果显示,来自甜瓜、西瓜和瓠瓜的 3 个 CGMMV 分
离物基因组全序列均具有烟草花叶病毒属典型基因组结构特征,全部由 6 423 nt 构成;3 个全序列
间的核苷酸同源性高达 99􀆰 11% ~ 99􀆰 67% ,编码的 CP 氨基酸同源性为 100% 。 系统进化分析发
现,CGMMV不同分离物形成 2 个进化相关群体,3 个浙江的 CGMMV 分离物均位于第 I 组内,与已
报道的中国 CGMMV分离物和韩国 CGMMV 分离物亲缘性较高。 Western⁃blot 检测表明 CGMMV
CP抗血清可以与感病植株中的病毒发生特异性反应,可用于 CGMMV 鉴定;Dot⁃ELISA 检测发现
CGMMV在浙江省和上海市的葫芦科作物上普遍存在。
关键词: 黄瓜绿斑驳花叶病毒; 全序列; 系统进化分析; 原核表达; 抗血清制备
The complete genomic sequence analysis of three isolates of Cucumber green
mottle mosaic virus in Zhejiang and the application of prepared antiserum
Xiao Caili1,2   Zheng Hongying2   Wu Xiaohua3   Li Guojing3   Yan Fei2∗   Chen Jianping2∗
(1. College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, Zhejiang Province, China;
2. Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021,
Zhejiang Province, China; 3. Institute of Vegetable, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,
Hangzhou 310021, Zhejiang Province, China)
Abstract: To understand the molecular character of Cucumber green mottle mosaic virus ( CGMMV)
occurred in Zhejiang Province, three CGMMV infected samples showing mottle, mosaic and distort
symptoms on leaf were collected from melon, watermelon and bottle gourd for analysis. The complete
genomic RNA sequences of the three CGMMV isolates were determined by assembling two fragments
amplified from these samples by RT⁃PCR which overlapped the whole CGMMV genome. For surveying the
occurrence and distribution of CGMMV in Zhejiang and Shanghai, the coat protein of CGMMV expressed
with E. coli was purified and used for preparation of antiserum against the virus. Results revealed that
each of three CGMMV isolates was consisted of 6 423 nucleotides with typical character of the genome of
genus Tobamovirus. Multiple sequence alignments of genomes of these isolates showed that identities of
the nucleotide sequences were 99􀆰 11% - 99􀆰 67% , while the coat protein amino acid sequences were
identical. Phylogenetic tree generated from CGMMV complete nucleotide sequences available suggested
that CGMMV could be separated into two subgroups. The three Zhejiang isolates determined in this work
belonged to subgroup I, and the genetic relationship of these Zhejiang isolates was close to that of the
Korean CGMMV isolates. Western⁃blot result suggested that the antiserum could specifically react with
the CGMMV infected plants. By using the specific antiserum to investigate the CGMMV on the cucurbit
plants in fields, it was found that CGMMV infection on cucurbit crops was common in fields in Zhejiang
Province and Shanghai City.
Key words: Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV); complete sequence; phylogenetic analysis;
prokaryotic expression; antiserum preparation
    黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumber green mottle
mosaic virus,CGMMV)是严重危害葫芦科作物生产
的重要种传病毒之一,目前在多个国家和地区分布
危害(Ugaki et al. ,1991;Polischuk et al. ,2007)。 自
1990 年开始,该病毒在我国口岸不断被截获(陈京
和李明福,2007;文朝慧等,2009),目前在我国辽宁
(陈红运等,2006)、广西(秦碧霞等,2008)、广东(李
小妮等,2009)、北京(田永蕾等,2009)、湖北(汤少
云等,2011)等地均有发生。 在浙江省,该病害自
2011 年开始在慈溪、温岭、建德、金华、台州、三门、
余姚等地陆续暴发,对大田瓜类作物生产造成严重
危害,导致巨大的经济损失(林燚等,2012)。
鉴于 CGMMV一旦侵染将对作物生产造成巨大
的经济损失,我国农业部于 2006 年将 CGMMV确定
为全国农业植物检疫性有害生物。 为避免该病毒的
大面积危害和扩散,CGMMV 的鉴定显得尤为重要。
目前已建立了一系列快速、准确、高灵敏度的检疫检
测方法,如 TaqMan 荧光定量 PCR ( Chen et al. ,
2008)、免疫斑点法(尚海丽等,2010)和免疫捕获
RT⁃PCR(尚海丽等,2011)等。 基于特异性抗体的
免疫学检测方法适用于大批量样品的快速检测,广
泛应用于病毒病害田间样品的检测;而基于分子生
物学的检测方法对于 CGMMV 的鉴定更加灵敏准
确,并且可通过序列分析提供更多的病毒基因变异
信息,对于了解 CGMMV 的扩散来源及其传播途径
具有重要意义。 目前我国辽宁、北京、山东等地发生
的 CGMMV分离物全序列已有报道,序列分析的结
果表明 CGMMV分离物之间的差异并不明显,推测
可能具有共同的侵染来源(田永蕾等,2009)。
本实验室在前期工作中,从浙江省慈溪市、嘉善
县等地发现了表现斑驳、花叶或畸形的甜瓜、西瓜和
瓠瓜样品,通过电子显微镜观察和 RT⁃PCR 方法明
确 3 个样品均感染 CGMMV。 但目前尚不清楚这些
CGMMV分离物的全序列。 因此,本研究在前期工
作的基础上进一步对 3 种不同寄主上的 CGMMV基
因组全序列进行测定,并与国内外报道的 CGMMV
全序列进行同源性比较,以期明确浙江省内不同地
区、不同寄主上发生的 CGMMV 的来源及分子变异
情况。 鉴于 CGMMV的发生和流行具有暴发性和随
机性,为了解该病毒在浙江省及上海地区的发生分
布情况,应用原核表达制备的 CGMMV CP抗血清检
测该地区葫芦科作物上 CGMMV 的发生情况,以期
为控制病害发生、预防病毒扩散提供指导依据。
1 材料与方法
1􀆰 1 材料
供试植物样品:表现皱缩、斑驳、花叶或畸形并
已鉴定感染 CGMMV 的瓠瓜叶片和果实样品于
2013 年 4 月采自浙江省嘉善县,甜瓜、西瓜病叶样
品于 2013 年 4 月采自浙江省慈溪市。 共收集葫芦
科疑似感病样品 539 份,其中 2012—2014 年采集自
浙江省嘉善、海宁、绍兴、临安、慈溪等地表现病毒病
症状的瓠瓜、西瓜、黄瓜、甜瓜等大棚栽培或露天栽
培的葫芦科作物样品共 108 份;2013 年 7 月—11 月
采集自上海市奉贤区、松江区、宝山区、嘉定区、浦东
新区、金山区、青浦区和崇明县露天栽培的葫芦科作
物样本共 431 份。 所有样品均保存于 - 70℃超低温
冰箱。
培养基:LB(Luria⁃Bertani)培养基:酵母提取物
5 g、胰化蛋白胨 10 g、氯化钠 10 g,用 NaOH 调 pH
至 7􀆰 0,121℃高压灭菌 20 min。
试剂:TRizol RNA 抽提试剂盒,美国 Life Tech⁃
nologies公司;QIAquick Gel Extraction 试剂盒,德国
QIAGEN公司;NTA His·Bind 树脂及相关蛋白纯化
试剂,德国 MERCK 公司;Ex Taq DNA 聚合酶,日本
TaKaRa公司;M⁃MLV 逆转录酶、KOD FX Neo 聚合
035 植  物  保  护  学  报 43 卷
酶和 T4 DNA连接酶,日本 ToYoBo 公司;碱性磷酸
酶标羊抗兔 IgG、5⁃溴⁃4⁃氯 3⁃吲哚磷酸和氮蓝四唑,
美国 Sigma 公司;pEasy⁃Blunt Zero 载体、大肠杆菌
BL21(DE3)表达菌株,北京全式金生物技术有限公
司;硝酸纤维素膜 RPN303C,美国通用电气医疗集
团;SUPERSWITCHTM RACE cDNA Synthesis Kit,杭
州索莱尔博奥生物技术有限公司;其余试剂均为国
产分析纯;pET⁃28a 原核表达载体由浙江省农业科
学院植物病毒学实验室保存。
仪器:GIBCO BRL Model 250 电泳仪,美国 Life
Technologies 公司;Biospectrum® AC Imaging System
凝胶成像系统,美国 UVP公司;EDC⁃810 PCR仪,东
胜创新生物科技有限公司。
1􀆰 2 方法
1􀆰 2􀆰 1 总 RNA提取和 cDNA合成
取表现症状的甜瓜、西瓜、瓠瓜叶片各 0􀆰 1 g,按
照 TRizol 试剂盒说明书提取植物总 RNA,以M4⁃T
5′⁃GTTTTCCCAGTCACGAC ( T) 15⁃3′为起始引物
(Chen et al. ,2001),用 M⁃MLV 逆转录酶参照说明
书合成病毒 RNA第一链 cDNA。
1􀆰 2􀆰 2 CGMMV 5′和 3′端序列及全序列扩增
根据 GenBank上发表的 CGMMV基因组全序列
(登录号 NC_001801)设计引物(表 1)。 以 3AP /
CGMMVCP( + )为引物进行扩增获得完整 3′端序
列,5′端序列的获得首先以 5AP / CGMMV1218( - )
为引物进行第 1 轮扩增(3AP 和 5AP 为试剂盒特异
性引物),然后以该 PCR 扩增产物为模板,以 5AP /
CGMMV682( - )为引物作巢式 PCR 进行第 2 轮扩
增,获得完整的 5′端序列。 以引物对 CGMMVCOM
( + ) / CGMMV3526( - )和 CGMMV2251( + ) / CGM⁃
MVCOM( - )分 2 段扩增 CGMMV序列,测序结果拼
接获得 CGMMV全序列。 50 μL 的 PCR 扩增体系:
无 RNA 酶灭菌去离子水 9 μL、2 × PCR Buffer for
KOD FX Neo 25 μL、 2 mmol / L dNTPs 10 μL、10
μmol / L 上下游引物各 1􀆰 5 μL、cDNA 模板 2 μL、
KOD FX Neo 聚合酶 1 μL。 反应条件:94℃ 2 min;
94℃ 15 s,60℃ 30 s,68℃ 1 ~6 min(1 kb / min,根据
不同长短模板调节),35 个循环;68℃ 10 min。
表 1 用于 CGMMV cDNA的 5′和 3′端的快速扩增、全序列扩增及原核表达的引物序列及其在基因组上的位置
Table 1 Primers for 5′⁃RACE and 3′⁃RACE of CGMMV and the construct of prokaryotic expression
引物名称
Primer
引物序列 (5′⁃3′)
Primer sequence (5′⁃3′)
位置     
Position (nt)      
CGMMV682( - ) CCGATCGAAGAATAAGGGATATC 682 ~ 704
CGMMV1218( - ) GCTAATGTGATTAATAATGGTATGG 1 218 ~ 1 242
CGMMVCP( + ) ATGGCTTACAATCCGATCAC 5 763 ~ 5 782
CGMMVCOM( + ) GTTTTAATTTTTATAATTAAACMAACAAC   1 ~ 19
CGMMV3526( - ) ACAGGGAGGAAAATATTACG 3 526 ~ 3 545
CGMMV22519( + ) GGGACCATTCGAGAGAGG 2 251 ~ 2 268
CGMMVCOM( - ) TGGGCCCCTACCCGGGG 6 408 ~ 6 424
CGMMV⁃CPe( + ) GGGATCCATGGCTTACAATCCGATCAC     —
CGMMV⁃CPe( - ) GGTCGACCTAAGCTTTCGAGGTGGTAG     —
    下划线表示 BamH I酶切位点(GGATCC)和 Sal I酶切位点(GTCGAC)。 BamH I(GGATCC) and Sal I(GTCGAC) site were
underlined.
1􀆰 2􀆰 3 CGMMV全序列克隆、测序和分析
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离,切下预
期大小条带,用 QIAquick 胶纯化试剂盒回收,纯化
产物直接插入 pEasy⁃Blunt Zero载体,由铂尚生物技
术(上海)有限公司进行测序并拼接获得全序列。
采用 DNAMAN软件将获得的序列与 GenBank 中已
提交的相似 CGMMV序列进行比较分析,采用 Clust⁃
al W软件对所有已登录的 CGMMV 全序列进行多
重序列比对,采用 MEGA 6􀆰 0 软件构建包含所有相
关 CGMMV全序列的系统进化树。
1􀆰 2􀆰 4 原核表达载体的构建及诱导表达
根据测定的 CGMMV分离物序列设计表达引物
CGMMV⁃CPe( + )和 CGMMV⁃CPe( - )(表 1),引物
CGMMV⁃CPe( + )和 CGMMV⁃CPe( - )的 5′端分别
引入 BamH I和 Sal I识别位点序列。 以感病瓠瓜合
成的第一链 cDNA 为模板,PCR 扩增全长 CP 基因,
预期大小的扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离后
用 QIAquick Gel Extraction 试剂盒回收。 纯化产物
用 BamH I和 Sal I双酶切后插入到同样双酶切的原
核表达载体 pET⁃28a中,在大肠杆菌 BL21(DE3)菌
1354 期 肖彩利等: 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查
株中用 IPTG诱导表达目的基因,SDS⁃PAGE 分离后
用考马斯亮蓝 R⁃250 染色检测蛋白表达情况(孟媛
等,2013)。
1􀆰 2􀆰 5 抗血清制备及 Western blot分析检测
选取正确表达外源基因的大肠杆菌,在 500 mL
LB培养基中大量诱导表达包含 pET⁃CGMMV⁃CP 质
粒的 BL21 ( DE3)菌株,收集菌体。 经 BugBuster
Master Mix裂解后检测蛋白主要以包涵体形式存
在。 经超声波裂解后提取高纯度包涵体,在变性条
件下将蛋白溶液与 Ni⁃NTA His·Bind 树脂结合,过
His亲和柱分离提纯 CGMMV 的 CP 蛋白。 提纯目
的蛋白由杭州华安生物技术有限公司分 4 次免疫新
西兰大白兔制备抗血清,最后 1 次免疫后 1 周采血。
Western blot检测抗血清特异性,一抗为原核表达制
备的抗血清,二抗为羊抗兔 IgG(碱性磷酸酶共价结
合),5⁃溴⁃4⁃氯 3⁃吲哚磷酸 /氮蓝四唑显色并拍照记
录结果(萨姆布鲁克等,1996)。
1􀆰 2􀆰 6 疑似样品的 Dot⁃ELISA法检测
对采集的 539 份浙江和上海大棚栽培或露天栽
培的葫芦科作物样品取叶片汁液进行 Dot⁃ELISA检
测。 植物叶片称重后,按重量体积比 1 ∶ 10 ~ 1 ∶ 50
加入 0􀆰 01 mol / L PBS研磨,8 000 r / min离心 3 min,
取 2 μL上清液点至硝酸纤维素膜上进行检测。 检
测所用一抗为原核表达制备的抗血清,二抗为羊抗
兔 IgG(碱性磷酸酶共价结合),5⁃溴⁃4⁃氯 3⁃吲哚磷
酸 /氮蓝四唑显色后观察拍照,根据显色情况检测植
株是否感染 CGMMV,并分析病毒的分布情况。
2 结果与分析
2􀆰 1 CGMMV分离物基因组结构分析
从浙江省甜瓜、西瓜和瓠瓜上扩增到的 CGM⁃
MV分离物分别命名为 CGMMV⁃TG、CGMMV⁃XG 和
CGMMV⁃HG。 序列分析表明,这 3 个分离物的基因
组全序列均由 6 423 个核苷酸构成(不包含 poly(A)
尾),基因组都具有相同长度的 5′端非编码区、3′端
非编码区和 4 个开放阅读框(图 1)。 靠近 5′端的
129 kD 和 186 kD 蛋白与病毒复制相关,其中 186
kD蛋白是由 129 kD 蛋白终止子通读产生的,另外
还包括由 264 个氨基酸组成的分子量为 29 kD的运
动蛋白(movement protein,MP)和由 161 个氨基酸组
成的分子量为 17􀆰 4 kD 的外壳蛋白( coat protein,
CP)。 在 RNA 依赖 RNA 聚合酶 ( RNA⁃dependent
RNA polymerase,RdRP)与 MP 及 MP 与 CP 编码区
均存在基因重叠(图 1)。
图 1 CGMMV浙江分离物基因组的结构示意图
Fig. 1 Genome organization of CGMMV Zhejiang isolates
 
2􀆰 2 全序列同源性及系统进化树分析
这 3 个 CGMMV分离物三者之间的核苷酸全序
列同源性高达 99􀆰 67% ;3 个 CGMMV分离物两两之
间 CGMMV⁃TG 与 CGMMV⁃HG 序 列 同 源 性 为
99􀆰 39% ,CGMMV⁃TG与 CGMMV⁃XG 序列同源性为
99􀆰 50% ,CGMMV⁃XG与 CGMMV⁃HG序列同源性为
99􀆰 11% 。 这 3 个分离物之间的非编码区或各编码
区核苷酸与氨基酸同源性比对结果显示,CGMMV⁃
TG、CGMMV⁃HG 与 CGMMV⁃XG 的非编码区仅在
5′⁃UTR存在 1 个核苷酸差异,其 3′⁃UTR 序列完全
一致;在蛋白编码区,三者的 MP 和 CP 的氨基酸之
间同源性均为 100% ,仅在复制酶区域存在较小的
差异(表 2)。
    将分离的 CGMMV 分离物与已报道的其它
CGMMV全基因序列进行同源性分析表明,CGMMV
各分离物之间的同源性在 89􀆰 49% ~ 100􀆰 00% 之
间。 系统进化树显示,CGMMV 分离物可归为 2 个
进化相关群体(图 2)。 I 组主要包括来自中国、日
本、韩国、印度、美国以及以色列的 23 个分离物,同
源性为 89􀆰 63% ~100􀆰 00% ;3 个浙江 CGMMV 分离
物均位于第 I组内,且这 3 个分离物与已报道的中
国 CGMMV分离物及韩国 CGMMV分离物全序列亲
缘性较高。 II组包括来自以色列、西班牙、俄罗斯的
5 个欧洲分离物,同源性为 92􀆰 96% ~99􀆰 91% 。 I组
与 II组的同源性为 89􀆰 49% ~ 95􀆰 25% ,且 I 组和 II
组间不同 CGMMV分离物的基因组变异存在一定的
地域相关性。 但在组 I内也有部分欧洲和北美洲的
CGMMV分离物与亚洲分离物形成一簇。 而以色列
CGMMV分离物在 2 个组中均有分布。 进化分析没
有发现这些分离物间存在明显的寄主分化性。
235 植  物  保  护  学  报 43 卷
表 2 三个浙江 CGMMV分离物序列的同源性比较
Table 2 Identity analysis of the three Zhejiang CGMMV isolates %
分离物
Isolate
5′⁃非编
码区
5′⁃UTR
129 kD复制酶
129 kD protein
186 kD复制酶
186 kD protein
运动蛋白
Movement
protein
外壳蛋白
Coat protein
3′⁃非编
码区
3′⁃UTR
全序列
Complete
sequence
CGMMV⁃TG ∶
CGMMV⁃XG
98􀆰 33 99􀆰 62(99􀆰 83) 99􀆰 45(99􀆰 70) 99􀆰 75(100􀆰 00) 99􀆰 38(100􀆰 00) 100􀆰 00 99􀆰 50
CGMMV⁃TG ∶
CGMMV⁃HG
100􀆰 00 98􀆰 98(99􀆰 39) 99􀆰 23(99􀆰 45) 100􀆰 00(100􀆰 00) 100􀆰 00(100􀆰 00) 100􀆰 00 99􀆰 39
CGMMV⁃HG ∶
CGMMV⁃XG
98􀆰 33 98􀆰 84(99􀆰 39) 99􀆰 87(99􀆰 51) 99􀆰 75(100􀆰 00) 99􀆰 38(100􀆰 00) 100􀆰 00 99􀆰 11
    括号外为核苷酸同源性百分比,括号内为氨基酸同源性百分比。 The numbers out of the brackets represent the nucleotide
identities, while those in brackets represent the amino acid identities.
图 2 基于 CGMMV基因组核苷酸全序列同源性构建的浙江分离物及其相关分离物的系统进化树
Fig. 2 Phylogenetic analysis of the complete nucleotide sequences of all CGMMV isolates
下划线标示的为 3 个浙江 CGMMV分离物。 The three CGMMV Zhejiang isolates are underlined.
 
2􀆰 3 CGMMV CP基因的原核表达和Western⁃blot检测
从表现花叶症状的瓠瓜病样中扩增全长 CP 基
因,大小为 483 bp。 对 CP 基因进行原核表达蛋白
检测,诱导产生大小约为 22􀆰 7 kD 的特异性表达条
带(图 3⁃A),这与通过氨基酸序列预测的 CGMMV
CP蛋白(17􀆰 4 kD)融合 His蛋白标签后总蛋白大小
一致。 对制备的抗血清进行Western⁃blot分析,发现
兔抗 CP抗血清与 CGMMV 侵染的瓠瓜叶片总蛋白
在 17􀆰 4 kD处有特异性显色反应,而与健康的瓠瓜
叶片总蛋白反应则检测不到该特异性条带;与诱导
表达菌的 SDS⁃PAGE 凝胶 22􀆰 7 kD 条带处有反应,
与其它条带均无反应(图 3⁃B)。 表明制备的抗血清
能与 CGMMV的 CP起特异性反应。
2􀆰 4 CGMMV CP抗血清的 Dot⁃ELISA检测
浙江省 56 份瓠瓜病毒病害疑似病样的 Dot⁃
ELISA检测结果表明(表 3),54 个样品与 CGMMV
抗血清均有强烈反应,检出率高达 96􀆰 43% 。 表皮
呈现褪绿凹陷或凹凸不平的 12 份瓠瓜果实样品检
3354 期 肖彩利等: 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查
图 3 CGMMV CP基因的原核表达(A)与Western⁃blot检测(B)
Fig. 3 Prokaryotic expression of CGMMV CP gene in Escherichia coli (A) and western⁃blot detection (B)
A: CGMMV CP基因的原核表达; M: 蛋白质分子量标准; 1: 经 IPTG诱导的含 pET⁃28a载体的 BL21(DE3)菌裂解物;
2 ~ 3: 分别为未经 IPTG诱导、经 IPTG诱导的含 pET⁃CGMMV⁃CP载体的 BL21(DE3)菌裂解物; 4 ~ 5: 分别为含 pET⁃CGM⁃
MV⁃CP载体的 BL21(DE3)菌裂解液沉淀、上清; 6: 纯化的 CGMMV⁃CP 蛋白。 B: Western⁃blot 检测; M: 蛋白质分子量标
准; 1: CGMMV 侵染的瓠瓜叶片总蛋白; 2: 健康瓠瓜叶片总蛋白; 3: 经 IPTG 诱导的转化有 pET⁃CGMMV⁃CP 的 BL21
(DE3)菌裂解物。 A: CGMMV CP gene; M: protein markers; 1: pET⁃28a transformed BL21(DE3) induced with IPTG, negative
control; 2 - 3: lysis of pET⁃CGMMV⁃CP transformed BL21(DE3) not induced and induced with IPTG, respectively; 4 - 5: precip⁃
itate and supernatant of pET⁃CGMMV⁃CP transformed BL21(DE3) induced with IPTG, respectively; 6: purified CGMMV⁃CP pro⁃
tein. B: Western⁃blot detection; M: protein markers; 1: total protein extracts of CGMMV infected Lagenaria siceraria leaves; 2:
total protein extracts of heathy Lagenaria siceraria leaves; 3: lysis of pET⁃CGMMV⁃CP transformed BL21 (DE3) induced with
IPTG.
 
测中发现 10 份样品均被 CGMMV侵染,检出率高达
83􀆰 33% 。 26 份瓠瓜种子进行 Dot⁃ELISA 检测发现
带毒率高达 84􀆰 62% 。 此外对慈溪西瓜、甜瓜上的
病毒进行检测,均发现 CGMMV具有较高的发生率。
上海市 7 区 1 县则仅在少量黄瓜和瓠瓜样品上检测
到 CGMMV,发生率为 6􀆰 73% 。 CGMMV在上海地区
崇明县、松江区、嘉定区、浦东新区均有发生。 应用
该抗血清对感染 CGMMV的瓠瓜不同组织进行 Dot⁃
ELISA检测,结果表明在根、茎、叶、花、种子中都能
观察到强烈的显色反应(图 4)。
表 3 浙沪地区葫芦科作物上发生的 CGMMV疑似样品检测
Table 3 Detection of CGMMV occurred on cucurbit crops in Zhejiang and Shanghai
地区
Region
作物
Crop
检测数量
Amount
Dot⁃ELISA检测
Dot⁃ELISA detection
RT⁃PCR检测
RT⁃PCR detection
浙江嘉善 Jiashan, Zhejiang 瓠瓜 Lagenaria siceraria 13 13 13
浙江海宁 Haining, Zhejiang 瓠瓜 L. siceraria 32 30 30
  种子 Seed 26 22 22
  果实 Fruit 12 10 10
浙江绍兴 Shaoxing, Zhejiang 瓠瓜 L. siceraria 8 8 8
浙江临安 Lin’an, Zhejiang 瓠瓜 L. siceraria 3 3 3
浙江慈溪 Cixi, Zhejiang 西瓜 Citrullus lanatus 7 5 5
甜瓜 Cucumis melo 7 6 6
上海 Shanghai 瓠瓜 L. siceraria 7 1 ND
黄瓜 Cucumis sativus 125 28 ND
丝瓜 Luffa cylindrica 46 0 ND
西葫芦 Cucurbita pepo 11 0 ND
冬瓜 Benincasa hispida 16 0 ND
南瓜 Cucurbita moschata 168 0 ND
菜瓜 Cucumis melo var. conomon 19 0 ND
甜瓜 C. melo 39 0 ND
总计 Total 539 126 97
    ND: 未检测到。 ND: No detected.
435 植  物  保  护  学  报 43 卷
图 4 应用 Dot⁃ELISA检测瓠瓜不同组织中的 CGMMV
Fig. 4 Detection of CGMMV in different issue of
bottle gourd by Dot⁃ELISA
1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: 根; 4: 茎; 5: 叶;
6: 花; 7: 种子。 1: Positive control; 2: negative control;
3: root; 4: stem; 5: leaf; 6: flower; 7: seed.
 
3 讨论
近年来,CGMMV在我国各地均有发生,目前较
为普遍的看法是认为该病毒病在我国的发生主要由
来自日本、韩国等疫区引进的带病毒种子引起,同时
也会经嫁接的带病砧木传播扩散(种焱,1993;陈红
运等,2009)。 本研究从浙江 3 种不同葫芦科作物上
分离的 CGMMV经测序比较,发现其核苷酸全序列
差异很小,这种高度保守性表明这些 CGMMV 分离
物可能具有共同的侵染来源。 鉴于 CGMMV可以通
过种子传播、又可在苗期感染植物,因而这 3 种葫芦
科作物上的病害是由种子本身带毒引起还是在苗期
感染所致仍需要进一步取证研究。
李艳敏等(2013)对浙江省 2012—2013 年送检
的疑似带毒西瓜、甜瓜、葫芦、南瓜样品中 CGMMV
的发生情况进行检测,2012 年 CGMMV 检出率为
49􀆰 8% ,2013 年 CGMMV 检出率为 37􀆰 8% ,对检测
结果进一步分析表明嫁接西瓜植株发病主要由砧木
种子带毒引起,而发病田不换茬轮作,继续种植葫芦
科作物,CGMMV 的发病概率将会提高。 本研究对
浙江大棚种植的瓠瓜上发生的疑似病毒侵染样品进
行检测,尽管检测到 CGMMV 发生的大棚是零星分
布的,但在发病大棚的病样中可全部检出 CGMMV,
暗示了 CGMMV 在瓠瓜上发生的高风险性。 由于
CGMMV 稳定易于传播,而瓠瓜经常作为西瓜的嫁
接砧木,因此该病害存在着巨大的扩散风险。 胡亚
萍等(2013)报道了上海市浦东新区孙桥蔬菜基地
温室内黄瓜上发生的 CGMMV,其发病率达 50%以
上,但本研究检测结果表明上海地区葫芦科作物上
发生的 CGMMV发病率相对较低,这可能与上海地
区的样品采集主要以露地种植的葫芦科作物为主有
关,因为相对于大棚发生的病毒病害,露地种植的葫
芦科作物病毒发病大多为局部发生且种类更多。 但
露地作物上 CGMMV多点发生更易于该病毒的扩散
传播,潜在风险更大。 对浙江和上海地区发生的
CGMMV检测结果表明,带毒瓠瓜、西瓜、甜瓜和黄
瓜有可能成为当前葫芦科作物生产中 CGMMV进一
步扩散的重要来源。
鉴于 CGMMV 在葫芦科作物上流行的风险,有
必要对我国 CGMMV 发生情况加以监测:一方面尽
快普及该病毒的快速检测技术,在生产中一旦发现,
应及时拔除病株并集中焚毁深埋,对栽培设施进行
消毒处理,防止该病害的扩散蔓延。 另一方面需要
加强对葫芦科作物引种监管,在引进品种时应加强
对该病毒的检疫,对葫芦科种子生产需进行 CGM⁃
MV灭活处理,防止该病毒扩散蔓延。 本研究制备
的抗血清能有效用于 CGMMV 检测,可为进一步开
展病害检测和防治工作奠定基础,并将有助于进一
步研究该病毒与其它相关病毒的血清学关系。
致谢:浙江大学谢艳副教授提供植物病毒 Dot⁃ELISA 检测方
法,特此致谢!
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(责任编辑:李美娟)
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