全 文 ：收稿日期:2008-05-29
基金项目:国家质检总局资助项目(2007IK255)。
作者简介:张永江(1977-),男 ,山东寿光人;助理研究员 ,研究方向:植
物检疫病毒学。
3种葫芦科作物种质资源中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测
张永江 , 　马　洁 , 　李桂芬 , 　李明福
(中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 , 　北京 100029)
摘要:为确定黄瓜绿斑驳花叶病毒在葫芦 、西瓜 、甜瓜 3种葫芦科 (Cucurbitaceae)作物种质中的携带部位 、最低检测量
及不同检测技术的检测效果 ,对 3种作物的不同种质资源以及同种种质资源的不同处理进行了 DAS-ELISA和 RT-PCR
检测 ,结果显示受侵染葫芦种子的种皮 、种仁可带毒;受侵染西瓜的瓜叶 、瓜皮 、瓜瓤 、种皮 、种仁 、瓜蔓均可带毒;受侵染
甜瓜的叶片可带毒。 RT-PCR检测灵敏度高于 ELISA。
关键词:　葫芦科;种质资源;黄瓜绿斑驳花叶病毒;检测
中图分类号:　S436.421　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2008)10-0041-03
DetectionCucumberGreenMotleMosaicVirusinThree
CucurbitaceaeCropsGermplasmSources
ZHANGYong-jiang, MAJie, LIGui-fen, LIMing-fu
(InstituteofAnimalandPlantQuarantine, CAIQBeijing100029, China)
Abstract:DetectingthreeCucurbitaceaecropsdiferentgermplasmsourcesanddiferenttreatmentsofsame
germplasmsourcesbyDAS-ELISAandRT-PCR, formakingsurethetakingpositionofCucumbergreenmottle
mosaicvirus(CGMMV), theminimumdetectionquantityanddetectionefectsofdiferenttechnique.There-
sultsdisplayedthatseedcoatandseedkernelofcucurbits, leaf, husk, flesh, seedcoat, seedkernel, andvineof
watermelon, leafofmelonwereinfectedbyCGMMV.TheRT-PCRwasmoresensitivethanDAS-ELISAinde-
tectionofcucurbitsseed.
Keywords:　Cucurbitaceae;germplasmsources;Cucumbergreenmotlemosaicvirus;detection
　　葫芦科作物如黄瓜 、葫芦 、甜瓜 、丝瓜 、苦瓜 、西瓜
等在我国有大面积种植 ,特别是一些地方的反季节蔬
菜水果等也都属于葫芦科 ,因此葫芦科作物具有很高
的经济重要性 ,甚至成为一些地方的支柱产业。但它
们在生产过程中往往受到病虫害的影响 ,造成很大的
经济损失。特别是一些植物病毒能侵染葫芦科作物种
子 ,通过种子进行传播 ,使病毒病大面积发生并最终影
响到作物的产量 、质量及商品性 。
黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumbergreenmotle
mosaicvirus, CGMMV)就是葫芦科上的重要病毒之
一 ,该病毒属于烟草花叶病毒属 (Tobamovirus), 给葫
芦科作物的生产造成严重威胁 。使黄瓜 、西瓜等叶片
上出现色斑 、水泡及变形 ,植株矮化 、结果延时 ,果实内
部严重变色或造成腐烂 ,造成较大损失。近年来 ,在我
国一些地区出现进口源性 CGMMV,引起农业部 、质检
总局等相关部门的高度重视 ,要求对相关作物的病毒
携带部位进行确定 ,并建立灵敏 、快速的检测方法。在
实际检测工作中 ,对于可能携带病毒的种子 ,往往先播
种 ,待出苗后再检测幼苗 ,这种检测程序费时费力;同
时带毒种子不一定形成病苗 ,因而采用幼苗检测法 ,有
可能漏检带毒种子。
本研究对 3种葫芦科作物的不同部位进行了
CGMMV的检测 ,确定了带毒部位;对可能携带病毒的
种子直接进行种子检测 ,建立了一种快速 、灵敏的检测
方法 ,为提高检验检疫效率打下了基础。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　供试材料
所测样品采自辽宁盖州 、河北唐山 、北京平谷。辽
宁盖州西瓜幼苗经酶联 、RT-PCR检测为阳性后 ,接种
在葫芦上 ,待其发病后采病叶冻干保存 ,作为阳性毒
源 。健康葫芦幼苗作为阴性对照。酶联检测的液体样
品为双蒸水浸泡种子后的上清液。
1.1.2　主要试剂
M-MLV酶 、RNAsin为 Promega公司产品;TaqDNA
·41·
研究报告　　张永江 等:3种葫芦科作物种质资源中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测
表 1　3种葫芦科作物不同种质及同种种质不同处理的
DAS-ELISA检测和 RT-PCR检测
作物 地区 编号 样品 DAS-ELISA RT-PCR
葫芦种子 辽宁盖州 1 1粒干燥种子的一半种皮 - +
2 1粒干燥种子的一半种仁 - +
3 5粒干燥种子的一半种皮 - +
4 5粒干燥种子的一半种仁 - -
5 2粒种子蒸馏水浸泡 3h后的种皮 + +
6 2粒种子蒸馏水浸泡 3h后的种仁 + +
7 4粒种子蒸馏水浸泡 3h后的种皮 - -
8 4粒种子蒸馏水浸泡 3h后的种仁 + +
西瓜 河北唐山 9 7号叶片症状为花叶 、褪绿斑 + +
10 1粒种子的种皮 + +
11 1粒种子的种仁 + +
12 4粒种子的种皮 + +
13 4粒种子的种仁 + +
甜瓜 北京平谷 14 3号叶片症状为花叶 - +
15 4号叶片症状为花叶 、疱斑 + +
16 11号叶片症状为花叶 + +
西瓜 辽宁盖州 17 1号瓜苗植株矮化 、叶片斑驳 + +
18 2号瓜苗植株矮化 、叶片花叶 + +
19 3号瓜苗叶片缩小 、花叶 + +
20 4号瓜苗叶片花叶 - -
21 瓜蔓无症状 + +
　　　注:“ +” 阳性反应 , “ -” 阴性反应。
酶为 Biostar公司产品;Trizol试剂购自 Gibcol;化学试
剂为国产分析纯 。
酶联检测试剂盒为美国 DSMZ产品。
1.1.3　引物设计
参照 GenBank发表的 CGMMV序列中外壳蛋白保
守区设计上游引物(CGMMVf):5′-GAAGAGTCCAGT-
TCTGTTTC-3′;下 游引物 (CGMMVr):5′-ACCCTC-
GAAACTAAGCTTTC-3′,预期扩增产物大小为 524bp。
1.2　方　法
1.2.1　血清学检测(DAS-ELISA)
操作程序[ 1] :按要求的浓度用包被缓冲液稀释包
被抗体 ,每孔加 100μl。将酶联板放在 37℃孵育 2h。
用 PBST加满各孔 ,然后倒掉 ,孔向下在滤纸上拍干 ,
再重复 2次。取 0.1g待检测组织研碎 ,加入 1ml的
抽提缓冲液 ,研磨离心取上清液即为待检样品。分别
将稀释到适当浓度的阳性对照 、阴性对照和待检样品
各 100μl加入已包被的孔中 ,为保证实验的准确性 ,每
个样品再设一个重复。 4℃下孵育过夜 。用 PBST加
满各孔 ,然后倒掉 ,孔向下在滤纸上拍干 ,再重复 2次。
用稀释缓冲液将抗体稀释到适当浓度 ,每孔加 100μl。
在 37℃下孵育 2h。用 PBST加满各孔 ,然后倒掉 ,孔
向下在滤纸上拍干 ,再重复 2次 。按 1 mg/ml的浓度
将 NPP(对硝基苯磷酸钠)溶于底物
缓冲液中(使用前配并注意避光以防
变色),制成底物溶液 。每孔加 100μl
底物溶液 。室温下孵育 30 ～ 60min。
在酶联仪 405nm波长下检查各孔的
吸收值 OD405。
结果判断:当样品 OD405 /阴性对
照 OD405≥2时 , 判定结果为阳性 。
1.2.2　分子生物学检测(RT-PCR)
(1)样品总 RNA提取:使用 Tr-
izol试剂提取总 RNA,具体操作按试
剂说明书进行。
(2)RT-PCR扩增:反应体系:0.2
mlPCR管中加入 1 μl总 RNA、1 μl
dNTP(10 mmol/L)、 10 μlDEPC水 、
2μlCGMMVr(20μmol/L), 70℃保温
5min,冰上放置 2min;再加入 4 μl5
×bufer、1μlRNAsin(40 U/μl)、 1μl
M-MLV(200U/μl)42℃保温 40min。
取上述反应产物 2μl作模板 , 2μl10
×bufer(含 Mg2 +)、0.6 μldNTP、1对
引物各 0.5μl、2U/μlTaqDNA聚合酶
1μl、DEPC水 13.4μl。
反应程序:94℃10min;94℃ 30sec, 55℃ 30sec,
72℃ 1min, 35个循环;72℃ 8min。
(3)产物检测:RT-PCR反应结束后 ,取 10μl扩增
产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测并在凝胶成像系统
上观察记录结果 。
2　结　果
2.1　血清学测定
样品经 DAS-ELISA反应后 ,在酶标仪 405 nm下
读数。共检测了 53个样品 ,阳性样品为 24个 ,河北及
辽宁的西瓜不同种质样品阳性率非常高 ,其中河北唐
山西瓜的阳性率为 100%。对葫芦种子的直接检测相
对困难 ,但也在种子的不同部位检测到了 CGMMV(见
表 1)。
2.2　分子生物学检测
以不同种质的总 RNA为模板 ,对不同处理的样品
进行了 RT-PCR检测。共检测了 21份样品 ,其中包括
12份种子样品 , 5份叶片样品 , 4份幼苗样品及 1份瓜
蔓样品(见表 1)。阳性对照 PCR产物经 1%琼脂糖凝
胶电泳后 , 出现一条约 524bp的特异性核苷酸片断 ,
与预期结果一致 ,而阴性对照无扩增产物(图 1)。
·42·
第 27卷　第 10期　2008年 10月　　　　　　 　　　　　种　子　(Seed)　　　 　　　　　　　Vol.27　No.10　Oct.　2008
(上接第 40页)
　　本研究还表明 ,侵入培养基生长的一些菌株 ,无菌
水浸泡对其分离率也产生影响 ,但分离的菌根菌的种
类无变化 ,这主要是由于细菌的污染引起的 ,可以采用
添加抗生素的方法解决。通过本研究 ,提出兰科植物
菌根菌单菌丝团分离的改进措施 。首先 ,对新生根近
根尖端的菌丝团和老根的近根尖的外皮层细胞中的菌
丝团可以直接分离 ,这些菌丝团一般为疏松菌丝团 ,活
力较高 ,产生气生菌丝的菌丝团多数处于此部位 ,这样
可以最大限度地分离出产生气生菌丝的兰科菌根菌 ,
如 Ceratorhiza属菌根菌;其次 ,对于新生根近基部的
菌丝团和老根内皮层的菌丝团 ,以不易形成气生菌丝
的菌根菌为主 ,而且多数处于消化阶段 ,死亡的菌丝团
较多 ,如果直接挑单菌丝团分离 ,就如大海捞针 ,效率
很低 ,可以采用菌丝团溶液静置诱导其萌发生长 ,然后
有针对性地挑取萌发的菌丝团进行培养 ,这样就大大
提高了分离的效率。
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图 1　不同葫芦科作物不同部位 RT-PCR产物 1%
琼脂糖凝胶电泳图
注:M:DNA标准(100bp, 250bp, 500bp, 750bp, 1 000bp, 2 000bp)。
3　讨　论
3.1　建立了直接从葫芦种子中提取 RNA的方法
本研究对干燥葫芦种子及双蒸水浸泡后的葫芦种
子的种皮 、种仁进行了 RNA提取的实验。葫芦科种子
中含有较多的多糖及次生代谢物质 ,提取总 RNA往往
比较困难。实验中 ,使用 TRIzol试剂对不同处理 、不
同数量的样品直接提取总 RNA,并进行 RT-PCR检测 ,
结果证明 ,用该方法提取的 RNA纯度及完整性均可满
足后续的分子生物学研究 。
3.2　建立了直接从葫芦种子中检测 CGMMV的技术
方法
　　目前质检系统中对送检的种子样品 ,往往先播种
种子 ,待长出幼苗后 ,再检测幼苗叶片 。此检测程序费
时费力 ,还容易受季节及温室条件的限制 。并且 ,有的
带毒种子并不一定形成带毒幼苗 ,因此出现假阴性的
几率增加。实验中直接采用种子进行种传病毒的检
测 ,其效果比较理想。 DAS-ELISA和 RT-PCR检测结
果比较表明 ,后者要比前者的灵敏度高 ,可检测到单粒
种子的一半种皮或一半种仁。本研究建立了直接从葫
芦种子中检测 CGMMV的技术方法 ,该方法的建立对
于其他种传病毒的种子检测也具有借鉴意义。
3.3　明确了葫芦科 3种不同作物的带毒部位
对干燥葫芦种子的种皮 、种仁 ,双蒸水浸泡葫芦种
子的液体样品 ,浸泡后葫芦种子的种皮 、种仁;对西瓜
的叶片 、瓜皮 、瓜瓤 、种皮 、种仁 、瓜苗 、瓜蔓;对甜瓜的
叶片 、瓜瓤 、瓜皮进行了全部的酶联检测和部分的 RT-
PCR检测(见表 1),结果显示受侵染葫芦种子的种皮 、
种仁可带毒;受侵染西瓜的瓜叶 、瓜皮 、瓜瓤 、种皮 、种
仁 、瓜蔓均可带毒;受侵染甜瓜的叶片可带毒。该结果
对采样或抽样时样品部位的选择具有指导意义 。
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研究报告　　张永江 等:3种葫芦科作物种质资源中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测