全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１５， ４２（６）： ９３５ － ９４１ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１５􀆰 ０６􀆰 ０１１
基金项目：国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０４，２０１３ＢＡＤ０７Ｂ０３），辽宁省玉米育种及配套技术创新团队项目（２０１４２０１００３）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｇａｏｚｅｎｇｇｕｉ＠ ｓｉｎａ． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１５ － ０５ － ０６
凸脐蠕孢菌玉米、高粱专化型的细胞壁降解酶活性
及基因表达分析
唐　 琳１，２ 　 高增贵１∗　 杨瑞秀１ 　 姚　 远１ 　 刘　 限１
（１．沈阳农业大学植物保护学院， 沈阳 １１０８６６； ２．洛阳师范学院生命科学学院， 洛阳 ４７１０００）
摘要： 为探明玉米专化型和高粱专化型凸脐蠕孢菌的细胞壁降解酶在致病过程中的作用，采用酶
活性检测方法测定了 ２ 种专化型的细胞壁降解酶活性，并检测了相关基因的表达。 结果表明：高粱
专化型凸脐蠕孢菌的聚甲基半乳糖醛酸酶（ＰＭＧ）活性为 １１５􀆰 ８４ Ｕ ／ ｍｇ，略高于玉米专化型；玉米专
化型的多聚半乳糖醛酸酶（ＰＧ）和纤维素酶（Ｃｘ）的活性分别为 １５１􀆰 ７６ Ｕ ／ ｍｇ和 １６８􀆰 ５３ Ｕ ／ ｍｇ，略高
于高粱专化型；且同一种专化型菌株的细胞壁降解酶活性存在差异。 ２ 种专化型的细胞壁降解酶
基因表达量存在差异，Ｃｘ基因在 ２ 种专化型互作过程中均随病程的延长而大幅度上调表达；高粱
专化型的 ＰＧ基因随病程的延长大幅度上调表达，而玉米专化型的 ＰＧ基因随病程的延长上调表达
量有所下降；高粱专化型的 ＰＭＧ基因随病程的延长大幅度上调表达，而玉米专化型的 ＰＭＧ基因随
病程的延长下调表达。 推测产酶能力、基因表达和基因时间表达的差异可能是引起凸脐蠕孢菌专
化型致病专化性的诱因之一。
关键词： 凸脐蠕孢菌； 纤维素酶； 多聚半乳糖醛酸酶； 聚甲基半乳糖醛酸酶； 基因表达
Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ
Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｚｅａｅ ａｎｄ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｓｏｒｇｈｉ
Ｔａｎｇ Ｌｉｎ１，２ 　 Ｇａｏ Ｚｅｎｇｇｕｉ１∗ 　 Ｙａｎｇ Ｒｕｉｘｉｕ１ 　 Ｙａｏ Ｙｕａｎ１ 　 Ｌｉｕ Ｘｉａｎ１
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｕｏｙａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌｕｏｙａｎｇ ４７１０００， Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ， ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ
ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ
ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｚｅａｅ ａｎｄ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｓｏｒｇｈｉ， ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ
ａｎｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ （ＰＭＧ） ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓ．
ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｓｏｒｇｈｉ ｗａｓ １１５􀆰 ８４ Ｕ ／ ｍｇ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ １１１􀆰 １６ Ｕ ／ ｍｇ ｏｆ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ．
ｚｅａｅ． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ （ＰＧ） ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ （Ｃｘ） ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｚｅａｅ ｗｅｒｅ １５１􀆰 ７６
Ｕ ／ ｍｇ ａｎｄ １６８􀆰 ５３ Ｕ ／ ｍｇ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｓｏｒｇｈｉ．
Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｆｏｒｍａｅ ｓｐｅｃｉａｌｅｓ． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ
ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ｇｅｎｅｓ． Ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｆｏｒｍａｅ ｓｐｅｃｉａｌｅｓ， ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｎｄｓ ｏｆ Ｃｘ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｔｒｅｎｄｓ ｏｆ ＰＧ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｓｏｒｇｈｉ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ， ａｎｄ
ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ＰＧ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｚｅａｅ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｄｅｃｌｉｎｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｎｄｓ ｏｆ ＰＭＧ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｓｏｒｇｈｉ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｕｐ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ， ａｎｄ ＰＭＧ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｚｅａｅ ｗａｓ ｄｏｗｎ⁃ｒｅｇｕｌａｔｅｄ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｍｉｇｈｔ ｂｅｃｏｍｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｕｓｅｓ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｅ ｓｐｅｃｉａｌｅｓ ｏｆ
Ｓ． ｔｕｒｃｉｃａ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ， ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ； ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ； ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ； ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ；
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　 　 凸脐蠕孢菌被划分为玉米专化型 Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ
ｔｕｒｃｉｃａ ｆ． ｓｐ． ｚｅａｅ 和高粱专化型 Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
ｆ． ｓｐ． ｓｏｒｇｈｉ，专化型的划分是根据其是否侵染特定
的一种或一类寄主，并产生相应的症状来确定的，即
玉米专化型只能侵染玉米，高粱专化型只侵染高粱、
约翰逊草和苏丹草（Ｈａｍｉｄ ＆ Ａｒａｇａｋｉ，１９７４；Ｃｈａｎｇ
＆ Ｆａｎ，１９８６）。 因此，凸脐蠕孢菌专化型对寄主存
在严格的侵染关系，反映了凸脐蠕孢菌专化型的致
病专化性。 目前，对凸脐蠕孢菌专化型的报道，仅仅
停留在寄主与病原菌互作的致病性研究阶段
（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｆａｎ，１９８６），尚无关于凸脐蠕孢菌专化型
致病分子机制的报道，这使得对该菌专化型及其产
生致病专化性现象的深入研究受到限制。
在病原菌侵染寄主的过程中，细胞壁降解酶发挥
着重要的作用。 细胞壁降解酶类与病原菌的致病性
有着密切关系，主要参与病原菌降解寄主细胞壁成分
和破坏细胞壁结构，植物的细胞壁主要由纤维素、果
胶等物质组成，病原菌在致病过程中可以大量分泌上
述酶类以软化解体寄主的细胞壁，达到快速侵染和扩
展病程的目的（Ｍｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ． ，１９９４；Ｗａｎｊｉｒｕ ｅｔ ａｌ． ，
２００２）。 研究病原菌产细胞壁降解酶的能力，对深入
探究病原菌对寄主的致病机理具有重大意义。
实时荧光定量逆转录聚合酶连锁反应 （ ｒｅａｌ⁃
ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ⁃ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＲＴ⁃ＰＣＲ）是一种高效、敏感和可靠的技
术，用来量化转录表达的水平。 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ 具有快
速、易于使用的特点，并且可对限定基因的不同样本
的表达进行同步测定 （ Ｂｕｓｔｉｎ， ２００２； Ｇｉｎｚｉｎｇｅｒ，
２００２）。 当前，ｑＲＴ⁃ＰＣＲ 被广泛应用于病毒（Ｍｕｍ⁃
ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． ， ２０００ ）、 细菌 （ Ｖａｎｄｅｍａｒｋ ＆ Ｂａｒｋｅｒ，
２００３）、真菌（Ｂöｈｍ ｅｔ ａｌ． ，１９９９；ＭｃＣａｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ． ，
２００３）等植物病原微生物的定量分析。 尤其是在相
关基因的时间表达分析上能够提供准确而直观的检
测结果，为后续相关基因的表达功能研究提供了理
论基础。 目前，应用 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ技术研究的病原菌致
病相关基因及基因类群主要有几丁质合成酶基因
（Ｆｏｃｈｓ Ｖ）（张硕，２０１３；杨瑞秀，２０１４）、ＭＡＰＫ 级联
反应途径相关基因（申珅，２０１３）、过氧化氢酶基因
（周建波，２００６）等。 以往的研究多针对于病原菌自
身的致病相关基因，而对互作过程中的病原菌致病
相关基因研究较少。 因此，本研究以纤维素酶（ｃｅｌ⁃
ｌｕｌａｓｅ，Ｃｘ）、多聚半乳糖醛酸酶 （ ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ，
ＰＧ）和聚甲基半乳糖醛酸酶 （ ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｇａｌａｃｔｕｒｏ⁃
ｎａｓｅ，ＰＭＧ）为切入点，着重研究凸脐蠕孢菌 ２ 种专
化型上述 ３ 种酶的活性及其基因表达，旨在为深入
探究凸脐蠕孢菌专化型的致病机理奠定理论基础。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株及植物：凸脐蠕孢菌玉米专化型菌株
ＳＹＹ１３０３、ＹＣＹ１３２４ 和 ＸＡＹ１３０２，高粱专化型菌株
ＪＰＧ１３０２、ＬＰＧ１３０４ 和 ＸＡＧ１３０３，均由沈阳农业大学
植物保护学院植物免疫所玉米病害实验室鉴定并保
存。 玉米品种黄早四由沈阳农业大学植物保护学院
植物免疫所提供，高粱品种 ＬＲ１１５ 由辽宁省农业科
学院植物保护研究所提供。
培养基：改良液体培养基：ＫＮＯ３ ２􀆰 ０ ｇ、ＫＣｌ ０􀆰 ５
ｇ、ＦｅＳＯ４ ０􀆰 ０１ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １􀆰 ０ ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５ ｇ、
果胶（用于测定果胶酶）或羧甲基纤维素钠（用于测
定纤维素酶）１０ ｇ、去离子水 １ ０００ ｍＬ。 马铃薯葡萄
糖琼脂（ ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基：马铃薯
２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、琼脂 ２０ ｇ、水 １ Ｌ。
试剂及仪器：Ｔｒｉｚｏｌ 提取试剂盒、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ
ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ 试剂盒，日本
ＴａＫａＲａ公司；２ × Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ，天根生物科技
（北京）有限公司；其它试剂均为国产分析纯。 Ｍｕｌ⁃
ｔｉｓｋａｎ ＧＯ 全波长酶标仪、Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ＮＤ １０００ 核酸
蛋白测定仪，美国 Ｔｈｅｒｍｏ 公司； ＤＹＣＰ⁃３１ＤＮ 型琼
脂糖水平电泳仪（槽），北京六一仪器厂；ＵＶＩｔｅｃ 凝
胶成像分析系统，英国 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 公司；Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ ＣＦＸ
９６ ＴｏｕｃｈＴＭ荧光定量 ＰＣＲ仪，美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 供试菌株细胞壁降解酶粗酶液的制备
参照冯晶等（２００２）和 Ｌｅｅ ＆ Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（１９７５）
６３９ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
的方法，略有改动。 将供试菌株在 ＰＤＡ 平板上培养
７ ｄ，打成直径 ５ ｍｍ的菌饼，分别在添加羧甲基纤维
素钠或果胶的培养液中，每 １５０ ｍＬ 接种 ９ 个菌饼，
每天摇床振荡 １ ｈ，１２０ ｒ ／ ｍｉｎ、２５℃黑暗条件下培养
１５ ｄ。 用无菌双层纱布过滤，将滤液于 ４℃、１０ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ条件下离心 ２０ ｍｉｎ，粗酶液即为上清液。
１􀆰 ２􀆰 ２ 供试菌株细胞壁降解酶活性的测定
纤维素酶（Ｃｘ）活性的测定：加入上述提取的粗
酶液 ０􀆰 ５ ｍＬ、０􀆰 ５％羧甲基纤维素溶液 １􀆰 ５ ｍＬ，５０℃
下水浴 ４０ ｍｉｎ。 迅速加入 １􀆰 ５ ｍＬ ３，５⁃二硝基水杨
酸以终止反应。 充分摇匀，沸水浴 ５ ｍｉｎ，流水冷却
并定容至 ２０ ｍＬ。 测定 ＯＤ５４０，对照为空白培养液。
１ 个 Ｃｘ活力单位（Ｕ）为 ５０℃下每小时催化底物生
成 １ μｍｏｌ ／ Ｌ 葡萄糖的还原物质的酶量。 Ｃｘ 活性
（Ｕ ／ ｍＬ） ＝葡萄糖生成量（ｍｇ ／ ｍＬ） × ３ × １ × ５􀆰 ５６。
多聚半乳糖醛酸酶（ＰＧ）活性测定：加入上述提
取的粗酶液 ０􀆰 ５ ｍＬ、０􀆰 ５％ 果胶溶液 １􀆰 ５ ｍＬ，于
５０℃水浴 ３０ ｍｉｎ。 迅速加入 １􀆰 ５ ｍＬ ３，５⁃二硝基水
杨酸以终止反应。 充分摇匀，沸水浴 ５ ｍｉｎ，流水冷
却并定容至 ２０ ｍＬ。 反应液稀释 ４ 倍后，用酶标仪
测定 ＯＤ５４０，以空白供试培养液提取的溶液为对照。
１个 ＰＧ活力单位（Ｕ）为 ５０℃下每小时催化底物生成
１ μｍｏｌ ／ Ｌ半乳糖醛酸的还原物质的酶量。 ＰＧ 活性
（Ｕ ／ ｍＬ） ＝ 半乳糖醛酸生成量 （ ｍｇ ／ ｍＬ） × ４ ×
４ × ４􀆰 ７１。
聚甲基半乳糖醛酸酶（ＰＭＧ）活性测定：底物为
０􀆰 ５％多聚半乳糖醛酸溶液，测定方法同 ＰＧ 活性的
测定。 １ 个 ＰＭＧ 活力单位（Ｕ）为 ５０℃下每小时催
化底物生成 １ μｍｏｌ ／ Ｌ 半乳糖醛酸的还原物质的酶
量。 ＰＭＧ活性（Ｕ ／ ｍＬ ） ＝半乳糖醛酸生成量（ｍｇ ／
ｍＬ） × ４ × ４ × ４􀆰 ７１。
１􀆰 ２􀆰 ３ 细胞壁降解酶相关基因的表达分析
将供试菌株培养在 ＲＮＡ⁃ｆｒｅｅ 的 ＰＤＡ 平板上，
２５℃黑暗培养 ７ ｄ。 用药匙小心刮取菌丝体，用滤纸
吸干菌丝的水分，称取 ５０ ～ １００ ｍｇ，用锡箔纸包裹，
立即投入液氮中速冻 １０ ｍｉｎ，而后转移至 － ８０℃冰
箱保存备用。 总 ＲＮＡ 提取采用 Ｔｒｉｚｏｌ 提取试剂盒。
ｃＤＮＡ的合成采用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ
ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ试剂盒进行。
利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５􀆰 ０ 软件设计相关细胞壁
降解酶基因的引物（表 １），以 １８Ｓ ＲＮＡ 作为内参基
因进行 ＲＴ⁃ＰＣＲ分析（申珅，２０１３）。 ２０ μＬ ＲＴ⁃ＰＣＲ
反应体系为：上下游引物各 １ μＬ、ｃＤＮＡ １ μＬ、２ ×
Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ １０ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ７ μＬ。 ＲＴ⁃ＰＣＲ扩
增条件为：９４℃ ５ ｍｉｎ；９４℃ ４０ ｓ，５４℃ １ ｍｉｎ；７２℃
１ ｍｉｎ，进行 ３５ 个循环；７２℃延伸 １０ ｍｉｎ；４℃保存。
取 ５ μＬ扩增产物在 １􀆰 ５％琼脂糖凝胶中进行电泳，
检测基因表达情况。
表 １ 本研究中用于 ＲＴ⁃ＰＣＲ和 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ分析的细胞壁降解酶相关基因引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ＲＴ⁃ＰＣＲ ａｎｄ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ
基因
Ｇｅｎｅ
ＲＴ⁃ＰＣＲ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
核酸序列 （５′⁃３′）
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′⁃３′）
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
核酸序列 （５′⁃３′）
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′⁃３′）
葡聚糖酶基因
Ｃｘ
多聚半乳糖醛
酸酶基因 ＰＧ
聚甲基半乳糖
醛酸酶基因 ＰＭＧ
１８Ｓ ＲＮＡ
ＲＴ⁃ＳＣＷ⁃Ｌ ＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＧ Ｆ⁃Ｃｘ ＡＣＴＣＴＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＣＡＡＣＧ
ＲＴ⁃ＳＣＷ⁃Ｒ ＡＡＡＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＡＧＣ Ｒ⁃Ｃｘ ＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡ
ＲＴ⁃ＰＧ⁃Ｆ ＴＧＧＴＣＡＡＡＣＣＧＣＡＴＴＴＣＣ Ｆ⁃ＰＧ ＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧ
ＲＴ⁃ＰＧ⁃Ｒ ＧＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＧＴＧＴＡＧＧＣ Ｒ⁃ＰＧ ＣＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＧＴＧ
ＲＴ⁃ＰＭＧ⁃Ｆ ＡＴＣＴＧＴＴＣＧＡＴＧＣＣＧＧＴＴＴ Ｆ⁃ＰＭＧ ＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＴＣＡ
ＲＴ⁃ＰＭＧ⁃Ｒ ＡＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣ Ｒ⁃ＰＭＧ ＧＧＴＴＧＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣ
Ｆ⁃１８Ｓ ＧＧＣＡＴＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＧＴＴＧＴＣ Ｆ⁃１８Ｓ ＧＧＣＡＴＣＡＧＴＡＴＴＣＡＧＧＴＴＧＴＣ
Ｒ⁃１８Ｓ ＧＴＴＡＡＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣ Ｒ⁃１８Ｓ ＧＴＴＡＡＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣ
１􀆰 ２􀆰 ４ 互作中细胞壁降解酶基因的时间表达分析
将代表性的玉米专化型菌株 ＳＹＹ１３０３ 和高粱
专化型菌株 ＪＰＧ１３０２ 培养在 ＰＤＡ平板上，２５℃黑暗
培养 ７ ｄ。 用打孔器打取直径 １ ｃｍ 菌饼，用镊子小
心将菌株 ＳＹＹ１３０３ 的菌饼接种至玉米叶面上，将菌
株 ＪＰＧ１３０２ 的菌饼接种至高粱叶面上，扣棚保湿
２４ ～ ４８ ｈ。分别在接种后 ０、６、１２、２４、３６、４８、７２、９６、
１２０ ｈ，剪取菌饼下方的叶片 ５０ ～ １００ ｍｇ，将叶片用
锡箔纸包裹，立即投入液氮中速冻 １０ ｍｉｎ，而后转移
至 － ８０℃冰箱中保存备用，每处理备用 ６ 份，以 ０ ｈ
样品为空白对照。 总 ＲＮＡ 提取和 ｃＤＮＡ 合成同
１􀆰 ２􀆰 ３ 部分。
利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５􀆰 ０ 软件设计相关细胞壁
降解酶基因的引物（表 １），以 １８Ｓ ＲＮＡ 作为内参基
７３９６ 期 唐　 琳等： 凸脐蠕孢菌玉米、高粱专化型的细胞壁降解酶活性及基因表达分析
因。 ２５ μＬ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ 反应体系为：ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ
ＴａｑⅡ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ Ｐｌｕｓ） （２ × Ｃｏｎｃ． ）∗１ １２􀆰 ５ μＬ、
１０ μｍｏｌ ／ Ｌ上下游引物各 １ μＬ、ｃＤＮＡ（ ＜ １００ ｎｇ）２
μＬ、ｄＨ２Ｏ ８􀆰 ５ μＬ。 ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增条件为：９５℃ ３０ ｓ；
９５℃ ５ ｓ；６０℃ ３０ ｓ，４０ 个循环；９５℃ ５ ｓ；６０℃ ３０ ｓ；
熔点曲线读板。 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ由荧光定量 ＰＣＲ仪完成。
１􀆰 ３ 数据分析
采用 ＤＰＳ ７􀆰 ０５ 软件进行试验数据统计分析，
Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法进行差异显著性检验。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 细胞壁降解酶活性比较
在 ＰＭＧ活性的比较中，凸脐蠕孢菌高粱专化型
略高于玉米专化型，其中高粱专化型菌株 ＪＰＧ１３０２
的酶活性最高，为 １１５􀆰 ８４ Ｕ ／ ｍｇ，显著高于其余菌
株；在 ＰＧ 和 Ｃｘ 活性的比较中，玉米专化型菌株的
酶活性比高粱专化型菌株高，其中玉米专化型菌株
ＸＡＹ１３０２ 的 ＰＧ活性最高，为 １５１􀆰 ７６ Ｕ ／ ｍｇ，显著高
于其余菌株；菌株 ＹＣＹ１３２４ 的 Ｃｘ 活性最高，为
１６８􀆰 ５３ Ｕ ／ ｍｇ，且玉米专化型菌株均显著高于高梁
专化型菌株（图 １）。 此外，同一种专化型内各菌株
的酶活性也表现出差异。
２􀆰 ２ 细胞壁降解酶基因的表达分析
凸脐蠕孢菌专化型菌株的细胞壁降解酶相关
基因的表达分析显示，与内参基因 １８Ｓ ＲＮＡ 相比，
其细胞壁合成酶相关基因的表达量均为上调表
达。 在 Ｃｘ和 ＰＧ 基因中，各专化型菌株的表达量
存在差异，但不大。 在 ＰＭＧ 基因上，各菌株的表
达量差异较大，高粱专化型菌株 ＪＰＧ１３０２ 的表达
量最大（图 ２）。
图 １ 供试凸脐蠕孢菌 ２ 个专化型菌株的细胞壁降解酶活性
Ｆｉｇ． １ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｔｅｓｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
图中数据为平均数 ±标准差。 不同小写、大写字母分别表示同一种酶在不同菌株间经 Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法检验差异
显著（Ｐ ＜ ０􀆰 ０５）或极显著（Ｐ ＜ ０􀆰 ０１）。 Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＤ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｏｒ ｕｐｐｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ
ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｏｒ Ｐ ＜ ０􀆰 ０１ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ．
　
２􀆰 ３ 互作中细胞壁降解酶基因的 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ分析
２􀆰 ３􀆰 １ 纤维素酶基因的表达
与对照相比，凸脐蠕孢菌高粱专化型菌株
ＪＰＧ１３０２ 的 Ｃｘ 基因在 １２ ｈ 和 ３６ ｈ 时略微下调表
达，其余时间点均为上调表达，自 ３６ ｈ 起大幅度上
调表达，１２０ ｈ的表达量最高，为对照的 １７􀆰 ３ 倍；玉
米专化型菌株 ＳＹＹ１３０３ 的 Ｃｘ基因在 １２、２４ 和 ７２ ｈ
时略微下调表达，其余时间点均为上调表达，自 ７２ ｈ
起大幅度上调表达，１２０ ｈ 的表达量最高，为对照的
２０ 倍（图 ３）。 表明 Ｃｘ基因在 ２ 种专化型的时间表
达趋势较为相似，均随病程的延长而大幅度上调表
达，各时间处理的表达量存在差异。
２􀆰 ３􀆰 ２ 多聚半乳糖醛酸酶基因的表达
与对照相比，凸脐蠕孢菌高粱专化型菌株
ＪＰＧ１３０２ 的 ＰＧ基因在 ６、１２ 和 ２４ ｈ 时略微下调表
达，其余时间点均为上调表达，自 ２４ ｈ 起大幅度上
调表达，４８ ｈ时表达量达到第 １ 个峰值，７２ ｈ时表达
略微下降之后继续上升，１２０ ｈ 时达到最高，为对照
的 ７􀆰 ７ 倍；玉米专化型菌株 ＳＹＹ１３０３ 的 ＰＧ 基因在
所有时间处理点均为上调表达，７２ ｈ 的表达量最
高，为对照的 ３􀆰 ９ 倍。 表明 ＰＧ 基因在高粱专化型
菌株 ＪＰＧ１３０２ 和玉米专化型菌株 ＳＹＹ１３０３ 的时间
表达趋势和各时间处理的表达量存在差异，高粱专
化型的 ＰＧ基因随病程的延长而大幅度上调表达，
８３９ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
玉米专化型的 ＰＧ基因随病程的延长上调表达量有
所下降（图 ４）。
图 ２ 供试凸脐蠕孢菌菌株细胞壁降解酶基因
的表达量分析
Ｆｉｇ． ２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ⁃ｗａｌｌ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｔｅｓｔｅｄ
ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
Ａ： ＳＹＹ１３０３； Ｂ： ＸＡＹ１３０２； Ｃ： ＹＣＹ１３２４；
Ｄ： ＬＰＧ１３０４； Ｅ： ＸＡＧ１３０３； Ｆ： ＪＰＧ１３０２．
　
图 ３ 供试凸脐蠕孢菌菌株互作中纤维素酶基因
（Ｃｘ）的相对表达量
Ｆｉｇ． ３ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ Ｃｘ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
ｔｅｓｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ
　
图 ４ 供试凸脐蠕孢菌菌株互作中多聚半乳糖醛酸酶
基因（ＰＧ）的相对表达量
Ｆｉｇ． ４ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ＰＧ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ
ｔｕｒｃｉｃａ ｔｅｓｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ
　
２􀆰 ３􀆰 ３ 聚甲基半乳糖醛酸酶基因的表达
与对照相比，凸脐蠕孢菌高粱专化型菌株
ＪＰＧ１３０２ 的 ＰＭＧ基因在 ６ ｈ 和 １２ ｈ 时略微下调表
达，其余时间处理均为上调表达，自 ４８ ｈ 起大幅度
上调表达，７２ ｈ时表达量达到第 １ 个峰值，９６ ｈ时表
达略微下降之后继续上升，到 １２０ ｈ 时达到最高，为
对照的 ８􀆰 ７ 倍；玉米专化型菌株 ＳＹＹ１３０３ 的 ＰＭＧ
基因在 ３６、４８ 和 ７２ ｈ时为上调表达，其余时间处理
均为下调表达，７２ ｈ 的表达量最高，为对照的 ２􀆰 ２
倍。 表明 ＰＭＧ基因在高粱专化型菌株 ＪＰＧ１３０２ 和
玉米专化型菌株 ＳＹＹ１３０３ 的时间表达趋势和各时
间处理的表达量存在差异，高粱专化型的 ＰＭＧ基因
随病程的延长而大幅度上调表达，玉米专化型的
ＰＭＧ基因随病程的延长而下调表达（图 ５）。
图 ５ 供试凸脐蠕孢菌菌株互作中聚甲基半乳糖
醛酸酶基因（ＰＭＧ）的相对表达量
Ｆｉｇ． ５ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ＰＭＧ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ
ｔｅｓｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ
　
３ 讨论
植物细胞壁是由纤维素类和果胶类物质组成，
其结构完整和功能健全，对病原菌的生殖发育及抵
抗外源胁迫具有重要意义（Ｋｒａｕｓ ＆ Ｈｅｉｔｍａｎ，２００３；
Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ． ，２００７）。 在病原菌 －植物互作过程中，毒
性较强的病原菌的细胞壁能够抵御来自植物的抗性
反应，并有利于病原菌维持正常的功能，使其迅速产
生侵染结构并成功侵染寄主（Ｍｏｌｉｎａ ＆ Ｋａｈｍａｎｎ，
２００７；Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ． ，２００９）。 另外，在互作过程中，大多
数病原菌自身产生的多种细胞壁降解酶类相互协作
有利于分解寄主细胞壁结构，使其成功侵染寄主
（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ． ，１９８８）。 玉米圆斑病菌 Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ
ｃａｒｂｏｎｕｍ的纤维二糖水解酶基因被改性后，对玉米
的致病性不受影响，且仍可分泌纤维素酶（ Ｓｐｏｓａｔｏ
ｅｔ ａｌ． ，１９９５）。 Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （２０００）报道彻底破坏 ２
９３９６ 期 唐　 琳等： 凸脐蠕孢菌玉米、高粱专化型的细胞壁降解酶活性及基因表达分析
个果胶裂解酶基因会降低红球丛赤壳菌 Ｎｅｃｔｒｉａ
ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ对豌豆的毒性。 本研究结果表明，凸
脐蠕孢菌 ２ 种专化型的菌株存在产酶能力的差异，
高粱专化型的 ＰＭＧ活性略高于玉米专化型，玉米专
化型的 ＰＧ 和 Ｃｘ 活性略高于高粱专化型；另外，同
一种专化型菌株的细胞壁降解酶活性、２ 种专化型
的细胞壁降解酶基因表达量也存在差异。 这说明凸
脐蠕孢菌的 ２ 种专化型产生酶学差异和基因表达差
异的原因与供试菌株的自身能力有关，推测此结果
也是 ２ 种专化型产生致病专化性的诱因之一。 相关
文献也报道，植物病原真菌的果胶酶和纤维素酶与
致病性密切相关（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ，１９９３），也可能与
病原菌的毒力或致病性直接相关 （ Ｂａｒｒａｓ ｅｔ ａｌ． ，
１９９４）。
基因时空表达研究是揭示基因可能功能的最直
观和直接的手段。 很多致病相关基因在互作中同时
表达，表达的早晚以及表达量的高低决定了病原菌
对寄主的致病水平（张硕，２０１３）。 本研究中凸脐蠕
孢菌的 ２ 种专化型在侵染过程中，Ｃｘ 基因在 ２ 种专
化型中的时间表达趋势较为相似，均随着病程的延
长而大幅度上调表达；高粱专化型的 ＰＧ 基因随病
程的延长而大幅度上调表达，玉米专化型的 ＰＧ 基
因随病程的延长，其上调表达量有所下降；高粱专化
型的 ＰＭＧ基因随病程的延长而大幅度上调表达，玉
米专化型的 ＰＭＧ 基因随病程的延长而下调表达。
另外，３ 种基因在各时间处理的表达量存在差异。
推测凸脐蠕孢菌专化型在侵染过程中，相关的细胞
壁降解酶类可能会产生种间差异，可能是其致病专
化性的诱因之一。 而对于纤维素酶基因和果胶酶基
因在病原菌与寄主互作过程中，因病原菌的不同，其
表达量和表达趋势不同。 如玉米纹枯病菌与寄主互
作中，β⁃１，４⁃内切纤维素酶基因在 １ ～ ７ ｄ 的侵染过
程中均上调表达，其中 ２ ～ ４ ｄ 的表达效果较好，随
着病程延长和病斑形成，表达量略有下降（李海云，
２０１０）。 对于本研究推测的结果今后尚需继续开展
验证工作，如基因敲除的功能验证等。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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０４９ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
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ｔｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｆｔ ｒｏｔ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ． ｃａｒｏｔｏ⁃
ｖｏｒａ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａｅｐＨ ｏｆ Ｅ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ７１
ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ，
Ｅ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ． ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ， ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ａｐｐｌｉｅｄ
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Ｒｏｇｅｒｓ ＬＭ， Ｋｉｍ ＹＫ， Ｇｕｏ ＷＪ， Ｇｏｎｚáｌｅｚ⁃Ｃａｎｄｅｌａｓ Ｌ， Ｌｉ ＤＸ， Ｋｏ⁃
ｌａｔｔｕｋｕｄｙ ＰＥ． ２０００． Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｅｉｔｈｅｒ ａ ｈｏｓｔ⁃ ｏｒ ｐｅｃｔｉｎ⁃
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（责任编辑：李美娟）
１４９６ 期 唐　 琳等： 凸脐蠕孢菌玉米、高粱专化型的细胞壁降解酶活性及基因表达分析