全 文 ：BUL L I E TN O B FON T AI CL AR ESR E A CH
第 巧 卷
VOI
.
1 5
第 3期
N o
.
3
1 9 5年
J uy l
,
7 月
199 5
植物基因工程中 iR 质粒的研究与应用
刘伟华 徐香玲 姜 静 薛丽萍 李集临
R E S E A R C H A N D A P P L I C A T I O N O F R l
P L A S M I D I N P L A N T G E N E E N G I N E E R I N G
L i u W e i一 h u a X u X i a n g 一 1119 J ia n g J i n g X u e 不i一 P in g L i J i一 l in
〔摘 要〕 近几年来 , 植物基因工程取得 了很大进展 , 其主要原 因是人们采
取了有效的基因转移方法 。 例如载体法 ; 以 iT 质拉 , iR 质拉 , 某些病毒 , 脂质体
等做为载体 ; 非载体法有显微注射法 , 电击法 , 拉子枪法 , 花粉管通道法等 , 在以
上诸多方法中 , 以载体 iT 质拉的研究最为广泛 , 目前国内外对根癌农杆菌 iT 质粒
的研究与应用 已 日趋成熟 , 而发根农杆菌 iR 质拉是植物基因工程中的一种新的载
体 , 近几年来的研究表明 , iR 质拉与 iT 质拉具有相似的结构功能区 , iR 质粒以
其转化植物细胞的方便可行性和再生丰彭眯容易的特性 , 越来越显示出它在植物基因
工程中的应用前景 .
关键词 基因工程 ; iR 质拉
一 、 形 质粒的发现与分类
发根农杆菌是一种革兰氏阴性菌 , 它感染植物以后在伤口处形成不定根 , 该不定根除菌
后能迅速生长 , 并产生多个分枝 , 呈毛发状 , 称为毛状根 ( ha iyr or ot ) , 植物的这种病害称为毛根病 , iR c ke r ( 19 30 ) , 立石 (1 939 ) 〔” 在苹果树中发规了毛根病并证实发根农杆菌是
致病的原因 。 发根农杆菌中存在着能诱发植物产生毛状根的质粒 , 这种质粒被称为 iR 质粒
( r 0 0 t 一 i n d u e i n g p l a s m id ) 。 〔 2 0 〕
R i质粒上存在着冠瘦碱 ( 。 iP ne )合成酶基因 , 根据 iR 质粒所诱导产生的冠瘦碱种类的
不同 , 可将 iR 质粒分为三种类型 : 甘露碱型 、 黄瓜碱型和农杆碱型 。 〔 16 〕
冠您碱合成酶基因只在真核生物中表达 , 在转化细胞中特异合成冠瘦碱 , 因此冠瘦碱的
本文作者单位 : 哈尔滨 , 哈尔滨师范大学 ( H a r ib n N o r m a l U n iv e r s i ty , H a r b i n 15 0 0 80 ) .
姜静 , 哈师大在读研究生 .
199 5年 1 月收到本文 .
3期 刘伟华等 :植物基因工程中 i R质粒的研究与应用
有无可做为转化指标之一 。
表 Ii R质粒类型及其所产生的冠瘦碱类型
质 粒 ’ 类 型 冠 痪 碱
甘 露 碱 型 甘露碱 ( Man n opin e)
Mn n a oPin e一 y t p e甘露碱酸 ( Mn n a opin i a e ei d)
农杆碱酸 ( Agr opin i a e ei dn)
农杆碱 素 C ( Agr o ein opin eC)
黄 瓜 碱 型 黄瓜碱 (Cu eu m opin e)
Cu cu m oi Pn e一 y t p e
农 杆 碱 型 农杆碱 ( Agr oi pn e)
Agr oPin e一 ty p e农杆碱酸 ( Agr oPin i ea ei d)
甘露碱 ( Man n opin e)
甘露碱酸 ( Mn an opin i a e ei d)
农杆碱素 A( Agr o ein opin eA:
二 、 形 质粒转化植物细胞的机理
具 i R质粒的发根农杆菌对植物
细胞的转化是通过 i R质粒上的转移
区 (T一 D N) A和致病 区 ( Vir)
来实现的 。 农杆碱型 i R质粒 T一
D N A乡伪 T L一 D N A及 T R一 D N A两个区 , 如图 l 〔 9 〕 。
T L 一 D N A 大 小 在 19一加 k b
之间 , 存在与根的形 态 发生 有关
的 4 个位点 ( r o l A , B , C , D )
w h i t e 〔 2 1 〕 发现当没有 几 区存
在时 , T L 区仍然可 以转化产生毛
根 。 e o s t a n t i o n 〔 14 〕 等人的研
究表明 : r o l A , r o 1 C 和 r o 1 B 共
同感染烟草时 , 再生植株在无激素培养基上可大量生根 。 而在 C a p o ne 的研究中单个 r ol B
转化胡罗 卜块根 , 当满足外源激素和 or l B 5’ 端有一个 1 . ZK b 延长区的情况下就可以实现
〔 12 〕 。 可见 T L区的 4 个与发根有关的位点中 , or 1 B 最为重要 。
O :ir 复制起始区域
几 , T R: 向植物基因组 D N A 重组的区域
Vi :r 与 T 一 D N A 的切除机向
植物细胞的运输有关
a g s : A g r o p in e 合成酶基因
a g c : A g r o p i n e 分解酶基因
p R IA 4 b K ph l 酶切图谱
几一 D N A 上有两个非常重要的基因是生长素合成基因 t m s l 和 tm s Z , 它们指导 I A A ( 叫朵乙酸 ) 的合成 , 单独的几一 D NA 可以转化植物 , 但却表现出对张素的依赖性 〔 10 〕 。 T L一 D N A 和 T R 一 D N A 共同作用时 , 转化能力大大高于两者的单独作用 , 表明它们可以协同
作用 〔 7 〕 。
甘露碱型和黄瓜碱型 iR 质粒的 T 一 D N A 是连续的 , 但有与农杆碱型 iR 质粒几一
D N A 高度同源的片段 , 其转化机制与 T L一 D N A 相似 。
3 8 8植 物 研 究 巧卷
此外 R i质粒存在着与 i T质粒结构 、 功能相似的 V i r区 , Vi r 区位于复制起点与 T 区之
间 , 三种类型的 iR 质粒具有很高的保守性 。 iV r 区基因并不发生转移 , 但它对 T 一 D N A
的转移起着十分重要的作用 , Vi r 区基因群由 Vi r, A, iV r , B … iV r G 联合组成 , 当发根农杆
菌感染植物时 , 被损伤的植物细胞合成特殊的低分子化合物乙酞丁香酮 , 在 Vi r A 基因产物
介导下 , 使其他联合基因活化 , 从而使感染获得成功 。 不感染 iR 质粒的单子叶植物可能缺
乏这种低分子化合物 〔 1, 18 〕 。 vi : A和 vi : G基因对其他联合基 因有启动与调节的作
用 , V i r D 基因能将 T 一 D N A 25b p 重复序列切断 , 使 T 一 D N A 转移 , 其他基因作用尚
不十分明确 , 可能与寄生性有关 〔 4 〕 。
三 、 形 质粒介导的基因转移方法
iR 质粒介导的外源基因的转移分三大步骤 : 首先将目的基因通过中间载体或二元载体
导人发根农杆菌中 , 然后再将携带目的基因的发根农杆菌感染植物的不同外植体 , 并诱导出
再生植株 。 第三步对诱导产生的再生植株进行检测 , 从而确定为转基因植株 。
1
、 目的基因导人具 iR 质粒的发根农杆菌中
由于 iR 质粒的 T 一 D N A 无 o nc 的基因 , 不影响植株再生 , 因此野生型发根农杆菌可
直接用作中间载体的受体 , 此为中间载体法 。 二元载体法则是利用 iV r 区与 T 一 D N A 区分
别构建两个独立的复制子 , 通过 vi r 区的作用 P iR 及 P iT 的 T 一 D N A 发生转移 。
2
、 携带 目的基因的菌株对植物进行感染
可通过直接注射菌或造成伤 口后与菌液共培养法 , 对植物不同的外植体 , 例如叶片 、 胚
轴 、 子叶节 、 未成熟胚进行感染实验 , 经目的菌株感染后的外植体 , 经过一定的诱导培养 ,
可以产生毛状根 , 由毛状根再生植株 , 或产生不定芽 、 愈伤组织 , 经器官发生途径再生出完
整植株 。
3
、 再生植株的检测
转化的再生植株往往表现出叶皱缩 、 节间短 、 植株矮化 、 不定根多 、 早熟等特征 , 通过
对再生植株做进一步检测 , 如 P C R 扩增 、 血清免疫法及分子杂交 , 从而确定为转基因植
株 。
四 、 形 质粒在植物基因工程中的应用
国外学者对 iR 质粒的研究与利用较为广泛 , 如 c o m ia 等 〔 13 〕 通过对发根农杆菌的遗
传操纵 , 得到耐甘麟的烟草植株 。
中间载体法导人牛角花植株中。
s t o n g a a r d 〔 19 〕 等将嵌和大豆血红蛋白基因通过 R i 质粒
M o r g a n 和 R o b a g l i a 〔 15 , 17 〕
分别得到抗卡那霉素的转化蕃茄和烟草植株 , 据张毅报导 ,
等也利用 R i质粒作中间载体
Sh a h i n ( 19 86 )
,
T r u l s o n ( 1986 )
S u劝 a iP n d a (19 87 ) 分别利用 R i质粒的二元栽体法 , 获得蕃茄 、 黄瓜 、 首蓓的转化植
。
M u l l e r ( 1987 )
, 向烟草引人了卡那霉素抗性基因 。 V a n s l u g s 等也利用二元载体法向扛(
和株
南芥转人了玉米可移动因子一激活子 。
国内对这方面的研究工作还很少 , 何玉科等用发根农杆菌对甘蓝进行了车专化实验
, 并沁
转化体的特征进行了讨论 〔 3从 徐香玲等利用 iR 质粒介导 , 将 c M V, T M v 外壳蛋白基因
3期 刘伟华等 :植物基因工程中 i R质粒的研究与应用 39 8
分别导人蕃茄 、 大豆和烟草中 〔待发〕 。 总之 , 在植物基因工程中应用 iR 质粒有很多优
点 , 如可作为中间载体的受体 , 转化植物容易再生植株 , 而且再生植株常表现为纯合 、 矮
化 、 早熟 、 抗逆性强等优良特性 。
五 、 展 望
iR 质粒不仅可以做为植物基因工程的新载体 , 而且在其他领域也可广泛地利用 :
( l) 在制药工业方面 : 药用植物人药部位大多为根 、 利用具 iR 质粒的发根农杆菌感染
药用植物可以建立发根培养系 , 使其次生代谢产物得以工业化生产 。 在 日本 , 成功的例子有
人参皂贰 、 黄连素 、 黄柏素的生产等 。 在国内、 王毅 、 刘伟华 、 张荫麟等分别对甘草 、 龙
胆 、 赛食若进行了转化实验 , 其转化根不仅生长速度快 , 而且其中的药用成分均比一般组培
根及野外采集根的药用成分高 〔 l,2 ,3 〕 。
( 2) 在食品工业方面 : 可以利用发根农杆菌转化建立的发根培养系生产某些香料 、 色
素 、 调味品等 。
( 3) 在林木繁育方面 : 利用 R i质粒促进植物生根的特性 , 使某些扦插困难的木本植
物 、 裸子植物如苹果 、 桃 、 杉等快速生根 , 并提高其成活率 。
总之 , iR 质粒的发现 、 研究和应用不仅做为一种新的载体 , 促进植物基因工程的迅速
发展 , 在其他领域也越来越显示出广泛的利用前景 。
C h ar ac t e r o f iR 一 P l a s m id
,
m o l e e u lar m e e h a n i s m
,
a n d a P P l i e a t i o n i n P l a n t g e n e
en g ien e r i雌 w i th R i一 p la sm id a s a n e w v e e t o r o f u s i n g t o t r a n s fo r m p l a n t C .el l , t h e
m et h od o f R i一 P l a s m id一 m e d i a t e d g e n e t r an s fe r o f P l a n t w e r e d e s e r ib e d
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伴 r s P e e t i v e s fo r aP P l i e a t i o n o f gA r o b ac t e r i u m r h i z o g e n e s i n t h e o t h e r if e ld s s u e h a s
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w o o d b r e e d i n g a n d P r o l i fe r a t i o n w e r e
in t r o d u C e d in t h i s 托 v i e w .
K e y w o r ds G e en
e gn ien e ir n g : R i一 P la sm id
参 考 文 献
( 门 王毅等 , 19 卜哈尔滨师范大学自然科学学报 , 7 : 79 一 89
〔 2 〕 刘伟华等 , 1992: 遗传 , 5 : 2 7一 29 。
( 3 〕 何玉科 , 19 0: 西北植物学报 . 10 ( l拓l一 66 .
( 4 〕 李集临等 : 生物工程进展 , 1993 : 1 3 (2 ) : 8一 14 .
〔5 〕 张荫肠: 1988: 植物学报 , 30 (4 ): 368一 372 .
( 6 〕 张毅等 : 生物工程进展 , 19 89 : 5 (3 ) : 17 3一 178 .
〔 7 〕 秦明波等 : 生物工程进展 , 1993 : 13 (4 ) : 4 1一 4 4 .
( 8 〕 立石 : 日植病报 , 19 39 : 9 (3 ) : 18 0 一 183 .
〔 9 〕 镶田博等 : 发醉七工业 , 198 7 :4 5 (9 ) : 865一 87 3 .
植 物 研 究 5 1卷
〔 10〕 B e r“ t e址 . J eta l : 1987 : N a tu r e, 252 : 169 一 17 0 .
〔 1 1 〕 B o l t o n . G . V e t a l : eS i e n e e 1 98 6: 2 32: 983 一 98 5 .
〔 1 2 〕 C a因n e . 1 e t a l: 1989 : M o l G e n . G e n e t 2 16 : 2 39一 24 4 .
( 1 3 〕 C o m ia . L . e t a l : 1985 : N a t u r e , 317 : 7 4 1一 74 .
〔 1 4 〕 C o s tan t in o ` P e t a l : 198 4 : J . M o l . A P P I. G e n e t Z: 肠 5一 4 7 0 .
( 1 5 〕 M o r ga n . A . J e t a l: 1987 : P lan t cS i , 49 : 3 7一 4 9 .
〔 1 6 〕 P e t it A . e t a l : 19 86 : M o l . G e n . G e n e t . 202: 388一 393 .
〔 1 7 〕 R o ba g lia . C . e t a l : 1987 : B i oc h i m i e , 69: 2 3 1一 2 37 .
〔 18 〕 S t a ch e l . 5 . E . e t a l: 1985 : N a tu r e 3 18: 62 4 一 629 .
〔 19 〕 s t o u g a r d · J · J · e t a l : 1987: M o l · G e n · 乒e n e t , 2 07: 25 1一 255 ·
〔 20 〕 W h it e . F . F . e t a l : 1980 : J . B a e te ir o l . 14: 1134一 1 14 1 .
〔 2 1 〕 W h it e . F . F . e t a l : 1985 : J . B a c te r i o l . 164 : 33一 4 .