全 文 ：BUE I L L TO N F BOA T NICA L RE SE A RC H
第 1 4卷
Vo l
.
1 4
第 4期
NO
.
4
199 4年
O c t
.,
10 月
19 94
利用发根农杆菌 ( A g r o b a c t e r i o m’ r h iz o g e n e s )
介导二元载体向番茄导人 T M V,
C M V外壳蛋白基因的研究
徐香玲 石锐 刘伟华 李集临
S T U D I E S O N TM V 一 C P A N D CM V一 C P G EN E S
C A R R I E D IN T O T O M A TO B Y B IN A R Y V E C T O R
从 ZI T H A G R O B A C T E R I U h仗 R H I Z O G E N E S
X u X i a gn 一 l i n g Sh i R u i L i u W e l一 ho a Li Ji一 li n
〔摘 要〕 本文用含 PiR (P R认 4b )的发根农杆菌为介导 , 将二元载体质拉
P B T C 一 8 (T 一 D N A 上有 T M V 一 C P 和 C M V 一 C P 基因 ) , 导入黑龙江省当地
番茄 品种 。 用胚轴注射 , 顶端切口涂抹 , 子叶切块穿刺等方法感染转化子菌液 ,
诱导出毛状根 。 滤纸电泳检测有 50 % 以上的毛状根含有农杆碱和甘露碱 . 用杭
性筛选法亦获得有卡那霉素杭性的毛状根 。 在穿刺感染子叶切块诱导产生的具卡
那霉素抗性的愈伤组织上 , 获得不定芽与再生植株 , 经冠痪碱 , P C R , 斑点免疫
结合法检侧证明再生崖彭眯中有 T M V 和 CM V 基因产物的两种外壳蛋白和农杆
碱与甘露碱 , 获得双转化植株 。
关键词 iR 质拉 ; 番茄 ; T M V 一 C P 和 C M V 一 C P 基因
前 言
发根农杆菌 (心 or bac et ir u胡 lr l’z go en e s) 与根癌农杆菌 ( A . ut o aef c ie ns )相似 , 均含
有巨大质粒 , 前者称 R i质粒 ( r o o t in d u e i n g ) , 感染植物产生毛状根 ( H a iyr r o o t ) ; 后者
称 T i质粒 ( t u m o r i n d u e i n g ) , 感染植物产生冠瘦瘤 ( C r o w n g a l l) , 两者的结构大致相
似 , 均有插人植物基因组使植物体发生转化并在细胞中稳定存在的 T 一 D N A汀anr s ter
本文作者单位 : 黑龙江 , 哈尔滨 . 哈尔滨师范大学 ( H a r b i n N o r m a l u n i ve r s i t扒 H ar b i n 一50 80 H e i一o n 目i a n g ) .
19 9 4 年 2月收到本文 .
4期 徐香玲等 : 利用发根农杆菌介导二元载体向番茄导人夕院蛋白基因研究
一 D NA) ,T 一 D N A具有多种基因 , 在转化的植物细胞中有转录与转译功能 , 转化的再生
植株可通过减数分裂稳定地将导人基因遗传给后代 。 因此 iR . iT 质粒均可做为导人外源基
因的良好载体 , 而 iR 质粒不结瘤产生的毛状根容易再生植株 , 可直接做为中间载体的受
体 , 毛状根是单细胞起源的 , 由毛状根再生的转化植株 , 多为 乞合体 。
利用 iR 质料转移外源基因的方法 , 是以发根农杆菌为受体 , 通过三亲交配导人中间载
体或二元载体 , 选择转化子菌液感染植物体产生毛状根或与原土质体共培养产生愈伤组
织 , 由毛状根或愈伤组织再生植株 。
据镰田 〔 6 〕 报道利用 iR 质粒为载体 , 已在烟草 , 油菜等植物中获得转化的再生植
株 , s t o u g a r d 等 〔 7 〕 , R o b a g l i a 等 〔 10 〕 , o o n d 等 ( 9 〕 曾用中间载体法将目的基
因 , 通过 iR 质粒导人烟草 , 牛角花 , 番茄等植物 , 并得到表达 . 我国李红卫等 〔 2 〕 将中
国科学院微生物研究所构建的 P B C Y 一 40 1( 带有 N P T n , P V Y 一 cP 基因 ) 导人发根农
杆菌 , 获得转化子 , 用此转化子菌液感染马铃薯的不同品种 , 获得双转化植株 。 徐香玲
等 〔 3 〕 用发根农杆菌转化大豆 , 董金兰等 〔 4 〕 用发根农杆菌转化甘草均获得转化的再生
植株 。
本文是利用发根农杆菌 R 10 O0( P R认4b) 为受体 , 以中国科学院微生物研究所构建的二
元载体 , P BT C 一 8 汀一 D N A 上有 T M V 一 e p 和 C M V 一 e p 基因) , 为供体 , 以 E ·
co h H 1B 01 为诱动菌 , 通过三亲交配获得转化子 , 用转化子菌液感染黑龙江省当地推广的
几个番茄品种 , 获得转化的再生植株 . 由于这两种病毒外壳蛋白基因的导入 , 使转化的番
茄植株获得抗这两种病毒的能力 , 为番茄抗病育种提供新的遗传资源 。
材料与方法
一 、 材料 : 番茄品种为 “ 速熟 ” , “北秀” , “ 强力米寿 ” , “ 强力 62 ” , “ 真善
美” , “ 哈师 4 号 ” , “ 哈师 5 号 ’ , 由东北农业大学 , 本校番茄研究室提供 。 发根农杆
菌 R 10 0( P iR 4A b 有链霉素抗性位点 ) , 由日本筑波大学遗传实验中心引人 。 E . C ol i
M M 29 4 (P B T e 一 8 带有 T M V 一 C p 和 C M V 一 C p 基因 , 质粒上还有卡那霉素和壮观霉
素抗性基因 ) , 由中国科学院微生物研究所提供 。 E . e o l i H B 10 1 ( P R K 20 13, 有 M o b 和
tr a 位点 ) , 本研究室保存 .
二 、 方法 : 1 . P BT C 一 8 质粒导人发根农杆菌 ; 以发根农杆菌 R IO0 为受体 , E . co il
H 1B 01 为诱体菌 , E , C of i M M 294 为供体菌 , 通过三亲交配 , 将 P BcT 一 8 质粒导人发
根农杆菌 . 从三个菌的培养液中各取 0 . 5m l 加人 4 m l 培养基内 , 静止培养过夜 , 用 10m M
硫酸镁溶液稀释 , 取稀释液于含 50 m gl l卡那霉素 , 50 m gl l链霉素和 10 Om g / 1壮观毒素的
M inA 培养基上 , 两天后挑出转化子 , 再接人相同的选择平板上 , 选出单菌落 , 接至斜面
上保存 . 2 、 用改进的 K ad 。 法进行质粒检测 ; 取 1. 5 m l 过夜培养的转化子菌液于
E p e dn o fr 管内 , 15 000印m 离心 1分钟 , lm 1TE 缓冲液清洗 , 用 巧o ul 溶菌液溶菌 , 室
温下置 30 分钟加人等体的氯仿 , ( l :l ) 混匀 , 巧00 印m 离心 5 分钟 , 取上清液 , 0 . 6%
琼脂糖凝胶电泳 . 1u0 g/ m l澳化乙锭中染色 巧 分钟 , U V 下观察 . 3 、 外植体感染方法 :
采取胚轴 、 子叶节注射法 , 顶端切口涂抹法 . ( 1) 于胚轴 , 子叶 , 胚轴顶端经多点注射 ,
切口涂抹或子叶柄切口 , 子叶周边穿刺感染转化子菌液 , l一 2 周后可诱导出毛状根 .
( 2) 愈伤组织的诱导 : 将感染的子叶 , 子叶柄插在 T M 一 4G 培养基上 , 两天后切成小块
植 物 研 究 1 4卷
(切块具注射点 ), 放在含卡那霉素 ( 50 m g / l) 梭节青霉素 ( 50 m g / 1) 的选择培养基上 ,
除 G A 3 , 被 .0 su m 的 .2 4一 0 代替外 , 其他同 T M 一 4 G , 两周后可诱导出愈伤组织 . ( 3)
不定芽与再生植株的诱导 ; 从胚轴 , 子叶节 , 胚轴顶端切口感染处除诱导出毛状根外 , 尚
可诱导出不定芽 , 待长至适当大小时 , 切下除菌后放在 1 / ZM S生根培养基上生根 , 可获得
再生植株 。 用子叶穿刺 , 子叶柄切口 , 毛状根切段感染菌液获得的愈伤组织除菌后 , 车专入
T M 一 4G 不定芽诱导培养基上或玉米素培养基上 , 诱导不定芽 , 再转人 T M 一 SG 或 -
l / ZM S 培养基上生根 , 亦可获得再生植株 .
三 、 冠瘦碱检测 : 按 A . J . M or ga n 方法 〔 8 〕 进行农杆碱 ( A g or p ine ) 和甘露碱 ·
( M a n
o iP ne ) 检测确定是否有 iR 质粒的导入 。
四 、 P C R 检测 : 从转化的再生植株中提取核 D N .A 以此为模板 , 特制两个 25 P b 的
引物 , 在 P C R 仪上进行扩增 , 检测是否有 P BT C 一 8 质粒 D N A 的导人 . 按加藤法 〔 5 〕
五 、 斑点免疫结合法检测 ( D IB )A : 检测转化的再生植株是否有 T M V 和 C M V 外壳
蛋 白的存在和感染病后的免疫力 , 鉴定导人的 T M V 和 C M V 外壳蛋白基因是否表达 .
(参照郑先宇法 ) 〔 1 〕 。
实验结果
一 、 毛状根的诱导 :
用转化子菌液注射或涂抹胚轴切段 、 子叶节 、 胚轴顶端切口 , 1一 2 周后于注射点 , 切
口感染处长出毛状根或不定芽 (图 1 . 2) , 毛状根无向地性 , 生长快 , 分枝多 (图 4) , 未转化
的发根农杆菌菌液用同样方法感染上述外植体 . 诱导出毛状根与不定芽的频率与转化子
表 1 不同菌液诱导毛状根与不定芽
aT b l
e 1 T h e
.
n
um b
e r o f h a i r y r o o st a n d a b v e n it it o u b u d w e r e i n d u e t e d i n
d i f fe r e n t b a e t e r i o 一 e』 tur e s o l u Uo n .
C u l t lv a te d i n fe e t i o us b
a e te r iu m n u m be r O f n u m b e r o f h a i yr n u m b e r o f
i n fe e d e d po i n t r o o t s OP i
n t a d v e n t i ti o us b
a d
n u r n b e f % n U m b C t %
S u Sh u t r a n s fo mr i
n g ba e t e r i u m 3 8 l 7 4 4
.
7 3 3 7
.
89
。n t r an s fo r m jn g b a c t e * u州 2 4 l 6 6 6 . 6 6 2 8 . 33
Y E B C u l t ur e 5 0 1以 i o n 7 0 0 0 0
Has hi s t ar n s fo rm in g bac t e r ium 4 8 l 4 29
.
16 4 8
.
3 3
, n` r an ` fo r m ·` g b` 。 , e ir ·州 38 13 3 4 . 2 1 l 2 . 63
Y E B 皿 l t u r e S 0 1u t i o n 7 0 0 0 0
Bd X ul t r a n s of r m in g bac t
e r ium 4 l I5 3 6
.
50 8 19
.
5 1
Y Eg C u i l世 e 5 0 1以 i o n 8 0 0 0 0
4 期 徐香玲等 : 利用发根农杆菌介导二元载体向番茄导人夕院蛋白基因研究
表 2经滤纸电泳检测含有农杆碱与甘露碱的毛状根数
T aH
e2h Tn e u mb r e of h a ir yr o ot s w it h Ar g oP in n e ad mn n a oP in ed et e et ed
Cl ut ivt a ed in f e et i o usb a et er i un n r Umb e
r Of d et Ct c ed n umb e
r of h a ir yr o ot s W it h t w o
h a ir yr o ot s al k a 10 记 S
n U mb er %
Q ian gL i m it r an sf or m in gb a ct er i ul m0 5 50
.
0 0
Sh o u in t r an sf or m in gb act
er i u m】 9 136 8. 4 2
h Zn e sh an m e it r an sf or m in gb act
r e ium 7 7 10 0
.
00
in t rn a sf or m in gb act
er ium 16l 38 1
.
2 5
菌液大致相似 ;无菌培养液 ( Y EB )注射或涂抹均未长出毛状根与不定芽 (表 1)。
经滤纸电泳检测 , 平均有 74 . 9% 的毛状根含有农杆碱与甘露碱 (图 9) 是转化的毛状根
(表 2)
诱导的毛状根或不定芽转人含 50 m g / 1梭节青霉素无激素 M S 培养基上除菌 , 两周后
转人含 50 一 10 0m g / 1卡那霉素的 M S 选择培养基上 , 获得有抗性的毛状根与不定芽 。 用子
叶穿刺法感染的子叶 , 子叶柄放在含激素的 T M 一 4G 培养基上 , 两天后转人含梭爷青霉素
表 3 子叶穿刺法诱导的生根子叶数以及含有两种碱的毛状根数
aT U
e 3 T h e n um b
e r o f e o t y l e d o n a n d n um b
e r o f h a i r y r o o st w i ht t w o
a lk s l o id s in d u e e d by e o t y l e d o n m e d i u m
.
e ul t iv at e d i n fe e ti o u S b ac t
e r i u r n n u m be r o f n u m b e r O f r O 0 t e d n U m be r n u r n be r o f r o o t s
in fe de e d e o t y le d o n 0 f w i th t w o a l k al o记 s
e o t y l e d o n d e t e e t e d
n u m be r % f o + n u m be r %
L im i t r an s fo r m i n g b a e t e ir u m 34 巧 4 . 1 1 l 0 5
S h o u
i n t r an s fo rm i n g ba ct e ir um 2 6 l 4 53
.
8 4 l7 l3
Y E B C u lt u r e 5 0 1以 i o n 2 4 l 4 58 . 3 3 l 0 0
Z h e n t r a n s fo m i
n g b ac t e
r ium 2 7 l 4 5 1
.
85 5 2 25
Sh幼m e i i n t ar n s fo r m i n g b ac t e r ium l 8 7 3 8
.
88 36 l3
Y E B C u l t u化 S0 1u t i o n 2 3 0 0
52
. “ % 的毛状根含有农杆碱与甘露碱 . 将此毛状根切下除菌后 , 放在含 5m0 g / 1( 毫升 )卡那霉素的无激素 T M 一 4 G 或 M S 选择培养基上 , 多数可继续生长 , 获得有抗性的毛状根
4 20 植 物 研 究 4 1卷
愈伤组织的诱导 :
表 4 感染子叶块在含有卡那霉素的T M一 4 G培养基上 2一 3周诱导愈伤组织的频率
T ab l e4 T h efr e q un e e y wh i eh inf e et ed e ot yld e onp i e e e ind u e ed e al l usn oT M
一 4 G m e由 u m w ith kn a a m y e in t w othr e e w e e k s.
e ul t iv at ed inf e et i o usb a et er iu mn u mb er of 云 nf e et ed n umb er of c ot yl ed on w it h cal l us
e ot yl ed n oP i e cen u mbf e %
S uh S utr n a sf or m in gb a et er ium4 3l 94 4
.
18
in tr an sf or m in gb a et er ium20 0 0
H ah S i str an sf or m in gb a et er i u4 2 m 504 4
.
4 4
in tr an sf or m in gb act er i u m 190 0
表 5
T ab l e s
在不同激素配比的具有卡那霉素培养基上出芽情况
T h eb ud d in g s it u at in n o oth e山f er n ct a ux ir n at i o m e山 u m
w ith kn a a m y e in
.
C ul t iv at( e二 m ed i u m a ux ir u e at i o inf e Ct i o u Sn u mbr e Of n ub m er Of b ud d 一
e al l u sn IP gl e e e
n u mb er %
Q in aT g M一4 l G m g /L z e at in tr an sf or m in gb a et er i u m 3 38 4 2. 4 2
L 16 2
0
.
1m g /L 2
.
4 D in tr an sf or m in gb a et er i u m 3l 0 0
l m g /L z e at in tr n a sf r o m in gb a et er i u2 m0 2 10
.
0 0
0
.
1m g /L 2
.
4 D in tr an sf r o m in gb a et er i u m 170 0
M Sl m g /L z e at in tr an sf or m in gb a etr e i u m 10 2 5 72 5
.
7 1
0
.
1m g /L 2
.
4 D in tr an sf or m in gb a et er i u8 0 0 m 3
l m g /L z e at in tr an sf or m in gb a etr e i u8 m 3 56
.
0 2
0
.
1m g /L 2
.
4 D in tr an sf or m in gb a et er i u2 m 70 0
B e iX u i
·
T M一 4 Gl m g /L z e at in tr an sf or m in gb a et er i u m24 3 17. 3 9
0
.
1 m g /L 2
.
4 D in tr an sf or m in gb a et er i u m 10 0 9
M Sl m g /L z e at in tr an sf or m in gb a et er i u m 504 7 1
.
0 0
0
.
1 m g /L 2
.
4 D in tr an sf or m in gb a et er i u m4 l 0 0
H a sh i4 T M一心4 G· l m g /L z e at in tr an sf r o m in gb a et er i u m 36 0 2. 6 6
0
.
1 m g /L 2
.
4 D in tr an sf r o m in gb a et er i u m2 0 0 3
H a sh i s王 f t er or Z m g /L z e at in tr an sf or m in gb a etr e i u m8 2 2 2 7 5
.
28
T M一喊 G·
m ed i u0 m
,
lm g / L 2
.
4 D i n t r a n f o r m i n g b a e t e r i u m I0 0 0
一
f t a n s 一 ’
S U S h u fe r e d Zm g / L z e a t i n t r a n s fo r m i n g b a e t e r i u m 3 9 5 12
.
8 2
t o M S Om e d i u m 0
.
1m g / L 2
.
4 D i n t r a n s f o r m i n g b a e t e r i u m l 0 0 0
4期 徐香玲等 : 利用发根农杆菌介导二元载体向番茄导人夕院蛋基因的研究
无菌苗用沾有转化子菌液的剪刀 , 从子叶柄处切断 , 子叶表面向下放在含 1m g / 1玉
米素和 0 . Zm g / 1赤霉素的 T M 一 4 G 培养基上 , 2一 3 周在子叶柄切 口处形成白色的或淡黄
色的愈伤组织 (图 5) , 或按 Sha hi n 的方法感染子叶切块 , 毛状根切段 , 放在含 50 m g/ 1卡
那霉素和 50 m g / 1梭节青霉素的 T M 一 4G 愈伤组织诱导培养基上 , 经 2一 3周在感染点上
形成愈伤组织 (表 4) 。
三 、 再生植株的诱导
用转化子菌液感染胚轴 , 子叶节 , 胚轴顶端均可诱导出不定芽 (图 3) , 待不定芽长到适
宜大小时切下除菌 , 置于 1 /ZM S 生根培养基上 , 可获得再生植株 , 经滤纸电泳检测 , 有
37
.
5% 的再生植株有农杆碱与甘露碱 。
以卡那霉素抗性筛选的子叶切块 , 毛状根切段 , 子叶柄切口的愈伤组织 , 切下后转人
T M 一 4 G
.
M S 或含 Zm g/ 1玉米素的 M S O 培养基上 , 可诱导出不定芽 (表 5) , 移人含
0
.
l m g / BI A 的 T M 一 5 培养基或 1 /ZM S 培养基上生根获得再生植株 (图 6 . 7) , 再生植株经
滤纸电泳检测 , 有 57 % 的植株含有农杆碱与甘露碱 。
四 、 P C R 检测结果
将上述经滤纸电泳检测含有农杆碱和甘露碱的再生植株 。 提取总 D N A 做模板 , 设计
并合成四个前导引物 , 进行 P C R 反应 , 琼脂糖凝胶电泳检测 , 在 0 . SK b 处扩增的为 N P T
n 带 (图 8) 。 说明 P B T C 一 8 质粒 D N A 已导人再生植株 。
五 、 斑点免疫结合法 ( D BI )A 检测结果
对子叶切块愈伤组织的再生植株 , 进行斑点免疫结合法 ( D BI )A 检测 , 结果表明无论
是用 T M V 抗血清 , 还是用 CM V 抗血清进行配合检测 , 均获得阳性反应 (图 10) 。 检测
T M V 外壳蛋白将再生植株粗提液稀释到 1:4 0 时仍有明显的阳性反应 。 证明 T M V 一 C P 和
CM V 一 C P 两个基因均已导人 , 并有表达产物外壳蛋白的存在及免疫反应 。
讨 论
一 、 发根农杆菌的 R i质粒 ( R o o t in d u e i n g P l a s m id ) , 可直接做为中间载体 , 将外源
基因导人受体 。 iR 质粒诱导的毛状根可通过器官发生途径再生植株 , 亦可通过愈伤组织产
生不定胚或不定芽途径再生植株 。 毛状根是单细胞起源的 , 对毛状根再生植株有性生殖后
代插人的 T 一 D N A 进行遗传分析 , 发现分离类型只与母本植株的一个克隆组成一致 。 由
于毛状根具有这一特点和诱导的再生植株特异表型 , 为转化株的筛选提供方便 .
二 、 用胚轴 , 子叶节注射 , 胚轴顶端切 口涂抹 , 子叶穿刺 , 子叶柄切 口感染等方法均
可诱导毛状根的发生 , 其频率为 n 一 10 % 。 诱导频率与外植体类型 , 感染菌液 , 培养基
种类以及感染方法 , 培养条件有关 , 诱导的毛状根经沪纸电泳检测有 50 % 以上含有农杆
碱与甘露碱 。 由于 P B T C 一 8 质粒具有卡那霉素 ( k m ) 和壮观霉素 ( s p c) 的选择标记 ,
还可用含 50 一 10 0m g / 1 卡那霉素的无激素 M S 选择培养基对转化的毛状根进行抗性筛
选 。 感染子叶切块 , 子叶柄 。 毛状根切段在含 50 m g 71 卡那霉素和 50 m g / 1梭节青霉素的
T M 一 4 G 愈伤组织诱导培养基上 , 可获得抗性愈伤组织 , 转人 T M 一 4G , M S 或含 Zm g / 1
玉米素的 M S O 培养基上 , 诱导出不定芽 。 su hk ap in d a 等 〔 12 〕 报道用子叶切块穿刺得
到的愈伤组织是来自一个转化细胞 , 同一愈伤组织上的不定芽 , 将其插人的 T 一 D N A 作
植 物 研 究 1 4卷
为分子标记进行分析 , 从分子杂交结果看 , 同一愈伤组织上的不定芽有相同带型 , 表明愈
伤组织起源于一个细泡 , 对子一代进行分析 , 发现插人的 T 一 D N A 标记性状分离是 3 :
l
。 因此用 iR 质粒导人外源基因 , 通过诱导毛状根和愈伤组织途径是容易产生纯合的不定
芽与再生植株的 。
三 、 感染子叶节 , 胚轴 , 胚轴顶端切口除诱导出毛状根之外亦可诱导出不定芽 , 诱导
不定芽的频率为 7一 19% , 待不定芽长到适宜大小后切下 , 转人含 50 一 10 Om g / 1卡那霉素
的 1 /2M S 培养基上 , 可生根获得再生植株 , 经滤纸电泳检测有 30 % 左右的再生植株含有
农杆碱与甘露碱 , 说明有 iR 质粒的 T R 一 D N A 导人 . D a m g a dr 〔 7 〕 曾报道感染带根
油菜下胚轴 , 14 天后切去根再进行 6一 8 天培养 , 在感染点诱导出不定芽 , 其频率为 19
一 58 % 。 经检测有 9一 30 % 的芽含有冠瘦碱 , 他认为这是由于 iR 质粒感染提高了细胞的
激素水平 , 有利于转化细胞的分化而形成不定芽 .
四 、 斑点免疫结合法 ( D 1B )A 检测 : 可确定转化植株中是否有病毒外壳蛋白的存在 ,
即导人的病毒外壳蛋基因是否 已表达 . 这种方法是在酶联免疫法 E U SA 基础上仿照分子生
物学点杂交的方法发展起来的 , 最早用于检测单克隆抗体 , 后来有人用来检测 T M V , 获得
较理想的结果 , 对提纯的 T M V 的最低检示率可达 0 . 184n g八 方法简便 , 并有很强的专一
性 , 实验结果表明 , 对经过冠瘦碱检测与抗性筛选的植株 , 斑点免疫结合法 ( D I B )A 检
测 , 均获得阳性反应 , 有 T M V 一 C P 和 CM V 一 C P基因产物两种外壳蛋白的存在 .
A B S T R A C I
,
U s in g A g r o b a e t e ir
u m r h i z o g e n e s w i t h R i一 P l s m id (P R认4 b ) t o b e m e d iu m , t he
b i n a yr
v e e t o r P BT C S (T 一 D N A w i t h CM V 一 e P a dn T M V 一 e P g e n e s ) w a s t arn
s fo r -r
e d i n t o e u l t i v a t e d t o m a t o o f H e i l o n自i a n g P r o v in e e . hT e m e th o d o f 场 P o e o t y l ,
a P i e a l h a l f o f ℃ P i e o t y l a n d e u t t ign e o t y l e d o n s e e t i o n s w a s u s e d t o in d u e t h a iyr
r o o t s
.
A g r o P i o n a n d m a n
o P in e w e r e d e t e e t e d in h a l f o f t h e s e h al yr r o o t s b y
e l e e t r o P h o r e s
.
S o m e h a iyr r o o t s w e r e g e t b y t h e m e t h o d o f s d l e e t i o n m e d i u m w i t h
k a n o m y e i n e r e s i s t a n e e
.
T h e a d v e n t i t i o u s b u d a n d r e g e n e r a t i o n P l a n t w e r e i n d u e e d
fr o m e u l l u s w i t h k a n o m y e i n e r e s i s t a n e e o n i n fe e t e d e o t y l e d o n P i e e e
.
D e t e e t i n g t h e
a lk a l o id
,
P C R a n d D I BA (D o t Im m u n o b i n d i n g A s s y )
,
i t e e rt i fl e d t h e r e w e r e T M V 一 e P
a n d C M V 一 e P g e n e s , A g r o Pi o n a n d m a n n o Pi n i n t h e r e g e n e r a t i o n Pl a n t W e g o t
d e u b l e t r a s l a t i v e P l a n t
.
K e y w o r ds R i P l a s m id
,
T o m a t o
,
T M V 一 e P a n d C M V 一 e P g e n e s
.
参 考 文 献
〔 l 〕 郑先宇等 : 病毒学报 4 ( 2 ) 1 50一 1 55 1988
〔 2 〕 李红卫等 : 哈尔滨师范大学硕士生学位论文 19 9 2
〔 3 〕 徐香玲等 : 生物技术 l (4 ) 1 7一 2 1 19 9 1
〔 4 〕 艾金兰等 : 遗传学报 加 ( 3 ) 24 5一 25 2 19 9 3
〔 5 〕 加藤郁之道 : 蛋白质 、 核酸 、 醉素 35 , 29 5 7 一 2 7 5 19 9 0
〔 6 〕 谦田博等 : 组织培养 13 ( 6 ) 18 4一 19 2 19 8 7
〔 7 〕 D a m g a r d . 0 . e t a l : P la n t M 0 1 . 17 : l 一 8 19 9 1
4期 徐香玲等 : 利用发根农杆菌介导二元载体向番茄导人夕院蛋基因的研究 4 2 3
〔 8 〕 M or gan . A. J . P
〔 9〕 O on o. B . Y. et. al : JP n . J . G en t2 6 : 0 5 1一 0 5 5 18 9 7
〔 10 〕 R ob al g ia. C. et. al : B ie o` h im ie6 9: 2 3 1一 2 3 7 18 9 7
〔 1 1〕 St o g ar d, J . e t a l :m o l . G e n t 2 07 : 2 5 1一 2 55 1987 .
〔 1 2 〕 S u k h a P in d a . k . e t a l M o l . G e n G e n t 加 6: 4 9 1一 4 97 198 1
图 版 说 明
P la te
1 H a r iry r o o t s w e r e i n d u e re d fr o m a P ie a l h . lf o f e iP e o ty l
.
2 H a ir y r o o t s v\e
r e in d u e t e d e P i e o t y l
.
3 A d代 n t i t i o u s b u d vte r e in d u e t e d fr o m a P ie a l h a lf o f e iP e o ty l .
4 H a ir y r o o t s
.
5 C
a l !u s
.
6
、
7 R e g e n e r a t i o n P l a n t
.
8 P C R d e t e e t io n
.
9 D e t e e t io
n o f P a P e r e le e t r iP h o r e s is :
a
.
b
.
e : h a i ry r o o t s
.
d : r e g e m e r a t i o n P la n t
.
e : e a l! U S
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g : ca llu s
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h : c o n r r o l
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15C10 O I BA
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a : e o n t r o l
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b
: t r a n s fo r m in g P l a n t po s ivi ve
r e a e t i o n
.