全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ２０１５ꎬ ４２(５): ８４１ － ８４７ ＤＯＩ: １０􀆰 １３８０２ / ｊ. ｃｎｋｉ. ｚｗｂｈｘｂ. ２０１５􀆰 ０５􀆰 ０２１
基金项目:国家现代农业产业技术体系北京市西甜瓜创新团队专项ꎬ北京市农林科学院创新能力建设专项(ＫＪＣＸ２０１４０１１１)ꎬ国家科技
支撑计划项目(２０１１ＢＡＤ３５Ｂ０７)
∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ)ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｇｅｎｇｌｉｈｕａ＠ ｎｅｒｃｖ. ｏｒｇꎬ Ｔｅｌ: ０１０￣５１５０３０９４
收稿日期: ２０１４ － １１ － ２６
黄瓜绿斑驳花叶病毒在葫芦上的种传规律
及热处理效果评价
宋顺华１ꎬ２ 　 吴　 萍１ꎬ２ 　 宫国义１ꎬ２ 　 孟淑春１ 　 耿丽华１∗
(１.北京市农林科学院蔬菜研究中心ꎬ 农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室ꎬ 农业部都市农业
(北方)重点实验室ꎬ 北京 １０００９７ꎻ ２.北京京研益农科技发展中心ꎬ 北京 １０００９７)
摘要: 为明确黄瓜绿斑驳花叶病毒(Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬＣＧＭＭＶ)在葫芦上的种传规
律ꎬ以西瓜砧木葫芦种子为材料ꎬ采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ)、反转录聚合
酶链式反应(ＲＴ￣ＰＣＲ)与生物学检测相结合的方法研究葫芦种子的带毒率和传毒率的关系ꎬ并评
价了干热处理对病毒的钝化效果ꎮ 结果表明ꎬＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ灵敏度检测种子时ꎬ在感染种子研磨液 ∶
健康种子研磨液为１∶ １ ０００ 时ꎬ带毒量仍能检测出阳性ꎬＲＴ￣ＰＣＲ 和 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ 两种方法均能准确
检测葫芦种子的带毒情况ꎻ６ 个批次的葫芦种子有 ４ 个批次呈阳性ꎬ带毒率在 ０ ~ １００％之间ꎬ贮藏
１ 年后的传毒率在 ０ ~ ５􀆰 ６％之间ꎻ４ 个为 ＣＧＭＭＶ阳性的种子批经干热处理后ꎬ仅 １ 株实生苗呈阳
性ꎮ 研究表明ꎬＣＧＭＭＶ在葫芦作物上的隐性带毒现象非常普遍ꎻ种子的带毒率高而传毒率低ꎬ以
表面带毒为主ꎬ且非常稳定ꎻ７２℃ ７２ ｈ干热处理葫芦种子能有效地钝化 ＣＧＭＭＶꎮ
关键词: 黄瓜绿斑驳花叶病ꎻ 葫芦种子ꎻ 带毒率ꎻ 传毒率ꎻ 干热处理
Ｓｅｅｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｏｎ ｇｏｕｒｄ ａｎｄ
ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｓｏｎｇ Ｓｈｕｎｈｕａ１ꎬ２ 　 Ｗｕ Ｐｉｎｇ１ꎬ２ 　 Ｇｏｎｇ Ｇｕｏｙｉ１ꎬ２ 　 Ｍｅｎｇ Ｓｈｕｃｈｕｎ１ 　 Ｇｅｎｇ Ｌｉｈｕａ１∗
(１. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｒｏｐｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｒｅａꎬ
Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｕｒｂａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ (Ｎｏｒｔｈ)ꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎻ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒꎬ
Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９７ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｊｉｎｇｙａｎ
Ｙｉｎｏｎｇ Ｓｃｉ￣Ｔｅｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９７ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｅｅｄ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｅｄ￣ｔｏ￣ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ (ＣＧＭＭＶ) ｏｎ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｒｙ ｈｅａｔ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡꎬ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ａ ｒａｔｉｏ ｏｆ １ / １ ０００
ｏｆ ＣＧＭＭＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ / ｈｅａｌｔｈｙ ｓｅｅｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｉｎｄｉｎｇ ｆｌｕｉｄ ｍｉｘｔｕｒｅｓ. Ｂｏｔｈ ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ＲＴ￣ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ
ｃｏｕｌｄ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ＣＧＭＭＶ ｆｒｏｍ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄ ｓｏａｋｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ. Ａｍｏｎｇ ｓｉｘ ｂａｔｃｈｅｓ ｏｆ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄｓꎬ ｆｏｕｒ
ｂａｔｃｈｅｓ ｏｆ ｓｅｅｄｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ０ － １００％ . Ａｆｔｅｒ ｏｎｅ ｙｅａｒ ｏｆ
ｓｔｏｒａｇｅꎬ ｔｈｅ ｓｅｅｄ￣ｔｏ￣ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ０ － ５􀆰 ６％ . Ｆｏｕｒ ｂａｔｃｈｅｓ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ
ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄｓ ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＧＭＭＶ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｄｒｙ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ( ＤＨＴ)ꎬ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇ
ａｐｐｅａｒｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＧＭＭＶ ｈｉｄｄｅｎ ｐｏｉｓｏｎ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｃｏｍｍｏｎ ｏｎ ｔｈｅ
ｇｏｕｒｄ ｃｒｏｐ. Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄ￣ｔｏ￣ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｗａｓ ｌｏｗ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ
ｈｉｇｈꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｍａｉｎｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｅｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｖｅｒｙ
ｓｔａｂｌｅ. ＣＧＭＭＶ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｐａｓｓｉｖａｔｅｄ ｏｎ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ＤＨＴ ｍｅｔｈｏｄ ａｔ ７２℃ ｆｏｒ ７２ ｈ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ (ＣＧＭＭＶ)ꎻ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄꎻ ｓｅｅｄ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅꎻ ｓｅｅｄ￣
ｔｏ￣ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｒａｔｅꎻ ｄｒｙ ｈｅａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
　 　 黄瓜绿斑驳花叶病(Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａ￣
ｉｃ ｖｉｒｕｓꎬＣＧＭＭＶ)是葫芦科植物上的重要病害ꎬ最早
在英国发现报道(Ａｉｎｓｗｏｒｔｈꎬ１９３５)ꎬ目前已分布于
２０ 多个国家和地区(冯兰香等ꎬ２００７)ꎮ 中国口岸检
疫部门最早从日本引进的种苗中检测到该病毒ꎬ目
前在我国广西、辽宁、河北、山东、湖北、广东和北京
等很多地区也都发现了疫情ꎮ ２００６ 年 １２ 月 ２１ 日
我国农业部颁布第 ７８８ 号公告ꎬ将黄瓜绿斑驳花叶
病毒列为全国检疫性的有害生物(２００７)ꎮ ＣＧＭＭＶ
是一种重要的种传病毒 ( Ｃｈｏｉꎬ ２００１ꎻ吴会杰等ꎬ
２０１１)ꎬ带毒种子是病毒远距离传播的主要途径ꎬ也
是葫芦科植株生长早期病毒最有效的感染途径ꎮ 目
前由于引种量和制种基地面积迅速增长ꎬ病毒随种
子传播的风险越来越高ꎬ给我国西瓜及甜瓜生产造
成了严重的威胁ꎮ 因此ꎬ加强种子检测、生产和使用
无毒的种子是防治该病害最有效的方法ꎮ
目前血清学及分子生物学是快速检测 ＣＧＭＭＶ
的主要方法ꎬ酶联免疫吸附测定( ｅｎｚｙｍｅ￣ｌｉｎｋｅｄ ｉｍ￣
ｍｕｎｅ ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙꎬＥＬＩＳＡ)、反转录聚合酶链式反应
( ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ￣ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎꎬ ＲＴ￣
ＰＣＲ)和免疫捕获反转录聚合酶链式反应( ｉｍｍｕｎｏ￣
ｃａｐｔｕｒｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ￣
ｔｉｏｎꎬＩＣ￣ＲＴ￣ＰＣＲ)已被广泛应用于进出口种子携带
ＣＧＭＭＶ的检测(Ｋｉｍ ＆ Ｌｅｅꎬ２０００ꎻＫｉｍ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００３ꎻ
黄静等ꎬ２００９)ꎬ邓从良等(２００９)还建立了实时荧光
ＰＣＲ技术ꎮ 这些方法在检测大批量商品种子时均
存在研磨种子的困难ꎻＲＴ￣ＰＣＲ 费时、费力ꎬ且检测
费用较高ꎮ 在病害防治上ꎬ热水和干热处理种子一
直是钝化病毒最有效的方法(Ｄａｗｓｏｎ ＆ Ｋｕｈｎꎬ１９７４ꎻ
Ｋｉｍ ＆ Ｌｅｅꎬ２０００)ꎬ日本和韩国采取以干热处理为主
的综合防治措施ꎬ成功控制了 ＣＧＭＭＶ 的发生与流
行(蔡明等ꎬ２０１０)ꎬ但其钝化病毒的原理还不清楚
(Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００３)ꎻＰａｒｋ ｅｔ ａｌ. (２００５)首次报道了通
过转基因技术育成 ＣＧＭＭＶ 的抗性砧木ꎬ而其推广
应用还未见报道ꎮ
近年来ꎬ已有不少研究报道 ＣＧＭＭＶ 葫芦科种
子带毒率和传毒率的关系ꎮ 黄瓜 ＣＧＭＭＶ带毒种子
收获后保存 １ 个月ꎬ传毒率为 ８％ ꎬ在保存 ５ 个月后
传毒率由 ８％降到了 ０􀆰 １％ (Ｈｏｌｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ. ꎬ１９７５)ꎻ
当人工接种后ꎬ西瓜种子的带毒率为 １００％ ꎬ传毒率
为 ２􀆰 ２５％ (吴会杰等ꎬ２０１１)ꎻ葫芦种子 ＣＧＭＭＶ 的
带毒率达到 １００％时ꎬ其植株发病率分别为 ０􀆰 ９１％
和 １􀆰 １２％ (秦碧霞等ꎬ２００９)ꎻＣＧＭＭＶ感染瓠瓜种子
带毒率为 ８４％ ꎬ传毒率为 ２％ (Ｃｈｏｉꎬ２００１)ꎮ 不同的
病毒株系和环境条件差异会对种子的传毒率等种传
规律产生较大的影响(Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００８)ꎬ但葫芦
种子在这方面的相关研究鲜少ꎮ
已有研究表明ꎬ在西瓜大量采用嫁接栽培技术
的生产方式下ꎬ该病毒主要通过砧木种子带毒传播ꎬ
自然条件下西瓜种子很少带毒ꎬ甚至不带毒(蔡明
等ꎬ２０１１)ꎮ 葫芦砧木是 ＣＧＭＭＶ 的易感作物ꎬ因为
种子携带 ＣＧＭＭＶ非常普遍ꎬ导致生产上大量采用
南瓜代替葫芦作为西瓜的砧木ꎬ但以葫芦作为砧木
所生产的西瓜甜度和口感等品质更好ꎬ有着南瓜作
为砧木不可替代的优点ꎮ 本研究以不同带毒率的葫
芦种子作为材料ꎬ旨在了解葫芦种子带毒和传毒的
规律ꎻ采用不同种子处理方法检测葫芦种子以明确
检测种子的灵敏度ꎬ以期为商品葫芦种子提供准确、
简便的检测程序ꎻ并通过实生苗评价干热处理对病
毒的钝化效果ꎬ为带毒葫芦种子提供可行的种子处
理和病毒钝化效果评价方法ꎬ对从源头控制该病害
的蔓延和流行提供一定的理论基础ꎮ
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试品种:５ 个品种共 １２ 个批次的葫芦种子
为:京欣砧胜、京欣砧优和京欣砧冠各 ３ 个批次、京
欣砧王 ２ 个批次、京欣砧 １ 号 １ 个批次ꎬ均由北京市
农林科学院蔬菜研究中心提供ꎮ
试剂:ＣＧＭＭＶ 的抗体ꎬ美国 Ａｇｄｉａ 公司ꎻＲＮＡ
提取试剂盒、Ｍ￣ＭＬＶ反转录酶、ＲＮＡｓｉｎ 抑制酶、１００
ｂｐ ＤＮＡ标准分子量、ＣＧＭＭＶ 特异性引物及其缓冲
液ꎬ北京赛百盛基因技术有限公司ꎻＴａｑ ＤＮＡ 聚合
酶、ｄＮＴＰｓꎬ北京泽星生物科技有限公司ꎻ其它试剂
均为国产分析纯ꎮ
仪器: ＭＫ３ 酶标仪ꎬ芬兰 Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｒｍｓ
２４８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ(雷勃)公司ꎻＧｅｎｅＡｍｐ ９７００ ＰＣＲ 扩增仪ꎬ
美国 ＡＢＩ 公司ꎻ５５００ 自动凝胶成像仪ꎬ美国 Ａｌｐｈａ
Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎꎻ２１００Ｌ种子干热处理机ꎬ韩国高
丽器械株式会社ꎮ
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ方法检测葫芦种子
按照 Ｋｏｅｎｒａａｄｔ ＆ Ｒｅｍｅｅｕｓ (２０１４)方法进行ꎮ
将 ５ 个品种共 １２ 个批次的葫芦种子ꎬ按种子重量
(ｇ)与样品提取缓冲液体积(ｍＬ)为 １ ∶ １０ 的比例充
分研磨种子配制成样品提取液ꎬ样品提取缓冲液为
Ｎａ２ＳＯ３ １􀆰 ３ ｇ、ＰＶＰ￣４０ ２０ ｇꎬ用 ｐＨ ７􀆰 ４ 的磷酸盐吐温
缓冲液( ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｗｅｅｎ － ２０ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎꎬＰＢＳＴ)
定溶至 １ Ｌꎮ 用酶标仪读取 ＯＤ４０５ꎬ当(样品 ＯＤ４０５ －
空白 ＯＤ４０５) / (阴性对照 ＯＤ４０５ －空白 ＯＤ４０５)≥２􀆰 ０
时ꎬ判定样品为阳性ꎬ否则为阴性ꎮ 阴性对照为经
ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ检测为阴性的种子ꎬ空白对照以样品提
取缓冲液代替样品提取液ꎮ
灵敏度检测:取带毒率为 １００％的京欣砧胜种
子ꎬ按种子重量(ｇ)与样品提取缓冲液体积(ｍＬ)为
１ ∶ １０ 的比例充分研磨种子ꎬ用相同比例健康种子的
研磨液将带毒种子的研磨液分别稀释成 １ ∶ １０、１ ∶
２０、１∶ ５０、１∶ １００、１∶ ２００、１∶ ３００、１∶ ５００ 及 １∶ １ ０００ꎬ读
取各稀释液的 ＯＤ４０５ꎬ重复 ３ 次ꎬ计算各稀释液的平
均 ＯＤ４０５ꎮ
不同种子处理方法对 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ 检测结果的
影响:取带毒率为 １００％的京欣砧胜种子ꎬ共 ４ 种处
理方法ꎬ即单粒种子研碎、单粒种子浸泡 １ ｈ、单粒种
仁研碎及单粒种仁浸泡 １ ｈꎮ 浸泡液或研磨液均为
样品提取缓冲液ꎬ种子重量(ｇ)与缓冲液体积(ｍＬ)
的比例为 １ ∶ １０ꎮ 每种处理检测 １０ 粒种子ꎬ读取每
粒种子的 ＯＤ４０５ꎬ计算 １０ 粒种子平均 ＯＤ４０５ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２ ＲＴ￣ＰＣＲ方法检测葫芦种子
采用以下 ３ 种方法分别提取种子中的总 ＲＮＡꎬ
并比较不同提取方法对 ＲＴ￣ＰＣＲ 结果的影响ꎮ 方法
１:取带毒率为 １００％的京欣砧胜葫芦种子 １０ 粒ꎬ每
粒种子取半粒单独研碎并提取总 ＲＮＡꎻ方法 ２:剩余
的 １０ 个半粒种子分别加 ０􀆰 ５ ｍＬ无菌水浸泡 １ ｈꎬ从
每半粒种子的浸泡液中吸取 １００ μＬ加入 ４００ μＬ 提
取液提取总 ＲＮＡꎻ方法 ３:同时再从每半粒种子的浸
泡液中吸取 ５ μＬ粗提 ＲＮＡꎮ 取 １００ ｍｇ子叶或真叶
提取葫芦幼苗的总 ＲＮＡꎮ 种子和叶片的总 ＲＮＡ 提
取按照 ＲＮＡ 提取试剂盒上的方法进行ꎬＲＮＡ 粗提
液的提取方法为:将 ５ μＬ 浸泡液与 ０􀆰 ５ ｍｏｌ / Ｌ
ＮａＯＨ ５ μＬ溶液混合均匀ꎬ培育 ５ ｍｉｎꎬ然后从中吸
取 １０ μＬ提取液加入到 １００ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ 缓冲
液 (ｐＨ ８􀆰 ０) ４９０ μＬ中变性ꎬ作为 ＲＮＡ粗提液ꎮ 以
提取的 ＲＮＡ 反转录为 ｃＤＮＡꎬ作为特异性 ＰＣＲ 的
模板ꎮ
ＰＣＲ 的上游引物为 ＣＧＭＭＶ１: ５′￣ＣＧＴＧＧＴＡ￣
ＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣＴＡＡＡＣＣＴＣ￣３′ꎬ 下游引物 为 ＣＧＭ￣
ＭＶ２: ５′￣ＣＣＧＣＡＡＡＣＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＣＧ￣３′ꎬ 产 物
大小 ６５４ ｂｐꎮ ＲＮＡ的反转录和特异性 ＰＣＲ 反应体
系和步骤按 ＳＮ / Ｔ ２３４４￣２００９ 检疫行业标准的方法
进行(陈青等ꎬ２００９)ꎮ 反应产物在 １􀆰 ２％的琼脂糖
凝胶上电泳检测ꎬ在自动凝胶成像仪上观察拍照ꎬ记
录结果ꎬ扩增结果产生大小为 ６５４ ｂｐ 的片段时判断
为阳性ꎬ否则为阴性ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３ 种子带毒率和传毒率的检测
采用 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ方法检测种子的带毒率:从每
个批次取 １００ 粒种子ꎬ１０ 粒种子为 １ 个样品ꎬ每个
批次种子检测 １０ 个样品ꎬ其中只要有 １ 个样品为阳
性ꎬ这个种子批即为阳性ꎮ 对结果为 ＣＧＭＭＶ 阳性
的种子进行种子带毒率检测ꎬ每个种子批检测 １００
粒种子ꎬ计算种子的带毒率ꎬ重复 ３ 次ꎮ 种子带毒
率 ＝阳性种子数量 /检测种子数量 × １００％ ꎮ
采用生物学方法检测种子的传毒率:将葫芦种
子单粒播种在营养钵内的灭菌土中ꎬ置于玻璃防虫
温室内ꎬ在温度为 ２５ ~ ３４℃的条件下培养ꎮ 出苗后
每周观察实生苗的发病症状ꎬ对有可疑症状的实生
苗逐株取样进行 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ检测ꎻ待实生苗长至四
叶期ꎬ对其它无可疑症状的实生苗取样ꎬ即从无可疑
症状的每株实生苗上取一小块叶片ꎬ１０ 块叶片作为
１ 个样本进行 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ 检测ꎬ对阳性的样本进行
单株检测ꎬ采用 ＲＴ￣ＰＣＲ验证ꎮ 每个种子批播种 ４００
粒种子ꎮ 统计 ＣＧＭＭＶ 的阳性株数ꎬ计算带毒种子
的传毒率ꎮ 带毒种子传毒率 ＝阳性幼苗株数 /生长
的幼苗株数 × １００％ ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４ 种子干热处理
干热处理方法是将种子置于干热处理机内ꎬ分
别按 ３５℃ ２４ ｈ、５５℃ ２４ ｈ、７２℃ ７２ ｈ进行干热处理
后ꎬ关闭电源ꎬ２４ ｈ 后取出种子ꎬ种子保存于 ６℃保
存箱内ꎮ 采用生物学方法检测干热处理钝化 ＣＧＭ￣
ＭＶ的效果ꎬ方法同 １􀆰 ２􀆰 ３ꎬ华欣砧优播种 ４００ 粒种
子ꎬ京欣砧 １ 号播种 ７８０ 粒种子ꎬ其余每个种子批播
种１ ０００粒种子ꎮ
１􀆰 ３ 数据分析
利用 ＳＰＳＳ １３􀆰 ０ 软件中的单方差分析模型
( ｏｎｅ￣ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｍｏｄｅｌ)对试验数据进行统计分
３４８５ 期 宋顺华等: 黄瓜绿斑驳花叶病毒在葫芦上的种传规律及热处理效果评价
析ꎬ用 ＳＮＫ(Ｓｔｕｄｅｎｔ￣Ｎｅｗｍａｎ￣Ｋｅｕｌｓ)法进行差异显著
性检验ꎮ
２ 结果与分析
２􀆰 １ ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ方法对葫芦种子的检测
ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ方法检测种子带毒的灵敏度较高ꎬ
带毒量在感染种子与健康种子研磨液体积比为 １ ∶
１ ０００时仍能检测出 ＣＧＭＭＶ阳性结果(表 １)ꎮ
表 １ ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ检测葫芦种子的灵敏度
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄｓ
稀释倍数 Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ＣＧＭＭＶ ＯＤ４０５ Ｉ / Ｈ
１ ∶ １０ ０􀆰 ９６０ ± ０􀆰 ０４６ ａ １４􀆰 ３１
１ ∶ ２０ ０􀆰 ７８４ ± ０􀆰 ０３７ ｂ １１􀆰 ４７
１ ∶ ５０ ０􀆰 ６３８ ± ０􀆰 ０２１ ｃ ９􀆰 １１
１ ∶ １００ ０􀆰 ５１１ ± ０􀆰 ０１８ ｄ ７􀆰 ０６
１ ∶ ２００ ０􀆰 ４４４ ± ０􀆰 ０１９ ｅ ５􀆰 ９８
１ ∶ ３００ ０􀆰 ３６１ ± ０􀆰 ００７ ｆ ４􀆰 ６５
１ ∶ ５００ ０􀆰 ３４８ ± ０􀆰 ０１８ ｆｇ ４􀆰 ４４
１ ∶ １ ０００ ０􀆰 ３０６ ± ０􀆰 ００９ ｇ ３􀆰 ７６
阴性对照 Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＣＫ ０􀆰 １３５ ± ０􀆰 ００６ ｈ —
空白对照 Ｂｌａｎｋ ＣＫ ０􀆰 ０７３ ± ０􀆰 ００７ ｉ —
　 　 表中数据为平均数 ±标准误ꎮ 同列数据后不同小写字母表
示经 ＳＮＫ法检验在 Ｐ < ０􀆰 ０５水平差异显著ꎮ Ｉ为样品 ＯＤ４０５与空
白对照 ＯＤ４０５之差ꎻ Ｈ为阴性对照 ＯＤ４０５与空白对照 ＯＤ４０５之差ꎮ
Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＥ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ < ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ＳＮＫ ｔｅｓｔ. Ｉ: Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ
ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ’ ｓ ＯＤ４０５ ｖａｌｕｅ ｍｉｎｕｓ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ＣＫ ｓａｍｐｌｅ’ ｓ
ＯＤ４０５ ｖａｌｕｅꎻ Ｈ: ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ’ｓ ＯＤ４０５ ｖａｌｕｅ ｍｉ￣
ｎｕｓ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ＣＫ ｓａｍｐｌｅ’ｓ ＯＤ４０５ ｖａｌｕｅ.
对葫芦种子进行不同处理发现研磨种子的方法
能得到更高的 ＯＤ４０５ꎬ以研磨整粒种子的 ＯＤ４０５最高ꎬ
但检测结果在不同处理方法之间是一致的ꎬ即均呈
现阳性ꎬ种子的 ＣＧＭＭＶ带毒率为 １００％ (表 ２)ꎮ 同
时也说明研磨种子方法能充分释放出种子内外的病
毒ꎬ可以提高 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ检测的准确度ꎮ
２􀆰 ２ ＲＴ￣ＰＣＲ方法对葫芦种子的检测
采用 ＲＴ￣ＰＣＲ 技术对 ３ 种方法提取的种子总
ＲＮＡ的检测结果表明ꎬ从研磨种子和浸泡液中提取
的种子总 ＲＮＡꎬ均能得到与预期大小一致的 ６５４ ｂｐ
清晰的特异性条带ꎬ而从种子 ＲＮＡ粗提取液中没有
得到特异性条带(图 １)ꎮ
２􀆰 ３ 种子的带毒率和传毒率的关系
生物学方法结合 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ 和 ＲＴ￣ＰＣＲ 技术
检测了 ６ 份葫芦种子样品的带毒率(３ 个品种)和 ５
份带毒种子样品的传毒率(表 ３)ꎮ 葫芦种子的带毒
率为 ０ ~ １００％ ꎬ传毒率为 ０ ~ ５􀆰 ６％ ꎬ平均为 １􀆰 ８６％ ꎮ
大部分检测结果为阳性的植株都不表现任何症状ꎮ
表 ２ 不同种子处理方法对 ＥＬＩＳＡ结果的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｅｄ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｂｙ ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ
种子处理方法
Ｓｅｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
检测结果∗
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ∗
ＯＤ４０５ Ｉ / Ｈ
单粒种仁浸泡
Ｓｅｅｄ ｋｅｒｎｅｌ ｓｏａｋｉｎｇ
１０ / １０ ０􀆰 ６９９ ９􀆰 ６７
单粒种子浸泡
Ｓｅｅｄ ｓｏａｋｉｎｇ
１０ / １０ ０􀆰 ７４０ １０􀆰 ３１
单粒种仁研磨
Ｓｅｅｄ ｋｅｒｎｅｌ ｇｒｉｎｄｉｎｇ
１０ / １０ ０􀆰 ８２８ １１􀆰 ６９
单粒种子研磨
Ｓｅｅｄ ｇｒｉｎｄｉｎｇ
１０ / １０ １􀆰 ５１８ ２２􀆰 ４７
阳性对照
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＣＫ
— ２􀆰 ５１８ —
阴性对照
Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＣＫ
— ０􀆰 １４４ —
空白对照
Ｂｌａｎｋ ＣＫ
— ０􀆰 ０８０ —
　 　 ∗: 阳性种子数 /检测种子总数ꎻ Ｉ: 阳性样品的 ＯＤ４０５与空
白对照 ＯＤ４０５之差ꎻ Ｈ: 阴性对照 ＯＤ４０５与空白对照 ＯＤ４０５之差ꎮ
∗: Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ / ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｅｅｄ ｓａｍｐｌｅｓꎻ
Ｉ: ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ’ｓ ＯＤ４０５ ｖａｌｕｅ ｍｉｎｕｓ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ＣＫ
ｓａｍｐｌｅ’ｓ ＯＤ４０５ ｖａｌｕｅꎻ Ｈ: ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ’ｓ ＯＤ４０５
ｖａｌｕｅ ｍｉｎｕｓ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ＣＫ ｓａｍｐｌｅ’ｓ ＯＤ４０５ ｖａｌｕｅ.
图 １ 不同种子 ＲＮＡ提取方法对 ＲＴ￣ＰＣＲ结果的影响
Ｆｉｇ. １ Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｅｄ ＲＮＡ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ＲＴ￣ＰＣＲ
ａ: 种子研磨ꎻ ｂ: 种子浸泡液ꎻ ｃ: 种子浸泡液粗提ꎻ Ｍ:
１００ ｂｐ ＤＮＡ 标准分子量ꎻ １: 阳性对照ꎬ ２: 健康种子ꎬ ３ ~
１２: １０ 粒样品种子ꎮ ａ: Ｓｅｅｄ ｇｒｉｎｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ＲＮＡꎻ ｂ: ｓｅｅｄ
ｓｏａｋｉｎｇ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ＲＮＡꎻ ｃ: ｓｅｅｄ ｓｏａｋｉｎｇ ｆｏｒ ｒｕｓｈ ＲＮＡꎻ Ｍ: １００
ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ １: ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＣＫꎻ ２: ｈｅａｌｔｈｙ ｓｅｅｄꎻ ３ － １２: １０
ｓｅｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ. 　
４４８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
表 ３ ＣＧＭＭＶ种子带毒率和传毒率的关系
Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｅｅｄ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｅｄ￣ｔｏ￣ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＧＭＭＶ
样品
Ｓａｍｐｌｅ
种子带毒率
Ｓｅｅｄ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ
(％ )
生物学检测结果 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
播种总数
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｓｏｗｎ ｓｅｅｄｓ
出苗数
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
阳性株数
ＣＧＭＭＶ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ
传毒率
Ｓｅｅｄ￣ｔｏ￣ｓｅｅｄｌｉｎｇ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｒａｔｅ (％ )
京欣砧胜￣１
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｓｈｅｎｇ￣１
１００ ± ０􀆰 ００ ４００ ３５７ ２０ ５􀆰 ６
京欣砧胜￣２
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｓｈｅｎｇ￣２
５０ ± ７􀆰 ８１ ４００ ３５４ ８ ２􀆰 ３
京欣砧优￣１
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｙｏｕ￣１
１４ ± ４􀆰 ３６ ４００ ３９３ ３ ０􀆰 ８
京欣砧优￣２
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｙｏｕ￣２
１０ ± ３􀆰 ６１ ４００ ３８３ ０ ０􀆰 ０
京欣砧冠￣１
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｇｕａｎ￣１
２５ ± ７􀆰 １０ ４００ ３１７ ２ ０􀆰 ６
京欣砧冠￣２
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｇｕａｎ￣２
０ ± ０􀆰 ００ — — — —
　 　 表中种子带毒率为平均数 ±标准误ꎮ Ｄａｔａ ｏｆ ｓｅｅｄ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｂｌｅ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＥ.
２􀆰 ４ 葫芦种子的干热处理
２􀆰 ４􀆰 １ 干热处理效果评价
对照处理和干热处理的葫芦种子分别出苗 ３５７
株和 ３４７ 株ꎬ幼苗生长至二叶期ꎬ对照处理中有 ２０
株的子叶出现退绿斑点症状ꎬ一个至多个退绿斑点
在子叶上呈随机分布ꎬ大小不等ꎬ均无凸起ꎬ子叶边
缘为波浪状ꎬ稍有畸形ꎬ叶片大小比正常叶片小ꎬ但
所有的真叶均表现正常ꎮ 对 ２０ 株实生苗分别采取
子叶和真叶进行 ＲＴ￣ＰＣＲ检测ꎬ结果 ２０ 株实生苗的
子叶全部为阳性(图 ２￣ａ)ꎬ１４ 株实生苗的真叶为阳
性(图 ２￣ｂ)ꎬ种子的传毒率为 ５􀆰 ６％ ꎮ 将对照其余的
实生苗和干热处理的实生苗进行定期分组取样检
测ꎬ生长至 ３ 个月的实生苗共检测 ３ 次ꎬ未再发现
ＣＧＭＭＶ阳性样品ꎮ
图 ２ 葫芦砧木子叶带症单株实生苗的检测结果
Ｆｉｇ. ２ Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｆｏｒｍ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｗｉｔｈ ＣＧＭＭＶ ｓｙｍｐｔｏｍ
ａ: ＲＴ￣ＰＣＲ检测子叶结果ꎻ ｂ: ＲＴ￣ＰＣＲ检测真叶结果ꎻ Ｍ: １００ ｂｐ ＤＮＡ标准分子量ꎻ １: 阳性对照ꎻ ２: 健康叶片ꎻ ３ ~ ２２: ２０株
子叶带症单株ꎮ ａ: ＲＴ￣ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎꎻ ｂ: ＲＴ￣ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｒｕｅ ｌｅａｆꎻ Ｍ: １００ ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ １: ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＣＫꎬ ２: ｈｅａｌｔｈｙ ｌｅａｆꎻ ３ － ２２: ２０ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｗｉｔｈ ＣＧＭＭＶ ｓｙｍｐｔｏｍ.
　
２􀆰 ４􀆰 ２ 干热处理对种子携带 ＣＧＭＭＶ的钝化效果
大批量干热处理 ６ 个批次(５ 个品种)的葫芦商
品种子经 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ 检测ꎬ有 ４ 个批次的种子为
ＣＧＭＭＶ阳性ꎮ 生物学方法结合 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ方法检
测干热处理对病毒的钝化效果ꎬ结果有 １ 株京欣砧
胜为阳性ꎬ其余所有品种的实生苗均为阴性(表 ４)ꎮ
５４８５ 期 宋顺华等: 黄瓜绿斑驳花叶病毒在葫芦上的种传规律及热处理效果评价
表 ４ 干热处理对葫芦种子的处理效果
Ｔａｂｌｅ ４ Ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＣＧＭＭＶ ｉｎ ｇｏｕｒｄ ｓｅｅｄｓ ｂｙ ＤＨＴ
样品
Ｓａｍｐｌｅ
京欣砧王￣１
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｗａｎｇ￣１
京欣砧王￣２
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｗａｎｇ￣２
京欣砧 １ 号
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎ １
京欣砧胜
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｓｈｅｎｇ
京欣砧冠
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｇｕａｎ
华欣砧优
Ｊｉｎｇｘｉｎｚｈｅｎｙｏｕ
种子
Ｓｅｅｄ
— ＋ ＋ ＋ — ＋
实生苗∗
Ｓｅｅｄｌｉｎｇ∗
０ / １ ０００ ０ / １ ０００ ０ / ７８０ １ / １ ０００ ０ / １ ０００ ０ / ４００
　 　 ∗: 阳性株数量 /检测总株数ꎻ ＋ : 阳性ꎻ —: 阴性ꎮ ∗: Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ / ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓꎻ ＋ : ｐｏｓｉｔｉｖｅꎻ
—: ｎｅｇａｔｉｖｅ.
３ 讨论
带毒种子是葫芦科作物发生 ＣＧＭＭＶ 病害的
主要初侵染源ꎬ加强种子检测是防治该病害的关
键措施之一ꎮ 本研究中 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ 方法能在种子
研磨液带毒量为带毒种子研磨液占健康种子研磨
液的 １ / １ ０００ 时检测出阳性ꎬ其灵敏度可以满足准
确检测大批量商品种子的要求ꎮ 在检测单粒种子
时ꎬ虽然研磨整粒种子的 ＯＤ４０５最高ꎬ但种子浸泡
液的结果与种子研磨液一致ꎬ可解决研磨种子的
难题ꎮ ＲＴ￣ＰＣＲ方法的灵敏度虽然比 ＥＬＩＳＡ 高ꎬ但
该方法中也存在研磨种子和提取高质量 ＲＮＡ的困
难ꎬＲＮＡ粗提取的方法提取的 ＲＮＡ 数量不足以产
生足够的模板ꎬ本研究采用种子的浸泡液提取
ＲＮＡ克服了种子研磨等困难ꎬ使得应用 ＲＴ￣ＰＣＲ
技术检测葫芦种子更加简便可行ꎮ 生物学检测方
法可以检测病毒的传染性与种子的传毒率ꎬ证明
病毒与病害发生的直接相关性ꎬ是种子处理后的
唯一检测方法ꎮ 但 ＣＧＭＭＶ 普遍存在带毒率高传
毒率低的情况ꎬ在样品的带毒率和传毒率都较低
时ꎬ则要以增加样品数量来提高检测的可信度ꎮ
以 ９５％的可信度检测带毒率为 ０􀆰 １５％的种子ꎬ检
测种子样品量应该在 ２ ０００ 粒以上( Ｋｏｅｎｒａａｄｔ ＆
Ｒｅｍｅｅｕｓꎬ２０１４)ꎬ费时、费力ꎬ需要较大的检测场
所ꎬ环境条件也影响结果的稳定性ꎮ 本试验结果
也表明ꎬ从带毒种苗子叶症状不明显ꎬ真叶不表现
症状ꎬ或子叶与真叶均不表现症状的幼苗上ꎬＤＡＳ￣
ＥＬＩＳＡ和 ＲＴ￣ＰＣＲ方法都能检测到 ＣＧＭＭＶ 阳性ꎬ
即普遍存在隐症带毒的现象ꎬ表明生物学鉴定必
须结合室内其它鉴定方法以提高检测结果的准
确性ꎮ
本研究中葫芦种子的带毒率在０ ~ １００％ 之
间ꎬ收获保存 １ 年后的传毒率在 ０ ~ ５􀆰 ６％之间ꎬ平
均为 １􀆰 ８６％ ꎬ与西瓜、甜瓜种子传毒率相差不大
(吴会杰等ꎬ２０１１)ꎮ 这些研究结果说明 ＣＧＭＭＶ
以种子表面带毒为主(吴会杰等ꎬ２０１１)ꎬ与种子带
毒率相比ꎬ传毒率要低得多ꎬ但有一定的稳定性ꎬ
与已有的研究结果一致(Ｙａｓｕｏ ｅｔ ａｌ. ꎬ１９７１ꎻＣｈｏｉꎬ
２００１ꎻ秦碧霞等ꎬ２００９)ꎮ 带毒率为 １０％的京欣砧
优￣２ 葫芦种子ꎬ其传毒率为 ０ꎬ可能是由于种子带
毒率低ꎬ种植的样品数量太少的原因造成ꎮ 不同
种子批传毒率的差异与种子带毒率有关ꎬ可能还
受寄主种类、品种、病毒株系的影响ꎬ此原因还需
要进一步研究ꎮ 不同的病毒感染方式、环境条件、
样品数量和检测方法可造成不同研究之间传毒率
的差异ꎬ实生苗不同部位的检测结果也存在差异ꎮ
本研究中ꎬＲＴ￣ＰＣＲ 方法检测实生苗时ꎬ２０ 株子叶
阳性植株中只有 １４ 株的真叶为阳性ꎬ将真叶阳性
的实生苗同一叶位混合ꎬ从 １ ~ ７ 叶位都能检测到
特异性条带ꎬ说明病毒在植株中的扩展是一个从
下到上的过程ꎬ但影响病毒在植株内扩展的条件
还有待进一步研究ꎮ
一般可采用化学和物理方法处理种子以钝化
病毒ꎮ 日本和韩国的经验表明ꎬ干热处理可以大
大减轻发病程度ꎬ甚至不发病ꎬ是钝化 ＣＧＭＭＶ 最
有效的方法(蔡明等ꎬ２０１０)ꎮ 本研究检测了 ５ 个
葫芦品种 ６ 个批次的种子ꎬ有 ４ 个批次的种子为
ＣＧＭＭＶ 阳性ꎬ干热处理后经实生苗结合 ＤＡＳ￣
ＥＬＩＳＡ检测ꎬ仅发现其中 １ 个批次种子出现 １ 株阳
性ꎬ说明 ７２℃ ７２ ｈ 的干热处理能有效钝化 ＣＧＭ￣
ＭＶꎬ对 ＣＧＭＭＶ 的防治效果显著ꎮ 干热处理会引
起种子的发芽率下降ꎬ对不同品种和同一品种在
不同生产条件下生产的种子影响不同(蔡明等ꎬ
２０１０ꎻ２０１１)ꎬ进一步的工作应该探索葫芦科作物
不同种类、同一种类不同品种有效的种子干热处
理条件及其对种子质量的影响ꎮ 经处理后的种子
需再经过实生苗检测ꎬ进一步确诊病毒的传染性ꎬ
同时还要进行种子质量的检测ꎬ使种子符合安全、
高质量的要求ꎮ ＣＧＭＭＶ 在葫芦上的隐症带毒现
象也是限制实生苗检测方法应用的一个瓶颈ꎬ必
６４８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
须结合室内其它鉴定方法以提高检测结果的准确
性ꎬ以确保生产上使用健康无毒的种子ꎮ
参 考 文 献 (Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ)
Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ＧＣ. １９３５. Ｍｏｓａｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｃｕｍｂｅｒ. Ａｎｎａｌｓ ｏｆ
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ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｊａｐａｎ ａｎｄ
Ｋｏｒｅａ. Ｐｌａｎｔ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅꎬ ２４(４): ６５ － ６８ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [蔡
明ꎬ 李明福ꎬ 江东. ２０１０. 日本、韩国黄瓜绿斑驳花叶病毒
发生及防控策略. 植物检疫ꎬ ２４(４): ６５ － ６８]
Ｃａｉ Ｍꎬ Ｊｉａｎｇ Ｄꎬ Ｚｈａｎｇ ＬＹꎬ Ｌｉ Ｊꎬ Ｚｈａｎｇ Ｋ. ２０１１. Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ＣＧＭ￣
ＭＶ ｓｅｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｐｌａｎｔ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅꎬ ２５ (１): ６２ － ６３ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ) [蔡明ꎬ 江冬ꎬ 张丽英ꎬ 李眷ꎬ 张昆. ２０１１. 黄瓜绿
斑驳花叶病毒种 子 处 理 试 验 研 究. 植 物 检 疫ꎬ ２５
(１): ６２ － ６３]
Ｃｈｅｎ Ｑꎬ Ｄｅｎｇ ＣＬꎬ Ｚｈａｎｇ ＹＪꎬ Ｌｉａｏ ＦＲꎬ Ｌｉｎ ＳＭꎬ Ｃｈｅｎ ＨＹꎬ Ｗａｎｇ
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ｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬ ＳＮ / Ｔ ２３４４ － ２００９. Ｂｅｉｊｉｎｇ: Ｃｈｉ￣
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ｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ￣ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ Ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ
ｃｏｗｐｅａ. Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ６４(７): ９５１ － ９５７
Ｄｅｎｇ ＣＬꎬ Ｈｕａｎｇ Ｆꎬ Ｌü ＹＦꎬ Ｚｈａｎｇ Ｋꎬ Ｇｕｏ ＹＬꎬ Ｚｈａｏ ＨＳ. ２００９.
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｒｅ￣
ｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ. Ｐｌａｎｔ Ｑｕａｒａｎ￣
ｔｉｎｅꎬ ２３(４): ２９ － ３１ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [邓从良ꎬ 黄峰ꎬ 吕玉峰ꎬ
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黄瓜绿斑驳花叶病毒. 植物检疫ꎬ ２３(４): ２９ － ３１]
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ｖｉｒｕｓ. Ｃｈｉｎａ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓꎬ ２７(９): ３４ － ３８ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [冯兰
香ꎬ 谢丙炎ꎬ 杨宇红ꎬ 冯东昕. ２００７. 检疫性黄瓜绿斑驳花
叶病毒的检测和防疫控制. 中国蔬菜ꎬ ２７(９): ３４ － ３８ ]
Ｈｏｌｌｉｎｇｓ Ｍꎬ Ｋｏｍｕｒｏ Ｙꎬ Ｔｏｃｈｉｈａｒａ Ｈ. １９７５. Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ. / / Ｓｕｒｒｅｙ Ｋ. Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ. Ｅｎｇ￣
ｌａｎｄ: ＣＭＩ. / ＡＡＢꎬ １５４: ４
Ｈｕａｎｇ Ｊꎬ Ｌｉａｏ ＦＲꎬ Ｌｉｎ ＳＭꎬ Ｃｈｅｎ Ｑ. ２００９. Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｏｆ ＩＣ￣ＲＴ￣
ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ
ｓｅｅｄ ｏｆ ｐｕｍｐｋｉｎ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ １１
(１): １２ － １５ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [黄静ꎬ 廖富荣ꎬ 林石明ꎬ 陈青.
２００９. 南瓜种子中黄瓜绿斑驳花叶病毒 ＩＣ￣ＲＴ￣ＰＣＲ 检测方
法的建立. 漳州职业技术学院学报ꎬ １１(１): １２ － １５]
Ｋｏｅｎｒａａｄｔ ＨＭＳꎬ Ｒｅｍｅｅｕｓ ＰＭ. ２０１４. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｑｕａｓｈ ｍｏｓａｉｃ
ｖｉｒｕｓꎬ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｍｅｌｏｎ ｎｅｃｒｏｔｉｃ
ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｕｃｕｒｂｉｔｓ. / / Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｅｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ.
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｅｄｉｎｇ Ｔｅｓｔｉｎｇ. Ａｎｎｅｘｅ ｔｏ Ｃｈａｐｔｅｒ ７:
Ｓｅｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ: Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｅｄ
Ｔｅｓｔｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ.
Ｋｉｍ ＤＨꎬ Ｌｅｅ ＪＭ. ２０００. Ｓｅｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ
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(责任编辑:高　 峰)
７４８５ 期 宋顺华等: 黄瓜绿斑驳花叶病毒在葫芦上的种传规律及热处理效果评价