全 文 ：B U L L E T IN O F B O T AN IC A L R E S E A R C H
第 巧卷 第 3期
V o l
.
15 N o
.
3
19 5年 7 月
Ju l y
,
199 5
对 T M V 不同抗性番茄品种的叶绿体
D N A 限制性内切酶酶谱分析 *
黄永芬 汪清撤 孙德君
傅桂荣 王海廷 邢 怡 程振起
A N A L Y S I S O F R E S T R I C T I O N E N Z Y M E S O F
C H L O R O P L A S T D N A I N T O M A T O V A R I E T I E S
、 VH I C H H A V E D I F F E R E N T R E S I S T A N C E
T O T O B B A C C O M O S S I C V I R U S
H u an g Y o ng 一 fe n W a n g Q in g 一 y in S u n D e 一 j u n
F u G u i一 r o n g w 直n g H a i一 t in g X in g Y i C h e n g Z h e n 一 q i
〔摘 要〕 选用对 T M V 有检性和敏感的番茄品种 、 制备其 ct 一 D N A , 用限
制性 内切酶 B am H l 、 Eco IR 和 sP t l 完全酶解 , 三种酶切图谱与前人报道一
致 , 由酶切片段计算番茄 ct 一 D N A 。 分子量约为 156 . gk b 。 比较杭性和敏感品种
的 ct 一 D N A 图语 , 发现三种酶切图谱均存在差异 , 但由差异片段计算分子量之和
又很接近 。 我们推浏这是由于硷基顺序变异或小段 D N A 顺序插入或缺失所造成 ,
由此证明 , 叶绿体基因组与核中的 T M V 扔性基因 , 共同决定着植物体对 T M V 的
杭性 。
关键词 番茄 ; T M V ct 一 D N A ; 限制性内切酶
烟草花叶病毒 ( T M V )对番茄生产危害十分严重 。 目前对 T M V 的染病与抗病机理已
有一些报道 〔 l,2 〕 。 叶绿体 DNA 为双链环状分子
, 是真核生物细胞器中一个独立的遗传系
统 , 与核基因组有密切联系 . 有关抗病毒病与叶绿体基因组的相关性 , 目前尚未见报道 , 但
黄永芬 , 汪清嫩 , 孙德君 , 傅桂荣 , 王海廷 .
Har b in N o r m a l U n iv e r s ity
,
Har b in
.
150 80 )
.
程振起 , 北京 , 清华大学生命科学与技术系
U
n ive
r s ity
,
B e ij i
n g lX() 084 )
.
. 国家自然科学基金资助项 目 .
19 9 5 年 2 月收到本文 .
邢怡 : 哈尔滨 , 哈尔滨师范大学生物系 ( D e p a r tm e n t o f B i o lo g叭
( D e aP
r t m e n t o f B i o lo g i e a l S c ie
n c e a n d T e e h n o lo g y
,
ST i
n g h u a
39 2 植 物 研 究 巧 卷
我们的工作曾发现 (l )一些抗病毒病的番茄品种其叶子显黄绿色 〔 1〕 。 ( 2) 同工酶分析
显示 , 苹果酸脱氢酶 ( M D H ) 同工酶变化与番茄病毒病有一定的相关性 〔 2 〕 , 而叶绿
体中存在有较丰富的苹果酸脱氢酶 。 ( 3) 发现番茄感染 C M V 后 , 染病植株比未染病植株
叶绿体类囊体膜蛋白多出一条 26 K d 的多肤带 〔 4 〕 。 另外黄金生 〔 5 〕 等均指出 , 病毒感
染植物体后 , 叶绿体的超微结构发生变化 。 石田政弘 〔 11 〕 等发现 T M v 浸染蔓陀萝后 ,
病毒蛋白与叶绿体间质蛋白有一定关系 。 这些促使我们推测 , 番茄抗病毒有可能与叶绿体
基因组有一定的相关性 。 为此 , 我们从比较对 T M V 抗性不同植株的 ct 一 D N A 酶切图谱人
手 , 研究番茄的抗病毒病机理 , 为用遗传工程方法培养抗 T M V 品种开辟新路 。
材料和方法
一 、 材料
实验材料为番茄属 (勿` op er s ic on ) 中普通番茄 ( L . sE cu le nt u m M il ) 的六个品种 :
1
、
20 1:
2
、 矮黄 ; 以上两个品种带有 T m 一 2 基因 , 为抗 T M V 品种 。
3
、 强力米寿 ; 带 Tm 一 1基因 , 为抗 T M V 品种 。
4
、 大红 ; 生产上表现抗 T M V 病毒侵染 , 但尚不清楚是否带有抗病基因 。
5
、 未十二 ;
6
、 粉红甜肉 ; 以上两个为对 T M V 敏感品种 . 用作对照 。
上述品种经温室或田间栽培至 6一 7 片真叶时 , 取上部幼嫩叶片 , 洗净 , 用滤纸吸干水
分 , 4 ℃冰箱黑暗饥饿 24 小时后 , 置一 70 ℃冰箱冰冻保存备用 。
二 、 方法
(一 ) ct 一 D N A 的 制备 采用 我们 改进 的 G . B o kj an , 高 盐法 制备 ct -
一 D N A 〔 3 〕 , 纯化后样品纯度用以下方法鉴定 :
1
、
0
.
8% 琼脂糖凝胶电泳检查是否为一条带 。
2
、 在岛津 U V 一 265 全 波自动记录 分光光度计上 测定样品的 特征吸收 曲线 , 又
260 / 又 2 80 , 并计算产率 。 制备合格的 ct 一 D N A 用于酶切实验 。
(二 ) e t 一 D N A 的 B a m H I 、 E e o R I 、 P s t l 的完全酶解及分析
B a m H I
、
E c o R I
、
R st l 购自华美公司 、 酶切条件按厂家提供进行 。 酶切后片段经
1% 琼脂糖凝胶电泳分离 , 用 25 37A 透射光排照 , 分子量计算选用 又一 D N A H i n d l 酶切
片段为分子量标准 , 以 D N A 片段标准分子量为纵座标 , 以各相应的 D N A 片段迁移距离
为横座标 , 在半对数座标低上作出标准曲线 . 再精确测定样品酶切片段的迁移率 , 从标准
曲线中找出相应的 D N A 片段分子量 。
结果与讨论
一 、 番茄 ct 一 D N A 限制性内切酶分析
用上述材料制备的 ct 一 D N A , 用限制性内切酶 B a m H I
种酶切图谱分别与以前报道一致 〔 7 一 10 〕 。 结果见图 1(A ) 、
E e o R I
、
P s t l 完全酶解 , 三
( B )
、
( C )
。

3 94植 物 研 究 1 5卷
表 l番茄 c t一 D NA Bm a l H酶切片段及其长度
T ab le1 R es tr ie t in ofa rg mn e tn ad ln eg th of tom a toe t一 D NA d ig s e ted
w i th Bam H1
.
片 段 长 度 片 段 长 度 片 段 长 度 片 段 长 度
Frag mn e t( kb) Frag m en t( b k) Frag m en t( kb) Frag m en t( g k)
Len g th Len g th Ln eg th Len g th
la2 1
.
42 6 5
.
3 1 10 a4
.
7 7 l3 6
.
08
lb2 1
.
2 46 5
.
8 910 4 b
.
2 7 7 17
.
73
2 a10
.
73 7 a5
.
62 4 l l
.
42 18 a2
.
3 7
2 b10
.
73 7 b5
.
62 l2 4
.
3 618 b2
.
3 7
3 a 9
.
2 58 a5
.
3 13 3 l
.
7 91 9a2
.
2 0
3 b 9
.
2 8 5 b5
.
3 1 4 l3
.
7 0 12 b 9
.
2 0
47
.
0 9 95
.
0 9l53
.
4 5
总 计 1 6 5. 8 7 kb
T O ta l注 :a、 b示双重带 。 ( a. bs h ow the e rPa e tb an ds)
表2 番茄 c t一 D NA EocR I酶切片段及其长度
T ab le2 R s e tr ie t in of rag mn e tn ad ln eg th of tom a te o t一 D NA d ig s e ted
W i th EC OR I
。
片 段 长 度 片 段 长 度 片 段 长 度 片 段 长 度
Fa rg mn e t( kb) Frag m en t( kb) Fa rg m en t( b k) Fa rg mn e t( b k)
Len g th Len g th Len g th Len g th
la2 4
.
2 4 a6
.
1 7 5
.
0 l23
.
0
lb2 4
.
2 46 b
.
1 8 4
.
7 l3 2
.
3
2 a10
.
3 5 a5
.
8 9a4
.
2 4 l2
.
2
2 1 b0
.
3 5 b5
.
8 94 b
.
2 1 s a1
.
6
3 a7
.
8 6 a5
.
4 l0 4
.
0 1 s b1
.
6
3 7 b
.
8 6 5 b
.
4 l l3
.
6 l61
.
2
总 计 1 56. s kb
T o ta l
3期 黄永芬等 : 对 TM V不同抗性番茄品种的叶绿体 DN A限制性内切酶酶谱分析
表 3 番茄 ct 一 D N A P st l 酶切片段及其长度
T a b l e 3 R e s t r i e t i o n f r a g m e n t a n d l e n g t h o f t o m a t o e t一 D N A d i g e s t e d
w i t h P s t l
。
片 段 长 度 片 段 长 度 片 段 长 度 片 段 长 度
F r a g m e n t ( k b ) F r a g m e n t ( k b ) F r a g m e n t ( k b ) F r a g m e n t ( k b )
L e n g t h L e n g t h L e n g t h L e n g t h
l 23
.
8 4 b 17
.
1 7b 7
.
8 l 0 2
.
4
2 19
.
2 5 15
.
0 8 5
.
0 11 2
.
0
3 18
.
3 6 10
.
2 9a 4
.
3 l 2 1
.
6
4a 17
.
1 7 a
.v
8 9b 4
.
3 l 3 1
.
0
总 计 1 5 6 . g k b
T O ta l
片段 , 其长度分别为 4 . 36 k b, 3 . 54 k b和 2 . 73 kb , 总计约 or . 63 k b , 详见图 1 ()A 箭头所示 。
E e o R I酶切图谱 敏感品种失去 E e o 4 、 E e o 6片段 , 长度为 6 . I k b x Z和 5 . 4k b x Z ,
总计约 23k b , 增加了 E e o s 、 E e o g 和 E e o 15 片段 , 长度为 5 . s k b x Z , 4 . Zk b x Z , 1. 6k b
x Z
, 总计为 23 . Zkb . 详见图 l (B ) 箭头所示 。
P st l酶切图谱 酶感品种失去了抗性品种所具有的 P s t7 、 P s gt 片段 , 长度为 7 . sk b
x Z
、
4
.
3k b x Z
, 总计约 2 4 . Zk b , 增加了 P s t Z和 P s t s 片段 , 长度为 19 . Zk b 和 5 . o k b , 总
计约为 24 . Zk b 。 详见图 1( c) 箭头所示 。
综上所述 , 番茄抗 T M V 品种和敏感品种的 ct 一 D N A 三种酶切图谱均存在差异 , 但计
算差异片段长度之总和是极相近的 。
关于抗性和敏感品种酶切图谱的差异 , 我们曾怀疑是酶切反应不彻底造成的 , 但加大酶
量 , 延长反应时间结果是一样的 , 并且在这些酶切图谱上 , 抗性品种 20 1 、 矮黄 、 强力米
寿 、 大红等酶切图谱表现了一致性 , 而敏感品种未十二和粉红甜肉也保持了一致性 。
有关番茄 。 t 一 D N A 酶切图谱的研究 , 19 82 年 B . s ch i ter 等 〔 10 〕进行了番茄 、 马铃
薯和它们一些体细胞杂种的 ct 一 D N A 性质及 K p川 、 sP lt 、 E co RI 三种酶切图谱分析 ;
aP lm er
.
J
.
D 〔 8 〕 对番茄不同起源的 12 个种和变种的 ct 一 D N A 进行 B a m H I等五种限制
性内切酶图谱分析 , 发现番茄种和变种酶切图谱存在差异 , 但品种间酶切图谱无差异 ; 种内
品种间果实大小 、 颜色及株高等也与 ct 一 D N A 无关 , 并根据酶切图谱讨论了番茄进化与系
统发生的关系 , 其中 B a m H I酶切图谱仅在醋栗番茄和契斯曼两个种中出现差异 , 差异片段
为 2 . Zk b 、 1. 4k b 和 0 . 85 k b ,E c o R I酶切图谱仅在野生番茄和契斯曼中出现差异 , 它们共同
失去 T 5 . sk b 和 2 . Zk b 两个片段 。 2955年 日本学者 N o r i o L w a t s u k i 〔 7 〕 完成了番茄杂色
体和叶绿体 D N A 的酶切图谱比较 , 证明由叶绿体转变为杂色体时 , 质体 D N A 的酶切图谱
没有差异 。 总之 , 纵观国内外此方面研究进展 , 认为番茄品种间及不同发育时期 , ct -
一 D N A 的限制性酶切图谱没有差异 , 我们选用的抗病和敏感品种均属于普通番茄种的不同
品种 , 四个抗病品种出现一致的酶切图谱而区别于敏感品种 , 拟门推测这可能与番茄抗病性
有密切关系 。 我们选用的矮黄 、 2 01 、 强力米寿和大红分别来源于江苏 、 美国加州 、 日本拢
9 3 6 植 物 研 究 15 卷
井和匈牙利 , 它们的选育过程是独立的 , 核基因组均带有对 T M V 抗性基因 , 它们的 ct -
一 D N A 酶切图谱又出现一致性 , 与敏感品种差异相同 , 这些给我们启示 , 叶绿体基因组与
核上抗 T M V 基因共同决定番茄对 T M V 的抗性 ; 差异片段分子量十分接近 , 说明这是由于
叶绿体基因组点突变 、 小部份硷基顺序变异或小片段核昔酸序列的插人或缺失造成的 , 而这
些小的硷基变化是可以使处于保守状态的叶绿体基 因组的性质发生变化 , 从而导致与抗
T M V 有关的表型出现 , 叶绿体基因组在这一抗性表现过程中 , 究竟以什么样方式发挥作
用 , 影响多大还需进一步研究 。
以上结果 , 国内外尚无报道 。 我们认为从 ct 一 D N A 人手 , 深人研究番茄抗 T M V 的分
子机理 , 进而用基因工程途径培育抗 T M V 新品种将是十分有意义的 。
A B S
,
f R A C T
W
e a n a ly z e e t 一 D N A o f t o m a t o w h i e h 15 r e s i s t a n t a n d s e n s i t i v e t o T M V w i t h
r e s t r i e t i o n e n z ym e
,
O u r e l e e t r o Ph o r e t o g r a m o f B a m H I
,
E e o R I
,
P s t 1 15 s im i l a r t o
o t h e r r e P o r t
,
M o l e e u l a r w e ig h t o f e t 一 D N A 15 156
.
g k b
,
i t 15 s im i l a r t o o th e r s
,
s t u d y
,
W e if n d s o m e d ife
r e n e e i n B a m H I E e o R I
,
P S t 1 e l e e t r o P h o r e t o g r a m b e tw e e n
r e s i s t a n t g r o u P a n d s e n s i t i v e g r o u P
.
W e g u e s s t h i s m a y b e t h e a l t e r n a t i o n o f b a s e
s e q u e n e e o r in , e rt i o n o r d e l e t i o n o f s ho r t D N A s e q
u e n e e
,
W e a l s o i n fe r t h a t n u e l e u s
g e n o m e a n d e h l o r o P l a s t g e n o m e t o g e th e r d e e id e t h e r e s i s t a n e e o f P l a n t t o T o b b a e e o
M O S S IC V i r u S
.
K e y w o r ds T o m a t o ; T M V ; e t 一 D N A ; R e s t r ie t i o n e n d o n u e l e a s e s
.
参 考 文 献
〔 l 〕 王海廷 , 19 8:5 番茄品种 , 黑龙江出版社 .
〔 2 〕 刘珠棍 , 范会琴等 , 19 83 : 番茄苹果酸脱氢酶同工酶分析 , 植物生理学通讯 . ( :2) 23 一 26 。
〔 3 〕 孙德君 , 黄永芬等 . 19 91 : 一种改进的叶绿体 D N A 提纯方法 . 哈尔滨师范大学学报 (自然科学版 ) , V o7 、 生
物专辑 , 2 0 7一 2 12 .
〔 4 〕 黄永芬 , 张志凯等 , t g引 : 感染 C M v 和 T M v 的番茄叶绿体类囊体膜蛋白分析 . 哈尔滨师范大学学报 (自然科
学版 ) , V o 7 , 生物专辑 , 2 13一 2 18 .
〔 5 〕 黄金生 , 王连荣 , 于学书 , 1986 二大麦病叶片中叶绿体的超微结构 , 植物学报 , 2 8 (:4) 4科 一 4 45 .
〔 6 〕 石田政弘 , 光合作用器官的细胞生物学 , 19 7 : (黄宗瓶译 ) . 198:6 科学出版社 , 4一 5 。
〔 7 〕 H e r r m a n n R . G . , hT e P r e P ar a t io n o f e i r e u la r D N A fr o m P la s t记 5 . I n : Ed e lm a n N l , H a lli e k R . B . ,
C h u a N 一 H ( e d s ) M e th o d s In e h lo r o P la s t m o le e u la r b io lo gy
,
E ls e 访 e r , N o r t h H o l la n d . 19 8 2 . 2 5 9一 280 .
〔 8 〕 lvxa t s u k i N
. ,
A
.
H i r a i a n d T
.
A s a h i
,
A e o m aP
r i s o n o f t o m a t o fr u it e h i o r o P la s t a n d c h r o m o P la s t D N A s
a s a n a lyZ e d 侧 t h r e s r r i e t i o n e n d o n u e le a s e s . P la n t C e l l Ph y s i o l . 198 5 26 (3 )二 5 99 一 60 1 .
〔 9 〕 P a l m e r J . D . a n d D . Z a m i r , C h lo r o P la s t D N A e v o l u t jo n a n d P h y lo g e n e t i c r e la t i o n s h iP s i n L y e o pe r s 一
记 o n . P r o e . N a t l . A e a d . S c i . U SA . 19 8 2 . 7 9 : 5 006 一 5 0 10 .
〔 10 〕 P h il liP s A . L . R e s t r ic t io n m a P a n d e l o n e b a n k o f t o m a t o P l a s t id D N A . C u r r G e n e t . 19 85 . 10 : 14 7一 15 2 .
〔 1 1 〕 S c h i li e r B . , R . G . H e r r m a n n a n d G . M e le h e r s . R e s t r i e t i o n e n d o n u e le a s e a n a ly s i s o f P la s t id D N A
fr o m t
o m a t o
,
P a t a t o a n d s o m e o f th e i r s o m a t ie hy b r id s
.
M o l
.
G e n
.
G e n e t
.
19 8 2
.
186
: 4 5 3一 4 5 9 .